肖尔布拉克高温大曲中细菌分离及产香研究
利用非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落多样性
利用非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落多样性姚粟;葛媛媛;李辉;刘洋;赵纪文;张峰国;信春晖;程池【摘要】采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法,对我国芝麻香型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性进行研究。
文库中含有24个分类操作单元（OTU）,优势菌属（丰度）分别为Thermoactinomyces sp.（51.99%）,Kroppenstedtia sp.（17.38%）,Saccharopolyspora sp.（13.87%）,Lactobacillus sp.（6.95%）和Weissellasp.（4.96%）。
首次在高温大曲中发现Thermoactinomyc vulgaris 和Kroppenstedtia eburnea;同时发现3个潜在细菌新种,分属于Saccharothrix sp.,Streptoalloteichus sp.和Pseudofulvimonas sp.。
%16S rDNA clone library technique was conducted to analysis the community diversity of bacterial in high temperature Daqu of sesame flavor liquor.Daqu bacterial communities included 24 OTUs,the dominant bacterium(abundance) was Thermoactinomyces sp.(51.99%),Kroppenstedtiasp.(17.38%),Saccharopolyspora sp.(13.87%),Lactobacillus sp.(6.95%)and Weissella sp.(4.96%).Thermoactinomyc vulgaris and Kroppenstedtia eburnean were first found in high temperature Daqu,3 strains were identified as potential new bacterial species.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2012(038)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】芝麻香型白酒;高温大曲;细菌群落;16SrDNA克隆文库【作者】姚粟;葛媛媛;李辉;刘洋;赵纪文;张峰国;信春晖;程池【作者单位】中国食品发酵工业研究院,北京100027;中国食品发酵工业研究院,北京100027;中国食品发酵工业研究院,北京100027;中国食品发酵工业研究院,北京100027;山东扳倒井股份有限公司,山东淄博256300;山东扳倒井股份有限公司,山东淄博256300;山东扳倒井股份有限公司,山东淄博256300;中国食品发酵工业研究院,北京100027【正文语种】中文【中图分类】TS262.33芝麻香型白酒是我国传统白酒的创新酒种之一，以其独特的清浓酱融合的生产工艺特点和优雅的芝麻香味而闻名，深受国内外消费者青睐，市场发展前景广阔。
浅谈高温大曲培养过程中微生物生长不利因素的产生原因及预防
浅谈高温大曲培养过程中微生物生长不利因素的产生原因及预
防
王邦坤
【期刊名称】《青岛轻工科技》
【年(卷),期】1991(000)001
【总页数】2页(P62,61)
【作者】王邦坤
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.11
【相关文献】
1.偏高温大曲发酵过程中可培养细菌群落研究 [J], 周瑞平;王涛;陈云宗;江东材;唐代云;刘超
2.浅谈关于大体积混凝土在施工过程中裂缝产生的原因及预防、改善的措施 [J], 李树霖;赵松坡
3.高温大曲中高效特征香产生细菌及其应用研究项目通过鉴定 [J], 吴群;黄永光
4.高温大曲中高效特征香产生细菌及其应用研究项目通过鉴定 [J], 吴群;王海燕;黄永光
5.耐高温菌株大曲高温放线菌CICC 10681培养条件的响应面优化 [J], 刘红强;于学健;翟磊;白飞荣;姚粟
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高温大曲安曲投入老草的应用研究
DOI ：10.13746/j.njkj.2020157基金项目：2020年四川省科技成果转化示范项目（2020ZHCG0049）；四川大学—泸州市人民政府战略合作资金专项项目（2018CDLZ -01）；四川大学—泸州市人民政府战略合作资金专项项目（2019CDLZ -02）。
收稿日期：2020-07-21作者简介：王西(1987-)，男，四川省古蔺县人，本科，工程师，主要从事白酒酿造研究。
通讯作者：陈波(1985-)，男，酿酒工程师，高级技师，省级白酒评酒委员，主要从事白酒酿造、酒体品评、科研等方面的研究。
