项目三、配位滴定法测定水中钙镁含量
项目三、配位滴定法测定水中钙镁含量
【概述】
配位滴定法是利用形成配合物的反应进行滴定分析的方法。本法中广为应用的配位剂是氨羧配位剂EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐）
EDTA与金属离子配位的主要特点是：能与碱金属之外绝大多数金属离子形成具有五个五员环的稳定的螯合物；配位的离子比一般均为1：1；生成的配合物易溶于水，且多数没有颜色。
影响配位平衡的主要因素是酸效应与配位效应。确定配位滴定的适宜pH值，还应考虑羟基化效应、共存离子效应等影响与指示剂的变色情况。
配位滴定多采用金属指示剂确定终点。对金属指示剂的要求是：
1.配合物与指示剂本身的颜色有明显区别；
2.配合物的稳定性要求lgK′MY－lgK′MIn>2,且lgK′
>4;
Min
3.显色反应灵敏迅速；
4.配合物易溶于水。
解决EDTA配位作用的广泛性与所要求的选择性之间矛盾的两个途径是：
1.当lgC M K MY－lgC N K NY≥5时,利用控制溶液酸度的方
法;
2.当lgC M K MY′－lgC N K NY<5时,利用掩蔽的方法。
测定水中钙镁离子的含量，就是测定水的总硬度。
通过此项能力的培养，能使你通过正确使用移液管，滴定管等玻璃仪器，准确测定水中钙镁含量。
【学习途径】
〖知识部分〗
?EDTA配位滴定法的特点，酸度对配位滴定的影响。
?测定水硬度的原理及方法。
?金属指示剂铬黑T指示剂使用的条件及变色原理〖操作技能部分〗
?量器的选择
?移液管、滴定管的正确使用
?滴定终点的正确判断
?EDTA标准溶液的制备
【评价标准】
5h内完成测定，达到标准规定的允差。
【评定方法】(考核)
〖应知自测〗
通过学习后，你应能理解酸度对配位滴定的影响，水中钙镁含量的测定原理和条件，金属指示剂的变色原理和使用条件，铬黑T指示剂的应用。
〖应会测试〗(操作考核)
掌握配制和标定EDTA标准溶液的方法，正确运用配位滴定法准确测定水中钙镁含量，并达到标准规定的要求。
通过学习和自测后，认为已能达到本专项能力的培训要求，可参加专项能力的技能操作考核，考试成绩由指导教师认定。
在您参加考核之前，应先检查一下自己是否完成了下列任务：
?复习与本专项能力相关的模块。
?掌握本专项能力所需的知识，通过自测。
?熟练完成本专项能力所需的仪器，正确配制标准滴定
溶液，按要求完成测试任务。
【水的硬度定义】
水的硬度是指水中除碱金属外的全部金属离子的浓度。由于Ca2+、Mg2+含量远比其它金属离子为高，所以通常以水中Ca2+、Mg2+总量表示水的硬度。水中钙盐含量用硬度表示为钙硬度，镁盐用硬度表示则为镁硬度。
【水的硬度测定原理】
〖总硬度测定〗
用EDTA配位滴定法测定水的硬度是一个准确而快速的方法，它是在pH=10的氨性缓冲溶液中，以铬黑T为指示剂，用EDTA标准溶液直接测定水中的Ca2+和Mg2+。
pH=10时，Ca2+和Mg2+与EDTA生成无色配合物,铬黑T 则与Ca2+、Mg2+生成红色配和物。由于lgK CaIn Mg2++HIn2－=MgIn－+H+ 用EDTA滴定时由于lgKCaY>lgK MgY′EDTA首先和溶液中Ca2+配位，然后再与Mg2+配位，反应如下： Ca2++H2Y2－=CaY2－+2H+ Mg2++H2Y2－=MgY2－+2H+ 到达化学计量点时，由于lgK MgY> lgK MgIn′稍过量的EDTA 夺取MgIn－中的Mg2+,使指示剂释放出来，显示指示剂的纯蓝色，从而指示滴定终点，反应如下： MgIn－+ H2Y2－= MgY2－+ HI n2－+ H+ 红色蓝色 在测定水中Ca2+、Mg2+含量时，因当Mg2+与EDTA定量配合时，Ca2+已先与EDTA定量配位完全，因此，可选用对Mg2+较灵敏的指示剂来指示终点。 如果水样中存在Fe3+、Al3+、Cu2+时，对铬黑T有封闭作用，可加入Na2S使Cu2+成为CuS沉淀，在碱性溶液中加入三乙醇胺掩蔽Fe3+、Al3+。 Mn2+存在时，在碱性条件下可被空气氧化成Mn4+，它能将铬黑T氧化褪色，可在水样中加入盐酸羟胺防止其氧化。 根据所消耗的EDTA标准滴定溶液的体积，记算水的总硬度： 1.用CaCO3 mg.L－1(即ppm表示) 2.用度表示（1○=10mgCaO） 〖钙硬度的测定〗 用NaOH调节水试样pH=12.5使Mg2+形成Mg（OH）2沉淀，以钙指示剂（N.N）确定终点，用EDTA标准滴定溶液滴定，终点时溶液由红色变为蓝色。 Ca2++HIn2－=CaIn－+H＋ Ca2++H2Y2－=CaY2－+2H+ CaIn－+H2Y2－=CaY2－+HIn2－+2H+ 红色蓝色 结果计算 CaCO3(mg.L-1)= 度（0） = 钙硬度 CaC03mg ．L-1= 镁硬度=总硬度－钙硬度 式中C－（EDTA）EDTA标准滴定溶液浓度，mo1﹒L-1 ； V1－测总硬度时消耗EDTA标准溶液的体积,L; V2－测定钙硬度时消耗EDTA标准滴定溶液的体积,L; V－水样体积,L。 【测定方法】 〖测定步骤〗 1.移取一定体积的水样(视水中钙镁含量而定)； 2.加4ml PH=10氨－氯化铵缓冲溶液和3滴铬黑T指示液； 3.用0.01mol ．L-1 EDTA 标准滴定溶液滴定至终点； 4.平行测定三次。 〖注意事项〗 水样中含有Ca（HCO3）2，当加碱调节pH>12时，Ca （HCO3）2形成CaCO3沉淀而使结果偏低，而且滴定终点拖长，变色不敏锐。 Ca（HCO3）2+2NaOH= CaCO3↓+Na2CO3+2H2O 故应加入HCl酸化并煮沸使Ca（HCO3）2完全分解。 Ca（HCO3）2+2HCl =CaCl2+2H2O+2CO2↑ ?加入NaOH量不宜过多，否则一部分Ca2+被Mg（OH）2 吸附，致使钙硬度结果偏低，加入NaOH量不足时, Mg2+ 沉淀不完全，钙硬度结果偏高。 欢迎点击配位滴定法测定水中钙镁含量视频 实验十四水硬度的测定 一实验目的 1、了解硬度的常用表示方法； 2、学会用配位滴定法测定水中钙镁含量，钙含量的原理和方法 3、掌握铬黑T，钙指示剂的使用条件和终点变化。 二、实验原理 1、总硬度、钙硬度、镁硬度的概念及表示方法； 水的硬度主要是指水中含可溶性的钙盐和镁盐。总硬度通常以每L 水中含的碳酸钙的mg数，即mg/L. 