不同基本培养基和激素对籼稻成熟胚愈伤组织诱导的影响

不同基本培养基和激素对籼稻成熟胚愈伤组织诱导的影响 摘要：以川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ和ⅱ－３２ｂ ４种籼稻的成熟胚为外植体，研究ｍｓ、ｎ６、ｎｂ和ｎｍｂ ４种基本培养基，２，４－ｄ与ｋｔ或６－ｂａ联合使用对籼稻愈伤组织诱导的影响。结果表明，４种籼稻在ｎｍｂ基本培养基中愈伤组织的诱导率最高，平均诱导率为７７.00％～９６.00％，其中在ｎｍｂ中的诱导效果最好，在４种不同基本培养基中愈伤组织总平均诱导率的高低顺序依次为川香２９ｂ、中９ｂ、ⅱ－３２ｂ、金２３ｂ。当３．０ ｍｇ／ｌ ２，４－ｄ与不同浓度的ｋｔ或６－ｂａ联合使用时，ｋｔ浓度为０．１ ｍｇ／ｌ时，川香２９ｂ和中９ｂ愈伤组织诱导率高；对于ⅱ－３２ｂ，ｋｔ浓度为０．６ ｍｇ／ｌ愈伤组织诱导率较高；６－ｂａ浓度为０．４ ｍｇ／ｌ时，川香２９ｂ愈伤组织诱导率最高；对于中９ｂ和ⅱ－３２ｂ，添加０．１ ｍｇ／ｌ的６－ｂａ最有利于愈伤组织的诱导；而对于金２３ｂ，无论是添加ｋｔ或６－ｂａ都会抑制愈伤组织的诱导。 关键词：籼稻；愈伤组织诱导；培养基；激素 ａｂｓｔｒａｃｔ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉum（ｍｓ，ｎ６，ｎｂ ａｎｄ ｎｍｂ） ａｎｄ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｐｈｙｔｏｋｉｎｉｎ（ｋｔ，６－ｂａ） ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ ｖａｒ ｉｅｔｉｅｓ（ｃｈｕａｎｘｉａｎｇ２９ｂ， ｚｈｏｎｇ９ｂ， ｊｉｎ２３ｂ， ⅱ－３２ｂ） ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ｎｍｂ ａｓ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ７７.00％ ｔｏ ９６.00％． ｔｈｅ ｏｒｄｅｒ ｏｆ ａｖｅｒａｇｅ ｒａｔｅ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ ｔｏ ｌｏｗ ｗａｓ ｃｈｕａｎｘｉａｎｇ２９ｂ， ｚｈｏｎｇ９ｂ， ⅱ－３２ｂ， ｊｉｎ２３ｂ． ｗｈｅｎ ３ ｍｇ／ｌ ２， ４－ｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｗｉｔｈ ０．１ ｍｇ／ｌ ｋｔ ｏｒ ０．４ ｍｇ／ｌ ６－ｂａ， ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｈｕａｎｇｘｉａｎｇ２９ｂ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． ｆｏｒ ｚｈｏｎｇ９ｂ， ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３ ｍｇ／ｌ ２， ４－ｄ ｗｉｔｈ ０．１ ｍｇ／ｌ ｋｔ ｏｒ ０．１ ｍｇ／ｌ ６－ｂａ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｕｍ． ｆｏｒⅱ－３２ｂ， ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ３ ｍｇ／ｌ ２， ４－ｄ ｗｉｔｈ ０．６ ｍｇ／ｌ ｋｔ ｏｒ ０．１ ｍｇ／ｌ ６－ｂａ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｕｍ． ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｊｉｎ２３ｂ ｗｏｕｌｄ be ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｅｉｔｈｅｒ ６－ｂａ ｏｒ ｋｔ． ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｉｎｄｉｃａ ｒｉｃｅ； ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ； ｂａｓａｌ ｍｅｄｉum； ｐｈｙｔｏｋｉｎｉｎ 农杆菌介导的高效遗传转化体系已经在水稻外源基因转化中取得了很大的成功［１－３］，利用该技术不仅可以把感兴趣的基因导入到水稻基因组中，进而培育优质、高产、多抗的水稻新品种［４，５］，而且也为水稻基因功能研究提供重要手段，如通过ｔ－ｄｎａ插入构建突变体库、基因打靶等［６，７］。水稻胚性愈伤组织是农杆菌介导外源基因进行遗传转化的良好受体，因此水稻愈伤组织的形成和状态是直接影响着水稻遗传转化效率的重要因素。 籼稻和粳稻是栽培稻的两个主要亚种，粳稻的组织培养技术已经成熟，愈伤组织诱导容易，诱导出来的愈伤组织是胚性愈伤组织，生长速度快，再生率高，并且许多粳稻品种已建立了基于愈伤组织的重复性好、转化频率高的遗传转化体系［８，９］。而栽培面积占全球水稻８０％的籼稻却具有不良的组织培养特性，其诱导率和再生率都比粳稻低得多，后续继代过程中容易褐化，且不同品种籼稻之间组织培养特性差别很大［１０，１１］，使得籼稻遗传转化效率低，甚至难以进行转化，这样极大地阻碍了籼稻遗传转化的发展。 水稻成熟胚由于具有取材容易、不受季节限制、操作简单等优点 是获得愈伤组织较好的外植体。籼稻成熟胚愈伤组织诱导率和质量除与基因型及外植体有关外，外源激素浓度、培养基成分也是重要的影响因素。一些研究表明在籼稻愈伤组织诱导中适当改变培养基成分、调节外源激素浓度及其配比等可以在一定程度上提高愈伤组织诱导率和质量［１２－１４］。因此，研究４种不同基本培养基、不同浓度的ｋｔ、６－ｂａ对川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ、ⅱ－３２ｂ ４种常用的籼型杂交水稻保持系成熟胚愈伤组织诱导的影响，以期提高籼稻愈伤组织的诱导率和质量，筛选出组织培养特性较好的籼稻品种，为籼稻基因工程和分子育种研究的进一步发展打下一定基础。 １ 材料与方法 １．１ 材料 籼稻保持系中９ｂ、金２３ｂ、ⅱ－３２ｂ和川香２９ｂ种子由南昌大学江西省分子生物学基因工程重点实验室提供。化学试剂均为国产分析纯，试验所用激素为ｓｉｇｍａ公司产品。 １．２ 方法 １．２．１ 基本培养基的组分与含量 以ｍｓ、ｎ６、ｎｂ和ｎｍｂ作为籼稻愈伤组织诱导的４种基本培养基，组分与含量见表１，配制完成后灭菌，倒入已灭菌的培养皿中备用。 １．２．２ 含不同浓度ｋｔ和６－ｂａ的诱导培养基的配制 以ｍｓ为基本培养基，加入3.0 ｍｇ／ｌ 2，4-d以及ｋｔ或６－ｂ ａ，使kt或６－ｂａ最终浓度分别为０、０．１、０．２、０．４和０．６ ｍｇ／ｌ，灭菌后倒入已灭菌的培养皿中备用。 １．２．３ 种子的灭菌与接种 选取饱满成熟的种子，剥去颖壳后，先用体积分数７０％的乙醇浸泡种子１ ｍｉｎ，用１ ｇ／ｌ ｈｇｃｌ２消毒５ ｍｉｎ，再用有效氯为３％的次氯酸钠溶液消毒３０ ｍｉｎ，期间摇动数次，然后用无菌水洗涤５遍。将洗好的种子放在铺有无菌滤纸的培养皿中晾干，然后将灭菌的种子接种于相应的培养基上，每种处理接种５０粒种子，每种处理重复３次，放入人工气候室中在２６ ℃暗培养。 １．２．４ 数据处理与统计分析 ２０ ｄ后记录愈伤组织的诱导率与状态。所有试验数据均用ｅｘｃｅｌ ２００７和ｓｐｓｓ １７．