高温大曲安曲投入老草的应用研究王西1，2，陈波1，2，张亚东1，2，刘帮1，晏永1，李素1（1.四川郎酒股份有限公司，四川泸州646523； 2.四川省酱香型白酒生态酿造工程技术研究中心，四川泸州646523）摘要：通过对安曲过程中投入不同占比老草用于高温大曲生产的应用研究，结果发现在安曲试验过程中投入老草占比越大，发酵仓内升温、保温效果越好，挺温时间更长，半成品优级品率更高，香味成分及香味前体物质越丰富。
高温大曲实际生产的安曲过程中增大老草投入量，更有利曲药品质的提升。
关键词：高温大曲；安曲；老草；占比中图分类号：TS262.3；TS261.2文献标识码：A文章编号：1001-9286（2020）12-0088-04Application of Used Straw in the Cultivation of High-Temperature DaquWANG Xi 1,2,CHEN Bo 1,2,ZHANG Yadong 1,2,LIU Bang 1,YAN Yong 1and LI Su 1(ngjiu Distillery Co.Ltd.,Luzhou,Sichuan 646523;2.Sichuan Ecological Brewing Technology ResearchCenter for Jiangxiang Baijiu,Luzhou,Sichuan 646523,China)Abstract :We have studied the application effect of used straw of different proportions in the production of high-temperature Daqu.The results show that,during cultivation period,the larger proportion of used straw be adopted,the better temperature rise effect and the longer temperature maintenance time in the cultivation chamber are achieved;the high-quality rate of the semi-finished product is higher,and the aroma components and precursors are richer.It is proved that by increasing the proportion of used straw in the cultiva-tion period of high-temperature Daqu,the quality of the produced Daqu can be improved.Key words :high-temperature Daqu;cultivation of Daqu;used straw;proportion高温大曲是以小麦、水为原料，稻草做辅料，经过自然培菌、高温发酵、储存而成，富含多菌群多酶系、具有产酒和生香功能的糖化发酵剂。
兼香型白云边酒高温堆积过程中细菌筛选：“白云边酒微生物研究”报告之二
兼香型白云边酒高温堆积过程中细菌筛选：“白云边酒微生物
研究”报告之二
熊小毛;刘承浩
【期刊名称】《酿酒》
【年(卷),期】1992(000)005
【摘要】一前言高温堆积是白云边酒生产工艺的重要环节。
对白云边酒风格的形成有重大影响。
然而每逢冬季,酒醅很难升到工艺要求的堆积温度。
单轮次酒质和出酒率明显下降。
过去,曾采取过一些措施,来保证堆积温度,效果均不理想。
这已成为白云边酒厂及其他同类工艺厂家普遍面临的一个问题。
通过对车间微生物的分离分析,发现冬季酒醅及环境中微生物的种类和数量减少,
【总页数】3页(P20-22)
【作者】熊小毛;刘承浩
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】TS261.13
【相关文献】
1.兼香型白云边酒高温堆积过程主要细菌的分子鉴定 [J], 曾驰;张明春;刘婷婷;缪礼鸿;熊小毛;向苇
2.浓酱兼香型白云边酒生产工艺技术总结 [J], 熊小毛
3.酱香型白酒高温堆积工艺机理及轮次酒产酒分析研究 [J], 刘民万;潘学森;尹凤玮;
葛瑞兰
4.兼香型低度(38度)白云边酒研制成功并通过技术鉴定 [J], 无
5.兼香型白云边酒生产环境中微生物分布探讨——“白云边酒微生物研究”报告之
一 [J], 王佳堂;吴忠亚;张雪枚;刘承浩
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酱香型大曲生产中功能微生物的运用
I FOOD INDUSTRY I 93FOOD INDUSTRY I THEORY酱香型大曲生产中功能微生物的运用文 刘冉1 冯楷斌2 顾翰琦1 1.河北民族师范学院 2.承德市农林科学院处于不同温度状态时，呈现出的发酵效果明显不同。
发酵时间保持在21天时，得到的酒醅发酵效果最好，其中35℃的酒醅发酵后总酸含量和酒精含量都与30℃酒醅发酵效果十分相近，25℃酒醅发酵效果最差。
根据上述实验结果，工厂生产酱香型大曲过程中，需保持酒醅处于35℃环境下，保持发酵21天时间。
