双向电泳实验蛋白质样品制备要点
蛋白质双向电泳、western blot原理、方法、应用
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标： • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积 体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； • 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、 多糖和核酸等物质的去除； • 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充 分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量 域。典型代表是尿素和硫尿。 • 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏 水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的 去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 • 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已 变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还 原。
什么是蛋白质印迹法 ？
• Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化 技术及分子亲和技术三者融为一体的综合 性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带 并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、 酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合 了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感 性和特异性，是一种能用于分析样本组分 的免疫学测定的方法。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1× 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 • 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。
双向电泳的样品制备1
第二部分 等电聚焦
• • • • IEF胶条 等电聚焦电泳仪 加样 等电聚焦
The 1st D: Isoelectric Focusing
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10+Fra bibliotekpH 3 pH 7.5
–
pH 10
+
pH 3 pH 7.5
–
pH 10
ReadyStrip™ IPG 胶条
起载体作用的两性电解质
即便在变性剂和去垢剂存在的情况下，某些蛋白 质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解 状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉 淀。 两性电解质的作用在于捕获样品中的少量盐分， 从而保证蛋白质的溶解性。 应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。 浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证 实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时， 也应使两性电解质的pH值与之相符合。
2、根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解 能力的蛋白溶解液进行顺序抽提，从而分离出具有 不同溶解度范围的蛋白质组亚群。 一般分3个层次： 第一步用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白； 第二步是把未溶解的小片（pellet）用常规IEF样品 液（8Ｍ尿素＋4%CHAPS＋DTT）溶解，这次抽 提剩下的小片主要是富集的膜蛋白，约占整个样品 的11%（W/W）； 第三步是用增强的蛋白溶解液5M尿素＋2M硫脲＋ 2%CHAPS＋2%SB3-10＋2MTBP作最后的抽提。
表面活性剂 经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种 表面活性剂来溶解疏水基团。 常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。SDS作用后 不利于稳定IEF中的等电点，不宜存在于IEF的样品溶解液中； 只有后两类表面活性剂是可用的，其中CHAPS和SB3-10最好。 常用浓度为在8M尿素溶液中含2-5%的CHAPS，但在含高浓 度硫脲的溶液中其作用有限；SB3-10是一种含有长线性基团尾 端的两性去污剂，其作用要强于CHAPS，但在尿素浓度大于5M 时不溶解。
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析操作步骤:1.样品准备:将待测蛋白质混合物进行样品处理，如蛋白质提取、浓缩和去污等步骤，以获得高纯度、高浓度的样品。
2.第一维电泳:将样品加载到等电点聚焦凝胶中。
等电点聚焦是根据蛋白质的等电点进行分离的方法，即根据蛋白质电荷差异使其定位到等电点位置。
通常使用毛细管等电点聚焦，具体操作步骤是：将样品注入到毛细管中，两端分别连接正负电极，施加电压使得蛋白质开始迁移，直到在等电点位置停止。
这个阶段的电流较低。
3. 第一维凝胶电泳结束后，可使用pH梯度(pH gradient)的凝胶电泳或两种缓冲液浸泡在两边以建立静电场将蛋白质进一步扩散。
4.第二维电泳:将第一维电泳分离得到的凝胶嵌入到另一种凝胶中进行第二次电泳。
通常使用SDS-凝胶。
该凝胶使用离子溶液降解电荷，所有的蛋白质都将带有同样的电荷。
这个阶段的电流较高。
5. 染色和图像分析: 电泳结束后，可以用染色剂进行染色，如Coomassie蓝染色或银染色。
然后使用透射扫描或数字图像分析仪，获取电泳凝胶的图像，并进行质谱分析。
解析与解释:1.蛋白质双向凝胶电泳可以提供更高的分辨率和更好的分离效果，因为它结合了等电点聚焦和SDS-的优势。
2.在等电点聚焦过程中，蛋白质根据其等电点的差异而聚集在凝胶中的不同位置。
这一步骤可以将样品分离成多个窄条带，每个窄条带包含具有相似等电点的蛋白质。
3.在第二维电泳中，蛋白质将根据其分子质量而进一步分离。
较小分子量的蛋白质可以迁移到更远的位置，而较大分子量的蛋白质则停留在较近的位置。
4.通过染色和图像分析，可以将电泳凝胶的图像数字化并用于质谱分析。
这将帮助确定每个蛋白质的分子质量和相对丰度。
蛋白质双向凝胶电泳是一种非常有价值的蛋白质分析方法，尤其适用于分析复杂的混合物。
通过合理的操作步骤和解析方法，可以获得高质量的实验结果。
这些结果对于了解蛋白质的功能和相互作用，以及发现新的生物标志物具有重要的意义。
蛋白质双向电泳及质谱技术
– 蛋白沉淀法 – DNase/RNase处理 – 超声(机械破坏)、超高速离心 – DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)
