常用的微生物分离纯化方法
实验二微生物的分离纯化_图文_图文
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
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内容提要
• 分离 • 纯化 • 形态观察
（1）接种
• 半固体培养基：穿刺接种 • 液体培养基接种 • 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜
面划线接种 • 浅盘固体接种
划线接种注意要点
• 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触, 以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
（4）菌种保藏
• 最常见的保藏方法：斜面 • 细菌的保藏：甘油保藏 • 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏
菌种保藏的方法
菌 种 保 藏 方 法
连续在培养基上（内）移种
生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种
固体斜面
湿法 半固体琼脂柱
真菌分离
• 利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是 利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此 限制真菌的迁涉生长。
• 一般采用PDA培养基 • 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离。 • 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分
离培养时应加以考虑。
（2）纯化
2、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l 、2天。
3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。
微生物的计数及分离纯化
微生物的计数
一、目的要求
1、了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，掌握 显微镜下直接计数的技能。
2、学习平板菌落计数的基本原理和方法
二、实验原理
测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微 镜直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液， 如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢 子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽 （Petrof Hausser）细菌计数板。
血球计数板
是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成 3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分 隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的 刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格 用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另 一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双 线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不 管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即 计数区都由400个小方格组成。
(2)点燃酒精灯。 (3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面 上。操作必须按无菌操作法进行。
接种的步骤
1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其 他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向 操作者，并使它们位于水平位置，如图。 2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料 管盖，以便接种时拔出。 3)取接种环 右手拿接种环(如握钢笔 一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然 后将有可能伸入试管的其余部分均灼 烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。
微生物的分离纯化2掌握微生物斜面接种培养的方法和微生物无菌操作计数1平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞通过在分区的平板表面做多次划线稀释形成较多的独立分布的单个细胞经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落通常认为这种单菌落就是某个微生物的纯种2平板划线分离对细菌酵母菌较为适宜而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化
微生物发酵产物的纯化与提取技术
微生物发酵产物的纯化与提取技术微生物发酵技术在生物医学和制药领域中具有重要地位，可以制备出多种生物活性产物，如抗生素、激素、酶、细胞因子和疫苗等。
这些产物广泛用于医疗、环保、农业和制造业等领域。
其中，微生物发酵产物的纯化和提取技术是制备过程中的重要环节，可以降低产品成本、提高产品质量和效益。
本文将介绍微生物发酵产物的纯化与提取技术及其应用。
一、微生物发酵产物的纯化技术1. 色谱法色谱法是一种基于样品分子在不同介质中的亲和性和相互作用力差异而分离纯化的方法。
包括大小分子筛法、离子交换法、亲和层析法、凝胶过滤法和气相色谱法等。
这些方法常用于制备高纯度、高效率的蛋白质、核酸、多糖和小分子化合物等。
2. 逆流式管柱法逆流式管柱法是一种通过透析膜和离子交换树脂对混合产物进行分离、纯化的方法。