钙硬度即每1L 水中含的钙离子的m g数，mg/L. 镁硬度即每1L 水中含的镁离子的m g数，mg/L 2 总硬度的测定条件与原理 测定条件：以N H3-NH4Cl 缓冲溶液控制溶液pH＝10，以铬黑T 为指示剂，用EDTA 滴定水样。 原理：滴定前水样中的钙离子和镁离子与加入的铬黑T指示剂络合，溶液呈现酒红色，随着EDTA的滴入，配合物中的金属离子逐渐被EDTA夺出，释放出指示剂，使溶液颜色逐渐变蓝，至纯蓝色为终点，由滴定所用的EDTA的体积即可换算出水样的总硬度。 3 钙硬度的测定条件与原理； 测定条件：用NaOH溶液调节待测水样的pH为13，并加入钙指示剂，然后用EDTA 滴定。 原理：调节溶液呈强碱性以掩蔽镁离子，使镁离子生成氢氧化物沉淀，然后加入指示剂用EDTA滴定其中的钙离子，至酒红色变为纯蓝色即为终点，由滴定所用 的EDTA的体积即可算出水样中钙离子的含量，从而求出钙硬度。 4、相关的计算公式 总硬度＝(CV1) EDTA M CaCO3/0.1 钙硬度＝(CV2) EDTA M Ca/0.1 镁硬度＝ C(V1-V2)M Mg/0.1 三实验步骤 实验步骤思考题 总硬度的测定 1、水硬度的测定包括哪些内容？如何 用100mL吸管移取三份水 测定？ 样，分别加5mL NH3-NH4Cl 缓冲 2、我国如何表示水的总硬度，怎样换溶液，2～3 滴铬黑T 指示剂，用 EDTA标准溶液滴定，溶液由酒红 算成德国硬度？ 色变为纯蓝色即为终点。 3、用Zn2+标准溶液标定EDTA标准溶液 有二种方法，水硬度的测定实验中所用EDTA应 用哪种方法标定？ 4、怎样移取100mL水样？ 5、为什么测定钙、镁总量时，要控制 pH=10？叙述它的测定条件。 6、测定总硬度时，溶液中发生了哪些 反应，它们如何竞争 7、如果待测液中只含有Ca2+，能否用铬黑T 为指示剂进行测定? 钙硬度测定 8、测定钙硬度时，为什么加2mL6mol· L-1NaOH 用100mL吸管移取三份水样，分别加2mL 6mol· L -1 NaOH -1 NaOH 溶液使溶液的pH=12～13？叙述它的测定条件。 9、为什么钙指示剂能在pH=12～13 的条件下指 溶液，5～6 滴钙指示剂，用EDTA 示终点？ 标准溶液滴定，溶液由酒红色变 为纯蓝色即为终点。 10、怎样减少测定钙硬度时的返红现象？ 11、怎样做空白实验，为什么要做空白实验， 实验中为什么不做？ 12、怎样表示实验结果？ 13、如水样中含有Al3+、Fe3+、Cu2+，能否用 铬黑T 为指示剂进行测定，如可以，实验应该 如何做？ 四实验数据记录与处理 水中钙镁离子含量及总硬度的测定 目的 1、了解水的硬度的测定意义和水硬度常用表示方法。 2、掌握EDTA法测定水中Ca2+、Mg2+含量的原理和方法。 原理 工业中将含有较多钙、镁盐类的水称为硬水，水的硬度是将水中Ca2+、Mg2+的总量折合成CaO或CaCO3来计算。每升水中含1mgCaO定为1度，每升水含10mgCaO称为一个德国度（°）。水的硬度用德国度（°）作为标准来划分时，一般把小于4°的水称为很软水，4°～8°的水称为软水，8°～16°的水称为中硬水，16°～32°的水称为硬水，大于32°的水称为很硬水。 用EDTA进行水的总硬度及Ca2+、Mg2+含量的测定时可先测定Ca2+、Mg2+的总量，再测定Ca2+量，由总量与Ca2+量的差求得Mg2+的含量，并由Ca2+、Mg2+总量求总硬度。 Ca2+、Mg2+总量的测定：用NH3-NH4Cl缓冲溶液调节溶液的PH=10，在此条件下，Ca2+、Mg2+均可被EDTA准确滴定。加入铬黑T指示剂，用EDTA标准溶液滴定。在滴定的过程中，将有四种配合物生成即CaY、MgY、MgIn、CaIn，它们的稳定性次序为：CaY﹥MgY﹥MgIn﹥CaIn（略去电荷） 由此可见，当加入铬黑T后，它首先与Mg2+结合，生成红色的配合物MgIn，当滴入EDTA时，首先与之结合的是Ca2+，其次是游离态的Mg2+，最后，EDTA 夺取与铬黑T结合的Mg2+，使指示剂游离出来，溶液的颜色由红色变为蓝色，到达指示终点。设消耗EDTA的体积为V1。 Ca2+含量的测定：用氢氧化钠溶液调节待测水样的PH=12，将Mg2+转化为Mg(OH)2沉淀，使其不干扰Ca2+的测定。滴加少量的钙指示剂，溶液中的部分Ca2+立即与之反应生成红色配合物，使溶液呈红色。当滴定开始后，随着EDTA的不断加入，溶液中的Ca2+逐渐被滴定，接近计量点时，游离的Ca2+被滴定完后，EDTA 则夺取与指示剂结合的Ca2+使指示剂游离出来，溶液的颜色由红色变为蓝色，到达指示终点。设滴定中消耗EDTA的体积为V2。 仪器及药品 仪器：50ml酸式滴定管，50ml移液管，250ml锥形瓶，10ml量桶。 药品：10%NaOH溶液,PH=10的缓冲溶液，铬黑T指示剂（将1g铬黑T指示剂与100g分析纯NaCl混合、磨细，装瓶备用），EDTA标准溶液，钙指示剂（1g 钙指示剂与100g分析纯NaCl混合、磨细，装瓶备用）。 内容及步骤 用移液管吸取水样50.00ml于250ml三角瓶中，加5ml PH=10的缓冲溶液，再加少许（约0.1g）铬黑T混合指示剂，用EDTA标准溶液滴定至酒红色变为纯蓝色。记录EDTA用量V1（ml）。重复1～2次。 另取50.00ml水样于250ml锥形瓶中，加入5ml10%NaOH溶液摇匀，加入少许（约0.1g）钙指示剂，用EDTA标准溶液滴定至酒红色变为纯蓝色。记录EDTA 用量V2（ml）。重复1～2次。按下式计算： (EDTA)×V2×M(Ca)×1000 C ρCa(mg/L)= -------------------------- 50.00 水中细菌总数的测定 一、目的要求 l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。 2．了解水源水的平板菌落计数的原则。 二、基本原理 本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。 三、器材 l．培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。 2.仪器或其他用具灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 四、操作步骤 l．