2.2 实验室发酵实验中的混合细菌菌株实验2.2.1 细菌抑制作用本次实验过程中采用28组细菌组合，对其经过24小时培养以后，部分细菌组合已经呈现结合状态，部分细菌组合处于相互结合状态，也有部分细菌组合依然处于分开生长状态。
继续将28组细菌组合培养48小时，记录细菌组合生长数据如表1所示。
从表中酱香型白酒是各类白酒产品中的佼佼者，不仅制作工艺更为复杂，且因酱香口感呈现出入口绵柔、幽雅细腻的特性。
本文以酱香型白酒酿制过程为研究对象，分析酱香型大曲生产中功能微生物的具体应用，经过具体的酒醅发酵实验，探究酱香型大曲白酒中的总酯、总酸以及酒精等指标含量，明确功能微生物的作用。
前言酱香型大曲白酒在酿造过程中需要酒曲、窖泥以及酒醅等物质的辅助，这些物质中均含有功能微生物，能够起到调节白酒品质的效果。
有学者在研究酱香型白酒生产过程中利用大曲发酵，在经过酒液分离纯化阶段，可以从酒液中分离出8株酱香菌株，学者对此展开详细研究，发现这些菌株都属于芽孢杆菌。
因此，为了提升白酒品质，越来越多的厂家在生产酱香型大曲白酒过程中，都会将功能微生物以合理的比例运用到白酒酿造流程当中，从而起到改变白酒酒液口感、提升白酒酿造品质的作用。
本文将详细讨论酱香型大曲生产中功能微生物的运用。
1. 实验准备1.1 材料准备实验室保藏菌种∶细菌 BX01—BX08，酵母BF01-BF03、BZ01-BZ03。
高温大曲中高产吡嗪类物质芽孢杆菌的筛选与应用
2022Vol.41No.1•116・Serial No.359China Brewing Research Report 高温大曲中高产毗嗪类物质芽抱杆菌的筛选与应用梁慧珍卢延想1,刘正1,陈鹏吧张长霞1,李细芬】，秦培军1(1溃州国台酒业集团股份有限公司，贵州仁怀564501;2.天津科技大学生物工程学院，天津300457)摘要:采用高温培养和固态发酵，从高温大曲中筛选高产毗嗪菌株，并通过顶空固相微萃取及气相色谱■质谱联用(HS・SPME・GC・MS)技术检测菌株代谢产物。
将高产毗嗪菌株应用于大曲生产,使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测强化大曲中毗嗪类物质含量。
结果表明，共筛选出6株高产毗嗪菌株(编号为XI、X2、X4、X6、X8、X9),均被鉴定为芽抱杆菌(Bacillus),其代谢产物共检出33种挥发性香气化合物，其中菌株XI代谢的毗嗪类物质含量最高为9049.45丛以煌；高产毗嗪菌株发酵主要对大曲贡献酱香、烘焙香以及花果香气;菌株XI强化大曲毗嗪类物质含量提升效果最好，其中四甲基毗嗪、2,3,5■三甲基毗嗪、2,6二甲基毗嗪含量相比对照大曲分别提升2.36倍、2.56倍、2.33倍,并且液态菌剂的效果要普遍优于固态菌剂。
关键词:高温大曲;高产毗嗪菌株;挥发性香气化合物;芽砲杆菌中图分类号:TS261.1文章编号：0254-5071(2022)01-0116-07doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2022.01.020引文格式:梁慧珍,卢延想，刘正，等.高温大曲中高产毗嗪类物质芽抱杆菌的筛选与应用［几中国酿造,2022,41(1):116-122.Screening and application of high-yield pyrazines Bacillus from high temperature Daqu LIANG Huizhen1,LU Yanxiang1,LIU Zheng1,CHEN Peng u,ZHANG Changxia1,LI Xifen1,QIN Peijun1(1.G uizhou Guotai Liquor Group Co.,Ltd,Renhuai564501,China;2.S chool of B ioengineering,Tianjin University of S cience and Technology,Tianjin300457,China)Abstract：The high-yield pyrazines strains were screened from high-temperature Daqu by high-temperature culture and solid-state fermentation,and the metabolites of strain were detected by headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC-MS) technology.The high-yield pyrazines strain was applied to the production of Daqu,and the content of pyrazines in Daqu was detected by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The results showed that a total of6high-yield pyrazines strains(numbered as XI,X2,X4,X6,X8,X9)were screened out and