０软件进行处理，对不同处理的诱导率分别进行单因素方差分析（ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎｏｖａ）和显著性测验。诱导率＝［产生愈伤组织的种胚数∕接种的种胚数］×１００％。 ２ 结果与分析 ２．１ 不同基本培养基对籼稻愈伤组织诱导的影响 在水稻组织培养中，应用的基本培养基有ｍｓ、ｎ６、ｂ５、ｃｃ以及改良的组合培养基，如ｎｂ、ｍｂ、ｎｍｂ等［１５，１６］。研究采用了ｍｓ、ｎ６、ｎｂ、ｎｍｂ ４种基本培养基对川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ和ⅱ－３２ｂ ４种籼稻杂交水稻保持系成熟胚进行愈伤组织诱导，３～４ ｄ后开始发芽，一周后盾片上 开始有愈伤组织生长，１０ ｄ后拔掉长出的芽。２０ ｄ后统计愈伤组织诱导率和状态，结果如表2所示。 从表２和图１可知，川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ和ⅱ－３２ｂ的成熟胚在４种基本培养基上的愈伤组织诱导率不同，在ｎｍｂ基本培养基上愈伤组织诱导率最高，平均诱导率为７７.00％～９６.00％，并且诱导出来的愈伤组织状态比较好，说明ｎｍｂ基本培养基成分比较适合用于这４种籼稻愈伤组织的诱导，ｎｍｂ基本培养基是由ｎ６大量元素、ｍｓ微量元素和ｂ５维生素等组成，这种组合在一定程度上改善了４种籼稻的组织培养效果。４种籼稻在ｎ６基本培养基中虽然也具有较高的诱导率，但是川香２９ｂ、金２３ｂ、ⅱ－３２ｂ这３个籼稻品种诱导出来的愈伤组织的状态不佳，颜色呈乳白色，愈伤组织呈大块或疏松状，在后续的继代中生长速度慢；在４种基本培养基中，川香２９ｂ的诱导率较高，且在后续的继代中不容易褐化，分化率较高，其次为中９ｂ、ⅱ－３２ｂ，而金２３ｂ愈伤组织诱导率较低。 ２．２ 添加不同浓度的ｋｔ对籼稻愈伤组织诱导的影响 将川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ和ⅱ－３２ｂ ４种籼稻的成熟胚分别接种到以ｍｓ作为基本培养基并含有不同浓度ｋｔ的诱导培养基中。２０ ｄ后统计愈伤组织诱导率，结果如表３所示。 从表３可知，川香２９ｂ和中９ｂ在ｋｔ浓度为０．１ ｍｇ／ｌ时愈伤组织诱导率最高，而后随着ｋｔ浓度进一步升高愈伤组织诱 导率呈下降趋势，ｋｔ浓度为０．４ ｍｇ／ｌ以上时，川香２９ｂ和中９ｂ两个籼稻品种的愈伤组织诱导率下降显著，而对于金２３ｂ，在ｋｔ浓度为低浓度０．１ ｍｇ／ｌ时，愈伤组织诱导率显著下降，说明ｋｔ可能会抑制金２３ｂ愈伤组织的形成。对于ⅱ－３２ｂ，在试验的ｋｔ浓度范围内，增加ｋｔ浓度对愈伤组织诱导率的影响不显著，在ｋｔ浓度为０．６ ｍｇ／ｌ愈伤组织诱导率较高。总的来说，ｋｔ对不同的籼稻品种的成熟胚诱导愈伤组织的作用效果不同。 ２．３ 添加不同浓度的６－ｂａ对籼稻愈伤组织诱导的影响 将川香２９ｂ、中９ｂ、金２３ｂ和ⅱ－３２ｂ ４种籼稻种子分别接种到以ｍｓ为基本培养基并含有不同浓度６－ｂａ的诱导培养基中。２０ ｄ后统计愈伤组织诱导率，结果如表４所示。 从表４可知，对于川香２９ｂ，添加了６－ｂａ后愈伤组织诱导率有一定的提高，其中添加了０．４ ｍｇ／ｌ ６－ｂａ的愈伤组织的诱导率最高，平均值为８９．６０％，与对照（不添加６－ｂａ）相比差异达到显著水平。对于ⅱ－３２ｂ，添加了６－ｂａ后愈伤组织诱导率有显著的提高，其中６－ｂａ浓度为０．１ ｍｇ／ｌ时，其愈伤组织诱导率最高，随着６－ｂａ浓度的增高，对ⅱ－３２ｂ成熟胚愈伤组织诱导率影响不大。对于中９ｂ，６－ｂａ浓度为０．１、０．２ ｍｇ／ｌ时愈伤组织诱导率最高，随着６－ｂａ浓度进一步增高，其愈伤组织诱导率呈下降趋势。而对于金