水样的采取 (1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流 5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。 (2)池水、河水或湖水应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 2．细菌总数测定 (1)自来水 ①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。 ②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。 ③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。 ④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。 ⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。 (2)池水、xx或xx等 ①稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10- 1、10-2与10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。 一般中等污秽水样，取10- 1、10- 2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10- 2、10- 3、10-4三个连续稀释度。 ②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。 ③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。 实验十二水硬度的测定 一实验目的 1、了解硬度的常用表示方法； 2、学会用配位滴定法测定水中钙镁含量，钙含量的原理和方法 3、掌握铬黑T，钙指示剂的使用条件和终点变化。 二、实验原理 1、总硬度、钙硬度、镁硬度的概念及表示方法； 水的硬度主要是指水中含可溶性的钙盐和镁盐。总硬度通常以每L水中含的碳酸钙的mg数，即mg/L. 钙硬度即每1L水中含的钙离子的mg数，mg/L. 镁硬度即每1L水中含的镁离子的mg数，mg/L 2 总硬度的测定条件与原理 测定条件：以NH3-NH4Cl 缓冲溶液控制溶液pH＝10，以铬黑T为指示剂，用EDTA滴定水样。 原理：滴定前水样中的钙离子和镁离子与加入的铬黑T指示剂络合，溶液呈现酒红色，随着EDTA的滴入，配合物中的金属离子逐渐被EDTA夺出，释放出指示剂，使溶液颜色逐渐变蓝，至纯蓝色为终点，由滴定所用的EDTA的体积即可换算出水样的总硬度。 3 钙硬度的测定条件与原理； 测定条件：用NaOH溶液调节待测水样的pH为13，并加入钙指示剂，然后用EDTA滴定。 原理：调节溶液呈强碱性以掩蔽镁离子，使镁离子生成氢氧化物沉淀，然后加入指示剂用EDTA滴定其中的钙离子，至酒红色变为纯蓝色即为终点，由滴定所用的EDTA的体积即可算出水样中钙离子的含量，从而求出钙硬度。 4、相关的计算公式 总硬度＝(CV1)EDTA M CaCO3/0.1 钙硬度＝(CV2)EDTA M Ca/0.1 镁硬度＝C(V1-V2)M Mg/0.1 三实验步骤 实验步骤思考题 总硬度的测定1、水硬度的测定包括哪些内容？如何测定？ 用100mL 吸管移取三份水样，分别加5mL NH 3-NH 4Cl 缓冲溶液，2～3滴铬黑T 指示剂，用EDTA 标准溶液滴定，溶液由酒红色变为纯蓝色即为终点。 2、 我国如何表示水的总硬度，怎样换算成德国硬度？ 3、 用Zn2+标准溶液标定EDTA 标准溶液有二种方法，水硬 度的测定实验中所用EDTA 应用哪种方法标定？ 4、 怎样移取100mL 水样？ 5、 为什么测定钙、镁总量时，要控制pH=10？叙述它的测 定条件。 6、 测定总硬度时，溶液中发生了哪些反应，它们如何竞争 7、如果待测液中只含有Ca2+，能否用铬黑T 为指示剂进行测定? 钙硬度测定 用100mL 吸管移取三份水样，分别加2mL 6mol ·L -1 NaOH 溶液，5～6滴钙指示剂，用EDTA 标准溶液滴定，溶液由酒红色变为纯蓝 色即为终点。 8、测定钙硬度时，为什么加2mL 6mol ·L-1NaOH 溶液使溶液 的pH=12～13？叙述它的测定条件。 9、为什么钙指示剂能在pH=12～13的条件下指示终点？ 10、怎样减少测定钙硬度时的返红现象？ 11、怎样做空白实验，为什么要做空白实验，实验中为什么不做？ 12、怎样表示实验结果？ 13、如水样中含有Al3+、Fe3+、Cu2+，能否用铬黑T 为指示 剂进行测定，如可以，实验应该如何做？ 四 实验数据记录与处理 总硬度的测定 序号 1 2 3 自来水体积V 水/mL V 初/mL V 终/mL V 总/mL 平均体积V 1/mL 总硬度/mg/L 水中细菌总数的检测 1.实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2.菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。 细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3.培养基与试剂 营养琼脂成分 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为~，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4.仪器和材料 4.1仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。 4.2材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、 镊子、试管架等。 4.3放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5.