其他杂质的去除
• 脂质
– 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI – 丙酮沉淀
• 多糖
– 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 – TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH
平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪 器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合
凝胶的图像处理分析
典型流程
• 凝胶图像的扫描 • 图像加工 • 斑点检测和定量 • 凝胶配比 • 数据分析 • 数据呈递和解释 • 2-DE数据库的建立
2-DE 分离的可溶性 E. coli 蛋白
目前双向电泳需解决的问题
• 胺基黑染色
– 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 – 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色
• 银染
– 可减少胶内蛋白质产量 – 对某些种类的蛋白质染色效果差 – 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响
银染色
50% 甲醇 25% 乙酸 4h
ddH2O 洗3次 30min/次
0.004% DTT 溶液 30min
两亲性电 解液浓度
(w/v) 40% 40% 40% 40% 40% 40% 40% 20%
样品溶液 样品溶液
体积
体积
(/5ml) (/5ml)
25l 250 l
12.5 l 125 l
12.5 l 125 l
25 l 250 l
12.5 l 125 l
25 l 250 l
12.5 l 125 l
– 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。
双向电泳的全套实验步骤及其注意事项
双向电泳的全套实验步骤及其注意事项本手册向您提供双向电泳实验过程中从样品制备、IEF电泳、胶条平衡、SDS-PAGE、凝胶染色脱色、胶内蛋白质点的切取、胶内胰酶消化以及质谱样品的制备等全部实验步骤，为您的实验提供全流程的帮助。
细胞样品的一般处理步骤1. 吸出培养液，用胰酶消化或细胞刮子收获细胞。
2. 加入PBS溶液，1500ｇ离心10分钟，弃上清。
重复3次。
3. 加入5倍体积裂解液，或按1×106细胞悬于60～100ｕｌ裂解液中混匀。
4. 液氮中反复冻融3次。
5. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。
6. 15,000转，4℃离心15分钟。
7. 收集上清，分装分装后冻存于－70℃。
组织样品的一般处理步骤1. 碾钵碾磨组织，碾至粉末状。
2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。
3. 加50ug/ml RNase及200ug/ml DNase，在4℃放置15分钟。
4. 15,000转，4℃离心20分钟。
5. 收集上清，分装后冻存于－70℃。
双向电泳中溶液配制水化上样缓冲液（I）：尿素8M 4.805gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（II）：尿素7M 4.2g硫脲2M 1.52gCHAPS 4% 0.4gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
水化上样缓冲液（III）：尿素5M 3.0g硫脲2M 1.52gCHAPS 2% 0.2gSB 3-10 2% 0.2gDTT 65mM 0.098g（现加）Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40%）（现加）溴酚蓝0.001% 10μl（1% 溴酚蓝）MilliQ水定容至10ml；分装成10小管，每小管1ml，-20℃冰箱保存。
双向电泳步骤
以下是双向电泳的步骤：
1.从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品充分混匀。
2.从冰箱中取-20°c冷冻保存的ipg预制胶条（17cm ph4-7），室温
中放置10分钟。
3.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品，在槽两
端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡，否则影响到胶条中蛋白质的分布。
4.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子
轻轻的去除预制ipg胶条上的保护层。
5.分清胶条的正负极，轻轻地将ipg胶条胶面朝下置于聚焦盘或水
化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。
6.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸
发。
7.对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序，聚焦结束的胶条
应立即进行平衡、第二向sds-page电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20°c冰箱保存。
双向电泳操作步骤蛋白质技术
双向电泳操作步骤-蛋白质技术水化上样(被动上样)1 .从冰箱中取出IPG胶条，室温放置IOmin o2 .沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各Icm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。
注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。
3 .用银子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。
注意：碱性端较脆弱,应小心操作。
4 .将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。
注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。
如产生了气泡，用镜子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。
5 .放置30~45min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油,每根胶条约3m1(17cmIPG),防止胶条水化过程中液体蒸发。
6 .置等电聚焦仪于-20。
C水化11〜15h。
第一向等电聚焦1 .将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH205~8μ1润湿。
2 .取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。
3 .将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。
4 .在每根胶条上覆盖2-3m1矿物油。
5 .对好正、负极，盖上盖子。
设置等电聚焦程序。
