双向电泳实验蛋白质样品制备要点

双向电泳实验蛋白质样品制备要点

双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。

一、血清样本的制备

血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：

①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。

②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。

③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。

④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。

⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。

⑥以大约6500×g离心5分钟。

⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。

⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。

二、组织和细胞样本的制备

裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。

1. 破碎细胞的方法

细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。此外，在Tris碱、碳酸钠或碱性载体两性电解质存在的条件下，蛋白酶能被有效抑制。若此时仍用一些蛋白酶保持活性，应当使用蛋白酶抑制剂，特别是复合使用蛋白酶抑制剂。

一些温和的裂解方法包括：渗透裂解，冻融裂解，去污剂裂解和酶裂解；而一些强烈的裂解方法包括：超声裂解法，高压法，机械匀浆法，研磨法和滚珠粉碎法。

2. 蛋白裂解液的初步分离

临床蛋白质组面对的最大挑战主要包括样品中蛋白质丰度巨大的动态范围和跨度较大的蛋白质属性（包括分子量、等电点、疏水性和转录后修饰等等）。因此双向电泳结果图中布满斑点，使结果解释非常困难，同时低丰度蛋白会被掩盖，分辨率降低。因此在分析前降低样品复杂性可以提高双向电泳对低丰度蛋白定量分析的灵敏度。

3. 蛋白质沉淀

这一步骤主要是用来除去样品中的污染杂质（如盐、去污剂、核酸和脂类等），以免对电泳结果产生影响，同时还能浓缩样本，但可能会改变样本蛋白成分。可以选用的沉淀方法有：硫酸铵沉淀法，TCA（三氯乙酸）沉淀法，丙酮沉淀法，在丙酮溶液中的TCA 沉淀，石炭酸萃取后采用乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。

4. 离心沉淀的再溶解

推荐使用含8mol/L尿素的消化溶液。

5. 除去污染物

双向电泳中，等电聚焦电泳对低分子量的离子型杂质特别敏感。同时样本中的非蛋白质杂质能干扰电泳分离和随后的电泳结果显影，所以，在样本制备的过程中，须除去这些杂质。这些杂质具体包括盐类、带电小分子、白蛋白和IgG、脂类、多糖等等。

6.样本制备溶液的组成

样本溶液中必须含有某些成分，以确保在进行等电聚焦前，样本能完全溶解和变性，这是为了得到良好聚焦的等电聚焦。样本溶液往往包括尿素以及一种或多种去污剂。完全变性确保了每一种蛋白质都保持一种构型，能得到最高分辨率和清晰的电泳图，避免了蛋白质集聚和分子间相互作用的发生。

①变性剂：尿素是一种中性的促溶剂，在等电聚焦中用作变性剂。使用硫脲能提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白。

②去污剂：为了确保样本的完全溶解，防止通过疏水作用而使蛋白质集聚，在样品溶液中往往包含非离子或两性离子去污剂。2%的CHAPS效果较理想，若仍不能完全溶解可使用阴离子去污剂SDS。但SDS会与蛋白质形成复合物并带有负电荷，所以不能在这里唯一使用。

③还原剂：为打断二硫键而再样本溶液中加入还原剂，DTT（二硫苏糖醇）和DTE （二硫赤酰糖醇）较为常用。

④增溶剂：载体两性电解质或IPG缓冲液，它们通过电荷间相互作用减少蛋白质集聚，增加蛋白质溶解性，有时需要创造一种碱性条件，可使用缓冲液或碱性液。但是引入离子成分会影响等电聚焦结果，应在等电聚焦前将缓冲液或碱性也稀释至<5mmol/L。

7.蛋白质样本的定量

用于样品制备和溶解的许多试剂都与常用的蛋白质测定方法不相容，可与传统分光光度法依靠的考马斯亮蓝结合而产生干扰，因此需要使用双向电泳蛋白质定量试剂盒。

①制备工作比色剂，即将100分比色剂A与1份比色剂B混合，每次测定需要1mL 工作比色剂。

②用2mg/mL浓度的BSA标准溶液制备标准曲线。

③制备含1至50μL待测样本的微型离心管，一式两份，每个微离心管中加入500μL 沉淀剂，室温振荡2至3分钟。

④加入500μL辅助沉淀剂，离心（至少10000×g离心力）5分钟。

⑤弃去上清液，再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量称管吸取残余的上清液。

⑥每个管中加入100μL铜溶液和400μL去离子水，振荡使沉淀蛋白质完全溶解。

⑦每个管中加入1mL工作比色剂，应确保最快的速度加入，使之与样本立即相混

室温下孵育15至20分钟。

⑧用分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。

⑨根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，绘制标准曲线。

⑩将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。