样品采集 5.1自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min， 用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 5.2纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样 200毫升。 5.3地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入 水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6.检验步骤 6.1生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注 入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 6.2水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中， 水中细菌总数的检测 Revised by Jack on December 14,2020 水中细菌总数的检测 1.实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2.菌落总数standardplate-countbacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48h后，所得1mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3.培养基与试剂 营养琼脂成分 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为~，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经kPa（121° C,15lb）湿热灭菌20min，储存于冷暗处备用。 4.仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5.样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5min，用无菌空三角瓶接取水样200ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6.检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48h，进行菌落计数，即为1ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1ml，注入盛有9ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。 用灭菌吸管吸取1ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内，其余操作同生活饮用水的检验步骤。 7.菌落计数及报告方法 作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平 试验八水中钙镁含量 的测定 实验八水中钙、镁含量的测定 实验目的： 1．掌握EDTA法测定水硬度的原理和方法。 2．了解测定水的硬度的意义和我国常用的硬度表示方法。 3. 掌握铬黑T和钙指示剂的性质、应用及终点时颜色的变化。 实验原理： 通常称含较多量Ca2+、Mg2+的水叫硬水，水的总硬度是指水中Ca2+、Mg2+的总量。硬度小于5～6度的一般可称为软水。硬度有暂时硬度和永久硬度之分。凡水中含有钙、镁的酸式钙酸盐，遇热即成钙酸盐沉淀而失去其硬度则为暂时硬度；凡水中含有钙、镁的硫酸盐、氯化物、硝酸盐等所成的硬度称为永久硬度。 硬度又分为钙硬和镁硬，由Ca2+离子形成的硬度称为“钙硬”，由Mg2+离子形成的硬度称为“镁硬”，暂时硬度和永久硬度的总和称为“总硬”。 因此，水的总硬度即水中钙、镁总量的测定，为确定用水性质量和进行水的处理提供依据。 1.水的总硬度测定：一般采用络合滴定法，在pH≈10的氨性缓冲溶液中，以铬黑T（EBT）为指示剂，用EDTA标准溶液直接测定Ca2+、Mg2+的总量。由EDTA浓度和用量，可计算出水的总硬度。 滴定过程：由于K CaY>K MgY>K Mg·EBT，铬黑T先与部分Mg络合为Mg-EBT（酒红色）。当EDTA滴入时，EDTA与Ca2+、Mg2+络合，终点时EDTA夺取Mg-EBT中的Mg2+，将EBT置换出来，溶液由酒红色转为纯蓝色。 滴定前：EBT ＋Ｍe（Ca2+、Mg2+）＝Ｍe－EBT （蓝色） pH=10 （紫红色） 滴定开始至化学计量点前：H 2Y 2- + Ca 2+ ＝ CaY 2- + 2H + H 2Y 2- + Mg 2+ ＝ MgY 2- + 2H + 计量点时：H 2Y 2- + Mg-EBT ＝ MgY 2- + EBT +2H + （紫蓝色） （蓝色） 2.测定水中钙硬：在溶液pH ≥12时，以钙指示剂作为指示剂，用EDTA 标准溶液滴定水中Ca 2+，由EDTA 浓度和用量，可算出水钙硬。由总硬度减去钙硬即为镁硬。 3水的硬度表示方法有多种，目前我国采用两种表示方法： （1）一种是以CaO 的mg ?L -1计，以水中Ca 2+、Mg 2+的总量换算为CaO 含量。表示1L 水中所含CaO 的mg 数，其硬度表示为： ） （水 11000)(-???L mg V M cV CaO EDTA （2）是以度（°）计，1硬度单位表示十万份水中含一份CaO ， 1°=10ppmCaO ，其硬度表示为： ） （水 ο100)(??V M cV CaO EDTA 式中 C EDTA —EDTA 标准溶液的浓度 mol ?L -1； V EDTA —滴定时用去的EDTA 标准溶液的体积； V 水样—水样的体积（mL ）； 4.滴定时，Fe 3+、Al 3+等干扰离子用三乙醇胺掩蔽；Cu 2+、Pb 2+、Zn 2+等重金属离子可用KCN 、Na 2S 或巯基乙酸掩蔽。 