all were identified as Bacillus,and33volatile aroma compounds were detected in their metabolites.Among them,the content of pyrazines metabolized by strain XI was the highest,which was9049.45jig/kg.The high-yield pyrazines strain mainly contributed to sauce,baking,flower and fruit aromas for Daqu.The strain XI had the optimal effect in enhancing the content of p yrazines in Daqu,the content of tetramethylpyrazine,2,3,5-trimethylpyrazine,and2,6-dimethylpyrazine increased by2.36times,2.56times,and2.33times compared with the control Daqu,and the effect of liquid agent was better than solid agent.Key words：high-temperature Daqu;high-yield pyrazines strain;volatile aroma compounds;Bacillus酱香型白酒是中国传统蒸憾酒叫因酱香突出、幽雅细腻广受市场欢迎孔酱香型白酒风格离不开其独特的高温制曲工艺眄大曲为白酒酿造提供了功能微生物菌群以及白酒风味物质的前体物质內。
酵母菌的培养与分离
微生物学大实验实验指导编者：生物技术教研室2007.3目录实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究实验一酵母菌的培养与分离一、实验目的学习培养和分离酵母菌的技术和方法二、基本原理大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。
三、实验主要内容和要求（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。
2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。
3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。
4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。
四、实验的准备1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。
配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。
芝麻香型白酒高温大曲中高温放线菌及其功能基因的动态变化规律
及
提供 物质，促进芝麻香风味的
形成，在芝麻香白酒酿造中起到重要作用［—「27］。这
些微生物作用均与功能基因紧密相关，高温大曲为白
酒酿造提供丰富的微生物 和功能基因，明析高温
放线菌中功能基因在大曲制备过程中的 及变化
规律，有助
大曲及白酒酿造过程
的作 制。
但目前对芝麻香型白酒高温大曲的研究主要集
中 种的 筛选及微生物群落结构
2017年7
扳倒井股份有限公司13#
曲房大曲的跟踪采样工作，根据不同发酵时期的发酵
结合大曲发酵过程的操作工艺，对大曲制备过程
中各个工艺阶段样品进行采集，工艺阶
房
（A,32 t ）、入房第 2 天（B,34.5 t -、一翻前（C,入 房 4 d,41.8 t -、一翻（D,入房 5 d,42.0 t -、一翻后 （E,入房 6 d,40.7 t-、二翻前（F,入房 7 d,41.0 t ）、二翻（G,入房 5 d,41.5 t ）、二翻后（H,入房 9
线菌（T. aUags）、中间型高温放线菌（T. ptermead
ss）、大曲高温放
（T. dagiD -等多株高温放线菌
属菌种［—］。该属微生物常见于自然界高温场所，具
高温特性，适应大曲发酵中的高温 ，具 ：
发高温淀粉酶、蛋白酶、酯酶2
和多酚氧 等
潜力［—-—］,可促进蛋白降解产生多种氨基酸，为酯化
理、提升芝麻
白酒生产品质具有
重要意义。
2019年第45巻第13期（总第385期）| 71
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATILN ILDUSTRIES
1材料与方法
14实验材料
1.1.1 试剂