该方法具有操作简单、高效率、高选择性和易于自动化的优点，适用于制备高纯度的生物活性物质。
3. 溶剂萃取法溶剂萃取法是一种基于样品分子在溶剂中的亲和性差异来分离产物的方法。
溶剂萃取法适用于对于可溶性较好、有机相和水相分配系数大的混合产物进行分离、纯化。
常用的溶剂有乙酸乙酯、苯、氯仿和正己醇等。
二、微生物发酵产物的提取技术1. 超声波提取法超声波提取法是一种通过超声波振荡原理来破坏细胞壁，并将目标产物提取至溶液中的方法。
该方法具有操作简单、高效率、无需使用有毒有害溶剂和耗时的传统提取方法的优点，适用于提取蛋白质、酶、多糖、黄酮类和生物碱等。
2. 溶菌酶提取法溶菌酶提取法是一种通过水解细菌细胞壁中的脂多糖骨架，将目标产物溶解出来的方法。
该方法具有选择性好、成本低、规模化生产能力强的优点，适用于提取抗生素、酶和蛋白质等。
3. 水萃取法水萃取法是一种基于植物纤维素和蛋白质等产物在水相中的亲和性和相互作用力差异而进行的提取方法。
水萃取法具有操作简单、效率高、物料成本低廉和对人体无毒无害的特点，适用于提取多糖、酶、黄酮类、生物碱和氨基酸等。
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
环境中微生物的检测和分离纯化实验报告
环境中微生物的检测和分离纯化一．实验原理1.微生物的分离与纯化土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。
微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。
2.平板菌落计数法将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。
二．实验材料与试剂1.土壤稀释溶液2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。
三．实验步骤（一）.无菌平板制备1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板（二）.周围环境中微生物的检测2.取一平板，分成6个区，做好标记。
同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头在六个区上涂抹。
（平板1）3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。
（平板2）4.在培养基上方抖动头发数次。
（平板3）5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。
（平板4）6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。
（平板5）7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1分钟。
（平板6）8.取一平板，打开盖，咳几下。
（平板7）（三）.从土壤中分离微生物1.采土样2.制备土壤稀溶液3.涂布吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟4.培养将培养基平板倒置于37℃下培养24小时5.菌落计数四．实验结果1.平板1：从未洗到用酒精消毒总体趋势是菌落数越来越少，用自来水洗过和用洗手液洗过一遍的菌落数差不多；平板2：旧纸币和硬币的菌落数要多；平板3：抖头发的地方附近长出许多菌落；平板4：自来水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和当时划线的形状一样，再其次是豆浆；平板5：划线的地方长出许多菌落；平板6：放在试验台上的平板长出各种形状的菌斑菌块，在酒精灯旁的基本没有菌落；平板7：咳几下的基本没有菌落。
微生物分区划线实训报告
一、实训目的本次实训旨在通过分区划线法，学习微生物的分离培养技术，掌握微生物纯化分离的基本原理和方法，提高实验操作技能，为后续微生物学实验和科研工作打下基础。
二、实训内容1. 实验原理分区划线法是一种常用的微生物分离纯化方法，其原理是利用微生物在固体培养基上生长的菌落会逐渐扩散，但由于营养物质的限制，菌落不会无限扩大，从而在划线过程中形成单个菌落，实现微生物的纯化。
2. 实验材料- 细菌培养箱- 细菌接种环- 细菌接种针- 琼脂培养基- 细菌样本- 灭菌器材- 实验记录本3. 实验步骤1. 准备工作：将琼脂培养基倒入培养皿中，待凝固后，用无菌镊子将培养皿翻转放置。
2. 划线：用接种环取适量细菌样本，在培养基表面划出一条或多条平行线，划线长度约为2-3cm。
3. 划线操作：将接种环在酒精灯上灼烧，待冷却后，蘸取细菌样本，沿划线方向轻轻划线，每次划线后需将接种环在酒精灯上灼烧消毒。
4. 观察与记录：将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24-48小时，观察菌落生长情况，并记录菌落特征。
5. 分纯：用接种环挑取单个菌落，转接至新的培养基上，重复上述步骤，直至获得纯化菌株。
4. 实验结果与分析通过分区划线法，成功分离纯化了目标菌株。
观察菌落特征，发现该菌株为革兰氏阳性菌，菌落呈圆形、光滑、边缘整齐，颜色为白色。
三、实训总结1. 实训收获通过本次实训，我掌握了分区划线法的基本原理和操作步骤，提高了实验操作技能，为后续微生物学实验和科研工作打下了基础。
2. 实验注意事项- 操作过程中应严格无菌操作，避免污染。
- 划线时应保持接种环清洁，避免菌落交叉污染。
- 观察菌落时，注意观察菌落形态、颜色、大小等特征，为后续鉴定提供依据。
3. 改进建议- 在实验过程中，可尝试不同划线方法，如连续划线、交叉划线等，比较其优缺点。
- 可增加实验次数，提高实验成功率。
- 在实验过程中，注重与同学交流，共同探讨实验问题。
四、实训体会通过本次实训，我深刻体会到微生物实验操作的重要性。
微生物实验—三平板分离技术1
实验三微生物分离纯化技术一、目的要求掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作二、实验材料1、菌种2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿三、实验原理平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。
浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。
最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。
涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。
四、实验过程（1）稀释平板法A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。
先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。
B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边；C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。
菌种分离纯化的方法
菌种分离纯化的方法以菌种分离纯化的方法为标题，本文将介绍菌种分离纯化的方法及其步骤。
菌种分离纯化是微生物学研究中常用的一种技术手段，通过分离和纯化菌株，可以获得单一的菌种用于后续的研究和应用。
一、菌种分离的基本原理菌种分离的基本原理是将混合的微生物菌群分离成单一的菌株。
菌种分离的方法有很多种，常用的有单菌落分离法、稀释涂布法、稀释液滴法等。
这些方法都是基于微生物菌株的生长特性和培养条件的不同，通过合理设计实验步骤和培养基，使目标菌株能够单独生长并形成可见的菌落。
二、菌种分离纯化的步骤1. 样品采集：首先需要从环境中采集到含有目标菌株的样品。
样品可以是土壤、水样、食品、动植物组织等，根据研究目的和样品特点选择合适的采集方法。
2. 制备培养基：根据目标菌株的特性和需求，选择合适的培养基配方，并进行消毒和制备。
培养基的选择应考虑到菌株的营养需求、生长条件和特殊要求。
3. 稀释涂布法：取少量样品加入到培养基中，经过适当的稀释后，用移液管或铁环在培养基表面均匀涂布，使菌落能够单独生长。
4. 单菌落分离法：根据菌落的形态、颜色和大小等特征，选择单一的菌落转移到新的培养基上。
可以使用鉴别培养基或显微镜观察菌落的特征，以确保分离的菌株纯度。
5. 重复分离：为了确保分离得到的菌株的纯度，可以进行多次的分离操作。
将单一菌落进行二次分离或多次传代培养，直到得到纯种的菌株。
6. 菌种保存：分离纯化后的菌种可以进行保存，常用的保存方法有冷冻保存和冷冻干燥保存。
冷冻保存需要将菌种在液氮中冷冻保存，冷冻干燥保存则是将菌种在低温下干燥保存。
三、菌种分离纯化的注意事项1. 采集样品时要注意卫生和无菌操作，避免外源菌的污染。
2. 制备培养基时要严格按照配方和操作规程进行，确保培养基的质量和无菌性。
3. 分离过程要注意避免交叉污染，使用无菌操作和无菌工具。
4. 分离后的菌株要进行鉴定和鉴别，确保其为目标菌株。
5. 分离纯化后的菌株要进行保存，以备后续使用。
生物发酵工程中分离和纯化的技术
生物发酵工程中分离和纯化的技术生物发酵工程是指利用微生物、细胞及其代谢产物进行某些化学过程的工程学科。
在生物发酵工程中，分离和纯化技术是至关重要的步骤，通过这些技术可以分离出所需的微生物、细胞或产物，并对其进行纯化和结构分析，以实现其在工业上的广泛应用。
一、分离技术生物发酵过程中，细胞或微生物的生长和代谢过程会产生大量的代谢产物，其中包括目标产物和非目标产物。
在分离技术中，目标产物的选择和富集是至关重要的。
常用的分离技术包括离心、过滤、超滤和萃取等。
离心是利用离心力将混合物中不同密度的组分分开的一种分离技术。
在生物发酵工程中，利用离心技术可以将微生物和细胞分离出来，以进行后续的培养和富集。
此外，离心技术还可以用于大分子物质的分离和纯化，如蛋白质、DNA等。
过滤是将混合物通过不同的过滤器进行分离的一种分离技术。
根据过滤器的孔径大小不同，可以将不同大小的分子筛选出来。
在生物发酵工程中，利用过滤技术可以将微生物和其代谢产物从培养基中分离出来，达到富集目的。
超滤是利用膜过滤的方式进行分离的一种技术。
在超滤过程中，通过选择合适的膜孔径和压力，可以将不同分子量的目标产物分离出来，并进行纯化。
超滤技术在生物发酵工程中的应用非常广泛，可以富集蛋白质、酶、激素等大分子物质。
萃取是利用溶剂的不同亲水性或亲油性，将混合物中的目标组分分离出来的一种技术。
在生物发酵工程中，萃取技术可以用于分离微生物培养液中的小分子化合物和产物。
二、纯化技术在生物发酵工程中，分离是实现目标产物富集的重要手段，但是分离出来的产物并不一定是纯品。
通过纯化技术，可以将目标产物从杂质中进一步纯化和提纯，以达到最终的纯度要求。
常用的纯化技术包括电泳、层析、析出和结晶等。
电泳是将混合物中的分子在电场的作用下按照大小和电性进行分离的一种技术。
在生物发酵工程中，电泳技术可以用于蛋白质、核酸和酶等大分子物质的纯化。
层析是利用分离材料将混合物中的组分分离的一种技术。
实验(二)土壤中微生物的分离纯化及观察
2.稀释:
0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml
原样
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
0.2ml
0.2ml
0.2ml
3.取样
10-4
10-5
10-6
4.倒平板：倒入融化后冷却至45℃的培养基15～２５ml， 置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
么？
当你的平板上长出的菌落不是均匀分散的而是集中在
一起时，你认为问题出在哪里？
用倾注法和涂布法计数，其平板上长出的菌落有何不
同？为什么要培养较长时间（48h）后观察结果？
倾注法
涂布法
倒平板
a 皿加法
b手持法
细 菌Leabharlann 霉菌放线菌实验内容
一、稀释涂布平板法（全组完成）
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 ：涂布10-3、10-4、10-5三个剃度，每个剃度两 块平板 高氏Ⅰ号培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度两块平板 马丁氏（孟加拉红）培养基：涂布10-2、10-3、10-4三个剃度，每个剃度 两块平板
器材
分离源：自采集土壤样品
培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号 培养基、马丁氏（孟加拉红）培养基 溶液或试剂 盛4.5ml无菌水的试管，盛90ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。
仪器或其他用具 振荡器，无菌培养皿，无菌 吸管，接种环，电磁炉，培养箱，吸耳球等。
一、稀释涂布平板法（全组完成）
1、编号：取无菌平皿１８个。另取无菌水４支，依次 标明10-2、10－3、10-4、10-5。
0.5ml
各4.5ml 无菌水