试剂 污水中细菌总数测定 （一）实验目的： (1)了解和学习水中细菌总数 (2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法 （二)实验原理 水中的病菌如伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、钩端螺旋体等主要来自人和动物的粪便及污染物。因此，粪便管理在控制和消灭消化道传染病有重要意义。但直接检查水中的病原菌是比较困难的，常用测定细菌总数和大肠杆菌菌群数，来判断水的污染程度，目前我国规定生活饮用水的标准为1m1水中细菌总数不超过100个, 超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，水中可能有病原菌存在。 所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。 (三)实验器材 (1) 菌落总数的测定： 1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。 2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。 （四）实验方法 (1)水样的采集： 1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。 2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。 (2)细菌总数的测定： 1)水样稀释及培养： ①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释： ⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000 三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。 —配位滴定法〖实验目的〗 (1)了解水的硬度的表示方法。 (2)掌握EDTA法测定水中钙、镁含量的原理和方法。 (3)正确判断铭黑T和钙指示剂的滴定终点。 〖实验用品〗 仪器：酸式滴定管、容量瓶、移液管、锥形瓶、烧杯、细口试剂瓶、量筒。 药品： EDTA、CaCO 3、MgCl 2 ·H 2 O、固体pH=10氨性缓冲溶液、HCl水溶液、NaOH溶液 络黑T指示剂：将1g铬黑T指示剂与100g干燥的纯NaC1混合，研细备用。 钙指示剂：将1g钙指示剂与100g干燥的纯NaC1混合，研细备用。 试样：自来水、矿泉水 〖实验原理〗 水的总硬度通常是指水中钙、镁的总量。各国对水的硬度表示方法有所不同。我国采用Ca2+、Mg2+总量折合成CaO来计算水的硬度，硬度单位以度(°)表示，一个硬度单位代表1L 水中含10mgCaO。 一般饮水的总硬度不得超过25°，各种工业用水对硬度有不同的要求，如酿酒以硬水为宜，锅炉用水则必须是软水。因此，测定水的总硬度有很重要的实际意义。 用EDTA法测定水的总硬度，即在PH=10的氨性缓冲溶液中，以络黑T(EBT)作为指示剂，用EDTA标准溶液直接滴定水中的Ca2+、Mg2+，直到溶液由酒红色变为纯兰色，即为终点。反应式如下： 滴定前：EBT+M(Ca2+，Mg2+ )=M-GEBT (兰色) (酒红色) 滴定开始到等量点前：M+EDTA=M-EDTA 等量点：M-EBT+EDTA=M-EDTA+EBT (酒红色) (兰色) 滴定时，Fe3+、Al3+等干扰离子可用三乙醇胺予以掩蔽，Ca2+、pb2+、Zn2+等重金属离子可用KCN、Na 2 S或巯基乙酸予以掩蔽。 铬黑T与Ca2+络合较弱，所呈颜色不深，终点变化不明显。当水样中的Mg2+的含量较低时(一般要求相对Ca2+来说须有5% Mg2+存在)，用铬黑T指示剂往往得不到敏锐的终点。这时，可在加铬黑T前于被滴定液中加入适量Mg2+—EDTA溶液(也可在标定前于EDTA溶液中加入适量Mg2+)，使终点变色敏锐。 钙硬度测定原理与总硬度测定原理相同，但溶液的PH值应大于12，使Mg2+生成Mg（OH）2 沉淀，所用的指示剂为钙指示剂。滴定达终点时，溶液也是由酒红色变为兰色。 镁硬度可由总硬度减去钙硬度而得到。 根据下式计算水的总硬度： 水的总硬度(CaOmg·L-1): (°)=c(EDTA)*V 1(EDTA)*M(CaO)*(103mg*g-1)/[V(H 2 O)*(10mg*g-1)] 钙硬度(CaOmg·L-1): (°)=c(EDTA)*V 2(EDTA)*M(CaO)*(103mg*g-1)/[V(H 2 O)*(10mg*g-1)] 镁硬度(CaOmg·L-1)=总硬度-钙硬度 式中：c(EDTA)为EDTA标准溶液的浓度；V 1(EDTA)为测总硬度时耗EDTA的体积(ml)；V 2 (EDTA) 为测钙硬度时，所耗EDTA的体积(ml)；V 水 为测定时所取水样的体积(ml)。〖操作步骤〗 1 0.02mol·L-1EDTA标准溶液的配制与标定 (1)0.02mol·L-1EDTA标准溶液的配制 水中细菌总数的检测 一、实验的目的要求 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 二、实验原理 细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标。我国现行的生活饮用水标准检验方法GB5750—85规定水样中细菌总数测定是1ml水样在普通营养琼脂培养基中37℃经24小时培养所生长的细菌菌落的总数。所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。 本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 平板菌落计数法的优点： 能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品和生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。 缺点：手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。 生活饮用水细菌卫生标准 我国饮用水卫生标准： ≤3个大肠菌群/1L饮水，≤100个细菌总数/1ml饮水 三、实验仪器和材料 1、高压蒸汽灭菌锅、恒温箱、冰箱、无菌接种间。 2、消毒酒精、消毒水。 