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肖尔布拉克高温大曲中细菌分离及产香研究杨佳;祖拜代;杨青;丁雪梅;赵树欣;黎贤书;杨奕【摘要】39 strains of bacteria were isolated from Xiaoerbulake Jiangxiang high-tem perature Daqu by normal temperature treatment and heat treatment. Fermented in wheat-extract medium, 15 of these strains produced obvious Jiangxiang flavor. The 15 strains went through fermentation process again and their protease activity were determined.All 15 strains had protease activity, and 6 of them (C1-3, C4, C8, R12, R19 and R20) had relatively high protease activity. Through 16S rDNA sequence analysis, strains C1-3, C4, R19, and R20 were identified as Bacillus subtilis,C8 as Bacillus methylotrophicus, and R12 as Kocuria sp. Then the fermentation liquid of the 6 strains went through GC-MS analysis. The results showed that the numbers of components generated were 8, 19, 24, 15, 8 and 9, respectively, and that strains C1-3 and R19 generated more Tetramethylpyrazine than other strains.%从肖尔布拉克酒业酱香型高温大曲中通过常温法和热处理法分离出了39株细菌，采用麸皮浸出汁培养基发酵，发现其中15株细菌的发酵液酱香味明显。
将这15株细菌进行复发酵并进行蛋白酶活力的测定，显示15株菌株均有蛋白酶活力，其中有6株活力较强,分别为C1-3，C4，C8，R12，R19和R20。
对这6株菌株进行基因组测序， C1-3、C4、R19和R20为枯草芽孢杆菌，C8为甲基营养型芽孢杆菌，R12为考克氏菌。
对该6株菌发酵液进行气相色谱质谱分析，结果显示，6株菌检测出的物质数分别为：8种、19种、24种、15种、8种和9种。
其中C1-3和R19生成的四甲基吡嗪含量较高。
【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2014(000)010【总页数】4页(P47-50)【关键词】酱香;大曲;细菌;白酒【作者】杨佳;祖拜代;杨青;丁雪梅;赵树欣;黎贤书;杨奕【作者单位】天津工业微生物重点实验室，工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222;天津工业微生物重点实验室，工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222;天津工业微生物重点实验室，工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222;天津工业微生物重点实验室，工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222;天津工业微生物重点实验室，工业微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300222;伊犁肖尔布拉克酒业有限公司，新疆新源835811;伊犁肖尔布拉克酒业有限公司，新疆新源835811【正文语种】中文【中图分类】TS262.3;TS261.1;TS261.4;Q93-3酱香型高温大曲在生产中添加量大，因此它不仅是酱香型白酒生产中的糖化发酵剂，还是酱香型白酒生产中的重要原料，也是酱香型白酒呈香呈味物质的直接和间接提供者。
高温大曲中的微生物主要是细菌，尤其是以耐高温的芽孢杆菌为主。
在发酵过程中，高温大曲中存活的嗜热芽孢杆菌分泌出的各类酶可以分解原料中的淀粉、蛋白质、纤维素等大分子物质，使之参与呈香呈味物质的形成过程[1]。
肖尔布拉克酿酒有限公司位于新疆伊犁新源县肖尔布拉克镇，位于伊犁河谷，紧邻那拉提草原。
肖尔布拉克酒业在传统酱香酒酿造工艺的基础上，根据伊犁河谷的气候土壤环境，对酱香型生产工艺进行了大量研究改进，生产出了高品质的肖尔布拉克酱香型白酒。
无酿酒所用高温大曲的原料选自伊犁河谷生产的绿色、无污染的优质小麦，研究这种高温大曲，可以对比其与内地其他高温大曲的差别，这有可能从地域差异性中有所发现。
总之，针对新疆酱香型高温大曲中微生物的研究具有重要的意义与作用。
1.1 材料、仪器福林酚试剂为北京索莱宝科技有限公司生产，其他试剂均为国产分析纯。
紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司生产高温大曲:酱香型高温大曲取自肖尔布拉克酒业有限公司。
气相色谱-质谱连用分析发酵香气:Varian 4000GC /MS气相色谱质谱联用仪，色谱柱型号为VF-5 ms (30 nm×0.25 nm×0.25μm)，载气为氦气，进样口温度: 25℃；质谱条件:质量分离器:离子阱；离子源:E1；电离能量:70 eV；离子阱温度:220℃；传输线温度:280℃，扫描方式为全扫描(full)/选择离子扫描(sis)；检索谱库为NIST05。