6 .聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。
或将胶条置于样品水化盘中，-20。
水箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10分钟,使其溶解。
第二向SDS-PAGE电泳1 .配制12%的丙烯酰胺凝胶。
2 .待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MiI1iQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MiIIiQ水冲洗。
3 .配制胶条平衡缓冲液I4 .在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。
将另一份厚滤纸用Mi1IiQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
双向电泳原理及实验步骤
charge
样品制备基本原则
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包 括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。
• 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修
饰（如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一
• 溶解的目标：
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏， 从而形成各个多肽的溶解液；
– 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸 等物质的去除；
– 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
增加样品溶解性的手段
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。 典型代表是尿素和硫尿。
去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢 剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应 用最普遍。
还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可 使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含 自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基 膦（TBP）进行还原。
保证待研究蛋白的可检测性。
样品制备
• 细胞样品：反复冻融、超声破碎 • 组织样品：碾磨、匀浆 • 植物样品：碾磨 • 分泌蛋白 蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白 • 菌体蛋白 裂解液处理、超声破碎
不同样品的基本处理方法
可溶性样品
固体组织样品 细胞
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双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备
血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：
①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备
裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法
细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
此外，在Tris碱、碳酸钠或碱性载体两性电解质存在的条件下，蛋白酶能被有效抑制。
若此时仍用一些蛋白酶保持活性，应当使用蛋白酶抑制剂，特别是复合使用蛋白酶抑制剂。
一些温和的裂解方法包括：渗透裂解，冻融裂解，去污剂裂解和酶裂解；而一些强烈的裂解方法包括：超声裂解法，高压法，机械匀浆法，研磨法和滚珠粉碎法。
2. 蛋白裂解液的初步分离
临床蛋白质组面对的最大挑战主要包括样品中蛋白质丰度巨大的动态范围和跨度较大的蛋白质属性（包括分子量、等电点、疏水性和转录后修饰等等）。
因此双向电泳结果图中布满斑点，使结果解释非常困难，同时低丰度蛋白会被掩盖，分辨率降低。
因此在分析前降低样品复杂性可以提高双向电泳对低丰度蛋白定量分析的灵敏度。
3. 蛋白质沉淀
这一步骤主要是用来除去样品中的污染杂质（如盐、去污剂、核酸和脂类等），以免对电泳结果产生影响，同时还能浓缩样本，但可能会改变样本蛋白成分。
可以选用的沉淀方法有：硫酸铵沉淀法，TCA（三氯乙酸）沉淀法，丙酮沉淀法，在丙酮溶液中的TCA 沉淀，石炭酸萃取后采用乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白质。
4. 离心沉淀的再溶解
推荐使用含8mol/L尿素的消化溶液。
5. 除去污染物
双向电泳中，等电聚焦电泳对低分子量的离子型杂质特别敏感。
同时样本中的非蛋白质杂质能干扰电泳分离和随后的电泳结果显影，所以，在样本制备的过程中，须除去这些杂质。
这些杂质具体包括盐类、带电小分子、白蛋白和IgG、脂类、多糖等等。
6.样本制备溶液的组成
样本溶液中必须含有某些成分，以确保在进行等电聚焦前，样本能完全溶解和变性，这是为了得到良好聚焦的等电聚焦。
样本溶液往往包括尿素以及一种或多种去污剂。
完全变性确保了每一种蛋白质都保持一种构型，能得到最高分辨率和清晰的电泳图，避免了蛋白质集聚和分子间相互作用的发生。
①变性剂：尿素是一种中性的促溶剂，在等电聚焦中用作变性剂。
使用硫脲能提高蛋白质的溶解度，尤其是膜蛋白。
②去污剂：为了确保样本的完全溶解，防止通过疏水作用而使蛋白质集聚，在样品溶液中往往包含非离子或两性离子去污剂。
2%的CHAPS效果较理想，若仍不能完全溶解可使用阴离子去污剂SDS。
但SDS会与蛋白质形成复合物并带有负电荷，所以不能在这里唯一使用。
③还原剂：为打断二硫键而再样本溶液中加入还原剂，DTT（二硫苏糖醇）和DTE （二硫赤酰糖醇）较为常用。
④增溶剂：载体两性电解质或IPG缓冲液，它们通过电荷间相互作用减少蛋白质集聚，增加蛋白质溶解性，有时需要创造一种碱性条件，可使用缓冲液或碱性液。
但是引入离子成分会影响等电聚焦结果，应在等电聚焦前将缓冲液或碱性也稀释至<5mmol/L。
7.蛋白质样本的定量
用于样品制备和溶解的许多试剂都与常用的蛋白质测定方法不相容，可与传统分光光度法依靠的考马斯亮蓝结合而产生干扰，因此需要使用双向电泳蛋白质定量试剂盒。
①制备工作比色剂，即将100分比色剂A与1份比色剂B混合，每次测定需要1mL 工作比色剂。
②用2mg/mL浓度的BSA标准溶液制备标准曲线。
③制备含1至50μL待测样本的微型离心管，一式两份，每个微离心管中加入500μL 沉淀剂，室温振荡2至3分钟。
④加入500μL辅助沉淀剂，离心（至少10000×g离心力）5分钟。
⑤弃去上清液，再次短暂离心将残余的上清液集中至管底，用微量称管吸取残余的上清液。
⑥每个管中加入100μL铜溶液和400μL去离子水，振荡使沉淀蛋白质完全溶解。
⑦每个管中加入1mL工作比色剂，应确保最快的速度加入，使之与样本立即相混
室温下孵育15至20分钟。
⑧用分光光度计，测定样本和标准液的480nm波长吸光率。
⑨根据标准溶液蛋白质含量的吸光率，绘制标准曲线。
⑩将样本与标准曲线比较，得到样本蛋白质浓度。