3、试管、三角瓶、平皿、刻度吸管、涂布器等（实验前包扎灭菌处理好备用） 4、培养基 蛋白胨10g 牛肉膏3g 氯化钠5g 琼脂10~20g 蒸馏水1000ml 制备方法： 按照实际的需要量，按上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH 为7.4~7.6，，分装于玻璃容器中，用高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌20min，倒制成平板后储存于冷处备用。 5、水样：自来水、中水。 四、实验内容： （一）、培养基的制备： 实验前事先准备好培养基平板（方法见上），每小组2-4个平板。（二）、取水样： 1、自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌， 打开龙头放水1-2分钟，用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 2、纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用 实验目的：测量水中钙、镁离子的总含量 1.了解配位滴定法基本原理和方法。 2.了解水的硬度的概念及其表示方法。 实验原理 含有钙、镁离子的水叫硬水。测定水的总硬度就是测定水中钙、镁离子的总含量，可用EDTA配位滴定法测定： 滴定前： M + EBT M-EBT (红色) 主反应： M + Y MY 终点时： M-EBT + Y MY + EBT (红色) （蓝色） 滴定至溶液由红色变为蓝色时，即为终点。 滴定时，Fe3+、Al3+等干扰离子可用三乙醇胺予以掩蔽；Cu2+、Pb2+、Zn2+等重属离子，可用KCN、Na2S或巯基乙酸予以掩蔽。 水的硬度有多种表示方法，本实验要求以每升水中所含Ca2+、Mg2+总量（折算成CaO的质量）表示，单位mg?L-1。 器材和药品 1.器材天平（0.1g、0.1mg），容量瓶（100mL），移液管（20mL），酸式滴定管（50mL），锥形瓶（250mL）等。 2.药品 HC1（1∶1），乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y?2H2O，A.R.），碱式碳酸镁[Mg（OH）2?4MgCO3?6H2O，基准试剂]，NH3-NH4Cl缓冲溶液（pH=10.0），三乙醇胺（1∶1），铬黑T指示剂（0.2%氨性乙醇溶液）等。 实验方法 一、Mg2+标准溶液的配制（约0.02mol?L-1） 准确称取碱式碳酸镁基准试剂0.2~0.25g，置于100mL烧杯中，用少量水润湿，盖上表面皿，慢慢滴加1∶1 HC1使其溶解（约需3~4mL）。加少量水将它稀释，定量地转移至100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 其浓度计算： 二、EDTA标准溶液的配制与标定 1.EDTA标准溶液的配制（约0.02mol?L-1） 称取2.0g乙二胺四乙酸二钠（Na2H2Y?2H2O）溶于250mL蒸馏水中，转入聚乙烯塑料瓶中保存。 2.EDTA标准溶液浓度的标定 用20mL移液管移取Mg2+标准溶液于250mL锥形瓶中，加入10mL氨性缓冲溶液和3~4滴EBT指示剂，用0.02mol?L-1EDTA标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为蓝色即为终点。平行标定3次。EDTA浓度计算：，取三次测定的平均值。 三、水的总硬度测定 用20mL移液管移取水样于250mL锥形瓶中，加氨性缓冲溶液6mL，1∶1三乙醇胺溶液3mL，EBT 指示剂3~4滴，用EDTA标准溶液滴定，至溶液由紫红色变为蓝色即为终点。平行测定3次。 水的总硬度计算：，取三次测定的平均值。 2 实验原理 2.1 乙二胺四乙酸（简称EDTA，常用H4Y表示）难溶于水，常温下其溶解度为0.2g·L-1，在分析中不适用，通常使用其二钠盐配制标准溶液。乙二胺四乙酸二钠盐的溶解度为120g·L-1，可配成0.3mol·L-1以上的溶液，其水溶液pH=4.8，通常采用间接法配制标准溶液。 标定EDTA溶液常用的基准物有Zn、ZnO、CaCO3、Bi、Cu、MgSO4·7H2O、Hg、Ni、Pb。等。通常选用其中与被测组分相同的物质作基准物，这样滴定条件较一致。 EDTA溶液若用于测定石灰石或白云石中CaO、MgO的含量，则宜用CaCO3为基准物。首先可加HCl溶液与之作用，其反应如下： CaCO3+2HCl═CaCl2+H2O+CO2↑ 水中细菌总数的检测 1. 实验目的 1、学习并掌握水的细菌学检测方法 2、了解水质状况与细菌数量在饮用水检测中的重要性。 2. 菌落总数standard plate-count bacteria 水样在营养琼脂上、有氧条件下37°C培养48 h后，所得1 mL水样所含菌落的总数。细菌总数是评价水质污染程度的主要卫生指标，所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染。由于结果不能说明污染的来源，因此必须结合总大肠菌群数来判断污染源和安全程度。 3. 培养基与试剂 2.1 营养琼脂成分 2.2 制法：根据实际需要量，按照上述配方称取各成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4~7.6，分装于玻璃容器中（如用含有较多杂质的琼脂，应先过滤。），经10 3.43 kPa（121°C,15 lb）湿热灭菌20 min，储存于冷暗处备用。 4. 仪器和材料 仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌箱、水热恒温培养箱、电炉、天平、冰箱。材料：灭菌平皿（直径9 cm）、灭菌试管、刻度吸管、三角烧瓶、采样瓶、酒精灯、消毒水、镊子、试管架等。放大镜或菌落计数器、pH计或精密pH试纸、火柴或打火机。 5. 样品采集 自来水的取样：先将自来水龙头用酒精棉擦拭，再用酒精灯火焰灭菌，打开龙头放水3-5 min，用无菌空三角瓶接取水样200 ml。 纯净水取样：用消毒酒精棉擦拭纯水机出口后，先放走部分水，再用无菌空三角瓶接取水样200毫升。 