1.2 实验方法1.2.1 高温大曲中细菌的数量统计常温培养法:称取10 g均匀粉碎的曲样于90ML无菌生理盐水中，150 r/Min振荡30Min。
取1ML菌悬液逐级稀释至10-7，每个处理样品选3个梯度(10-4、10-5、10-6)适量涂布于营养琼脂培养基平板，37℃培养18～36 h。
选取平板中CFU在20～200范围的统计计算。
热处理法:称取10 g均匀粉碎的曲粉在90ML种子液培养基中，做热处理(100℃，30Min)，取1ML菌悬液逐级稀释至10-7，每个处理样品选4个梯度(10-3、10-4、10-5、10-6)，适量涂布于营养琼脂培养基平板，37℃培养并选取平板中CFU在20～200范围的统计计算。
1.2.2 产香功能菌的筛选将大曲中按照以上2种方法分离得到的菌株，经适当培养后转接到发酵培养基中按照温度梯度(37℃→55℃)进行发酵，并请品评人员对样品产香能力进行品评。
品评人员由实验室老师与学生组成。
每个样品由5名品评人员分别进行品评。
评价发酵液的酱香，按“-“没有酱香；“+“稍有酱香；“++“酱香明显；“+++“酱香突出，4个等级分类。
选择产生酱香味较好的细菌。
1.2.3 产香菌株蛋白酶活力的测定按照国家标准GBT23527—2009，使用福林酚法进行测定。
1.2.4 产香菌的16S rDNA序列分析1.2.4.1 基因组DNA的提取采用SDS-蛋白酶K裂解法，DNA的提取主要采用酚/氯仿/异戊醇抽提法，再用无水乙醇沉淀提取总DNA。
主要步骤有:①1.5ML菌液在1000 r/min转速下离心4～5Min；②弃上清液，沉淀中加0.5ML TE缓冲液，再加入10μL溶菌酶(20mg/ML)并在室温下放置10Min；③加入10μL 20%SDS,摇匀后加入5μL Prok (10mg/ML)振荡后，再在55～65℃环境下放置2 h；④取出水浴后的液体加入300μL的苯酚和300μL的氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，再在1000 r/min转速下离心10Min。
萃取后的上清液再重复进行苯酚/氯仿/异戊醇抽提，直到抽提至无白色杂质为止；⑤取出上清液，加入1/10上清液体积的3mol/L NaAc和2倍上清液体积的95%vol乙醇(4℃)，之后在1000 r/Min转速下离心10Min；⑥弃上清液，在沉淀中加入200μL，70%vol乙醇，在1000 r/Min下离心5Min并于室温下干燥；⑦加入100～200μL dd H2O或TE缓冲液于4℃冰管保存。
1.2.4.2 16S rDNA的扩增以提取的总DNA作为模板，采用细菌的通用引物进行16S rDNA序列PCR扩增。
将3μL PCR扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，并通过EB染色，紫外灯下观测结果。
引物1:F27(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')引物2:R1492(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')反应体系组成及循环参数见表1、表2。
1.2.4.3 16S rDNA序列测定及同源性比较、系统分析PCR结果电泳验证。
16S rDNA测序由北京华大基因有限公司完成。
将测序结果输入NCBI(http://www. /blast)中与数据库已有序列进行比较分析。
2.1 大曲中细菌的数量统计细菌:按照常温培养法分离培养后统计高温大曲中细菌数约为:3.1×105cfu/g。
耐热或芽孢菌:按照热处理方法培养后统计高温大曲中菌数约为:6.2×103c fu/g。
2.2 具有产香功能的细菌的筛选2.2.1 常温分离菌株中产香菌株的筛选2次常温筛选所得到的19株菌作为实验菌株，用C标记。
其中，C1-1、C1-3、C2-1、C2-2、C1、C4、C5、C8、C11号菌产香能力较强。
2.2.2 热处理后具有产香功能菌的筛选2次热处理筛选所得到的20株菌作为实验菌株，用R标记。
其中的R12、R17、R19、R20、R24、R-Ⅱ-3号菌，能产生较强的酱香风味。
2.2.3 产香功能较强细菌的复筛以上实验共得到39株产香细菌，其中15株产香能力较强，并用相同方法发酵复筛确定细菌的产香能力，结果见表3。
2.3 产香菌蛋白酶活力的测定分别对以上15株菌进行蛋白酶活力的测定，以了解菌株的蛋白酶活力与产香之间的关系，结果见表4。
通过发酵产香以及蛋白酶活力测定结果，选取其中的6株菌进行测序。
分别为:C4、C8、C1-3、R12、R19、R20。
2.4 产香菌基因组测序PCR扩增获得6个约1.5 kb的PCR产物，琼脂糖电泳结果见图1。
16S rDNA测序由北京华大基因公司完成。
将测序结果输入NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。
初步确定C1-3、C4、R19和R20为枯草芽孢杆菌，C8为甲基营养型芽孢杆菌，R12为考克氏菌。
2.5 产香菌的气相色谱质谱分析对6株菌发酵产物进行气相色谱质谱分析，6株菌对应的含有的化合物以及出现的面积百分比见表5。