地表水的取样：应取距水面10—15 cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。 6. 检验步骤 生活饮用水（自来水、纯净水）：以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1 mL充分混匀的水样，注入灭菌培养皿中，倾注约15 ml已融化并冷却到45°C左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注培养基作为空白对照。 待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36°C±1°C条件下连续培养48 h，进行菌落计数，即为1 ml水样中的菌落总数。 水源水：以无菌操作方法吸取1 ml充分混匀的水样，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:10稀释液。 吸取1:10稀释液1 ml，注入盛有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀呈1:100稀释液。按同法依次稀释成1:1000、1:10000稀释液备用。如此递增稀释一次，必须更换一支刻度吸管。用灭菌吸管吸取1 ml未稀释的水样和2~3个适宜稀释度的水样，分别注入灭菌培养皿内， 细菌总数的测定（平皿计数法） 1.概述 本法适用于生活用水、循环冷却水及其它水中细菌总数的测定。也适用于反渗透脱盐水中细菌总数的测定。 敞开式循环冷却水系统细菌总数的要求：≤1×105个/mL。 2.方法介绍 本法采用25号浮游生物网收集循环冷却水中的黏泥，所得的黏泥用石英砂充分研磨使细胞分散，再利用平皿计数技术在（29±1）℃培养72h来测定黏泥中的细菌总数。 3.试剂和材料 3.1 牛肉膏，生化试剂。 3.2 蛋白胨，生化试剂。 3.3 NaCl. 3.4琼脂，生物试剂。 3.5 NaOH溶液，40g/L。 3.6 HCl，1＋11溶液。 3.7 乙醇溶液，75％。 3.8 牛皮纸。 3.9 医用脱脂棉。 3.10 医用脱脂纱布。 3.11 石英砂，210～150μm 。 4.仪器和设备 4.1 25号浮游生物网。 4.2 量筒，25mL和500mL。 4.3 转子流量计。 4.4 瓷研钵。 4.5 无菌箱（室）或超净工作台。 4.6 蒸汽压力灭菌器。 4.7 生化培养箱。 4.8 电热干燥箱，温度可控制在[（60～280）±2]℃. 4.9 刻度吸管，1mL和5mL。 4.10 磨口三角瓶，100mL。 4.11容量瓶，1000mL。 4.12 培养皿，d90mm 。 4.13 三角瓶，500mL。 4.14 搪瓷量杯，1000mL。 5.试验前的准备 5.1 培养基的制备 称取下列试剂：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂15.0g。将上述试剂加水约950mL，在电炉上加热溶解后，趁热用四层医用脱脂纱布过滤于搪瓷量杯中，并用热水补充至1000mL。用NaOH溶液或HCl溶液调节pH值至7.2±2，并分装在500mL三角瓶中，每瓶分装量不超过其总容量的2/3。塞上棉塞，用牛皮纸把瓶口包好，用蒸汽压力灭菌器在（121±1）℃下灭菌15min,此为灭过菌的培养基。 自来水总硬度及钙镁离子含量的测定 一、教学要求 1、练习移液管、滴定管的使用； 2、学会EDTA法测定水的总硬度的原理和方法； 3、掌握铬黑T指示剂及钙指示剂的应用及指示剂终点的原理； 4、了解金属指示剂的特点 5、掌握配位滴定过程，突跃范围及指示剂的选择原理。 二、预习内容 1、EDTA滴定钙镁离子的原理； 2、金属指示剂的应用及变色的原理； 3、移液管的规格、使用； 4、滴定管的规格、洗涤、涂油、润洗等操作步骤； 三、基本操作 1、移液管的使用 （1）定义 移液管是用于准确量取一定体积溶液的量出式玻璃量器。 （2）润洗： 使用前用吸水纸将尖端内外的水除去，然后用待吸液润洗三次：左手持洗耳球，右手拇指和中指拿住标线以上部分，将移液管管尖插入约溶液1～2cm，将待吸液吸至球部1/4处，移出，荡洗，弃去（切记从尖口放出,应保持上管口和食指干燥）。 （3）移液： 左手持洗耳球，右手拇指和中指拿住标线以上部分，将移液管管尖插入约溶液1～2cm，将待吸液吸至标线以上，迅速移去洗耳球，同时用右手食指堵住管口，左手改拿盛待吸液的容器。然后，将移液管往上提起，使之离开液面，并将原深入溶液部分沿容器内部轻转两圈，以除去管壁上的溶液。使容器倾斜30度，其内壁与移液管尖紧贴，同时右手食指微微松动，使液面缓慢下降，直到管内溶液的弯月面与标线相切，这时应立即用食指按紧管口，移开待吸液容器，左手改拿接受溶液的容器，并将接受容器倾斜，使内壁紧贴移液管尖，成30度左右，然后放松右手食指，使溶液自然顺壁流下，待液面下降到管尖后，等15秒左右，移出移液管。（除特别注明，管尖残留溶液不吹入接受容器中）。 用移液管吸取溶液从移液管放出溶液 钙离子的测定——EDTA 滴定法 本方法适用于循环冷却水和天然水中钙离子的测定。 1．0 原理 钙黄绿素能与水中钙离子生成莹光黄绿色络合物，在PH ＞12时，用EDTA 标准溶液滴定钙，当接近终点时，EDTA 夺取与指示剂结合的钙，溶液莹光黄绿色消失，呈混合指示剂的红色，即为终点。 2．0 试剂 2．1 1+1盐酸溶液 2．2 20%氢氧化钾溶液。 2．3 钙黄绿素酚酞混合指示剂 称取钙黄绿素酚酞置于研钵中，再加入20g 氯化钾，研细混匀，贮于广口瓶中。 2．4 LEDTA 标准溶液 3．0 仪器 3．1 滴定管：25mL 3．2 移液管：5mL 4．0 分析步骤 吸取经中速滤纸干过滤的水样50mL ，移入250mL 锥形瓶中，加1+1盐酸3滴，混匀，加热煮沸半分钟，冷却至50℃以下加5mL20%氢氧化钾溶液，再加约80mg 钙黄绿素酚酞混合指示剂，用L EDTA 标准溶液滴定至莹光黄绿色消失，出现红色即为终点。 5．0 分析结果的计算 水样中钙离子含量X （毫克/升，以CaCO3计），按下式计算： X=W V M V 10008.100??? 式中： V ——滴定时EDTA 标准溶液消耗体积，毫升； M ——EDTA 标准溶液浓度，摩尔/升； Vw ——水样体积，毫升； ——碳酸钙摩尔质量，克/摩尔。 6．0 注释 6．1 若测定时有轻度返色，可滴至不返色为止。 6．2 若返色严重可用慢速滤纸对水样进行“干过滤”。 6．3 也可采用钙指示剂或紫脲酸铵作指示剂。 7．0 允许差 水中钙离子含量在500mg/L （以CaCO3计）时，平行测定两结果差不大于2mg/L 。 8．0 结果表示 取平行测定两结果算术平均值，作为水样的钙离子含量。 微生物综合实验水中细菌总数的测定 一、实验目的 1．学习水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。 2．了解和掌握平板菌落计数的原则。 3．复习、巩固微生物实验的各单元操作。 二、实验原理 水中细菌总数的测定是进行水质检验的必要项目之一，主要作为判定饮用水、水源水、地表水等被污染程度的标志。 本试验采用平板菌落计数技术来测定水中的细菌总数。该法是根据在固体培养基上所形成的菌落来进行计数。菌落总数是指在一定条件下，1 mL水样所生长出来的细菌菌落的总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基和在一种条件下，使水中的所有细菌均能生长繁殖，因此，这种方法所得到的结果只是一种近似值。目前一般采用营养琼脂培养基，在需氧条件下，37℃培养36-48 h，所得到的细菌绝大部分是腐生性的嗜中温性需氧菌和兼性厌氧菌。 三、实验材料 1．检样：矿泉水等饮用水、河水、湖水、井水等。 2．培养基：营养琼脂培养基（附录Ⅱ-1.3） 3．仪器与其它用具：三角烧瓶，广口瓶，吸管，培养皿，试管，培养箱等。 四、实验步骤 1. 水样的采集与处理 ⑴饮用水：采样前，先用酒精棉球擦拭瓶口灭菌，以灭菌移液管或移液枪取水样。 ⑵河水、湖水、池水：应取距水面10 cm~15 cm的深层水样。先将已灭菌的带玻璃塞的广口瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来使瓶口向上，拔去瓶塞，待水盛满后，将瓶塞盖好，再将瓶子从水中取出。在一定深度采水样时，需要用特制的采水器（图14-14）。采水器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可按需要坠入一定深度。瓶盖上系有一绳索，拉吊绳索即可打开瓶盖，待水样瓶中水盛满后，放松绳索，即自行盖上瓶盖。水样采集后，将水样瓶取出，并立即用无菌棉塞或灭菌胶塞塞好瓶口，以备检验。 水样采集后应立即检验，如需要保存或运送，应采取冰镇措施，但一般要求不得超过4 h。 图14-14 采水器 1-开瓶绳索2-铁框3-瓶盖4-水样瓶5-沉坠 2. 细菌总数的测定 ⑴饮用水： ①用灭菌吸管吸取0.2 mL水样，涂布于事先准备好平板中，共做2个平皿。 ②另取一空的灭菌培养皿，倾注15 mL~20 mL牛肉膏蛋白胨培养基，作为空白对照。 ③将平皿倒置于37℃培养箱内，培养24 h，进行菌落计数。 ⑵河水、湖水、池水等： 目的 1、了解水的硬度的测定意义和水硬度常用表示方法。 2、掌握EDTA法测定水中Ca2+、Mg2+含量的原理和方法。 原理 工业中将含有较多钙、镁盐类的水称为硬水，水的硬度是将水中Ca2+、Mg2+的总量折合成CaO或CaCO 3 来计算。每升水中含1mgCaO定为1度，每升水含10mgCaO 称为一个德国度（°）。水的硬度用德国度（°）作为标准来划分时，一般把小于4°的水称为很软水，4°～8°的水称为软水，8°～16°的水称为中硬水，16°～32°的水称为硬水，大于32°的水称为很硬水。 用EDTA进行水的总硬度及Ca2+、Mg2+含量的测定时可先测定Ca2+、Mg2+的总量，再测定Ca2+量，由总量与Ca2+量的差求得Mg2+的含量，并由Ca2+、Mg2+总量求总硬度。 Ca2+、Mg2+总量的测定：用NH 3-NH 4 Cl缓冲溶液调节溶液的PH=10，在此条件下， Ca2+、Mg2+均可被EDTA准确滴定。加入铬黑T指示剂，用EDTA标准溶液滴定。在 滴定的过程中，将有四种配合物生成即CaY、MgY、MgIn、CaIn，它们的稳定性次序为：CaY﹥MgY﹥MgIn﹥CaIn（略去电荷） 由此可见，当加入铬黑T后，它首先与Mg2+结合，生成红色的配合物MgIn，当滴入EDTA时，首先与之结合的是Ca2+，其次是游离态的Mg2+，最后，EDTA夺取与铬黑T结合的Mg2+，使指示剂游离出来，溶液的颜色由红色变为蓝色，到达指示终点。设消耗EDTA的体积为V 1 。 Ca2+含量的测定：用氢氧化钠溶液调节待测水样的PH=12，将Mg2+转化为Mg(OH) 2沉淀，使其不干扰Ca2+的测定。滴加少量的钙指示剂，溶液中的部分Ca2+立即与之反应生成红色配合物，使溶液呈红色。当滴定开始后，随着EDTA的不断加入，溶液中的Ca2+逐渐被滴定，接近计量点时，游离的Ca2+被滴定完后，EDTA则夺取与指示剂结合的Ca2+使指示剂游离出来，溶液的颜色由红色变为蓝色，到达指示终 点。设滴定中消耗EDTA的体积为V 2 。 仪器及药品 仪器：50ml酸式滴定管，50ml移液管，250ml锥形瓶，10ml量桶。 药品：10%NaOH溶液,PH=10的缓冲溶液，铬黑T指示剂（将1g铬黑T指示剂与100g分析纯NaCl混合、磨细，装瓶备用），EDTA标准溶液，钙指示剂（1g钙指示剂与100g分析纯NaCl混合、磨细，装瓶备用）。 内容及步骤 用移液管吸取水样于250ml三角瓶中，加5ml PH=10的缓冲溶液，再加少许（约）铬黑T混合指示剂，用EDTA标准溶液滴定至酒红色变为纯蓝色。记录EDTA 用量V 1 （ml）。重复1～2次。 另取水样于250ml锥形瓶中，加入5ml10%NaOH溶液摇匀，加入少许（约）钙 指示剂，用EDTA标准溶液滴定至酒红色变为纯蓝色。记录EDTA用量V 2 （ml）。重复1～2次。按下式计算： C (EDTA)×V 2 ×M(Ca)×1000 ρCa(mg/L)= -------------------------- C (EDTA)×(V 1 -V) 2 ×M(Mg)×1000 ρMg(mg/L)= -------------------------------水中钙镁离子含量测定.doc
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