第八章 植物细胞培养及次生物质生产

植板率＝
每个平板接种的细胞总数
细胞平板培养 (plating culture)
• 优点：
– 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显 微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞 株筛选和突变体筛选的常用方法。
– 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操 作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、 分化、生理生化、遗传变异、次生代谢 产物合成等。 • 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造 成毒害或影响组织吸收。
• 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观 一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒 状，疏松易碎
悬浮系的建立与培养
callus
1g/10ml medium
150~250ml flask
100~120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
– 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬 浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长 和分裂所需的特殊代谢物。 – 基本培养基成分的调节视不同的培养目 的而定 培养基设计时，一般均以诱导愈 伤组织形成的培养基为基础进行调整。 常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 – 植物激素和其他附加成分的应用。
影响悬浮细胞生长的因素
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 • 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态，因此，要达到完全同 步化是十分困难的。 • 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 代谢以及生理生化状态等复杂化。 • 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化。 什么措施？
Isolation protoplasts
细胞悬浮培养的建立
愈伤组织的诱导
悬浮系的建立与继代培养 悬浮细胞的生长动态
悬浮细胞同步化
愈伤组织的诱导
• 选择适宜的外植体： – 幼胚 – 下胚轴 – 子叶 • 选择适宜的培养基：MS，B5，N6 – 较高激素浓度 – 必要的附加物质
适宜悬浮培养
适宜再生植株
80 rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系特征
• 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般 在30～50个细胞以下。 • 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相 同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培 养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色。 • 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～ 3天便可增加一倍。
细 胞 周 期
饥饿法
• 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能 合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不 能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿 法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 – 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 – 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化 细胞。 • 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时， 细胞分裂又可重新恢复。
看护培养（nurse culture）
• Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 • 优点：简便易行，效果好。 • 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长 过程。
微室培养(microchamber culture)
• 在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细 胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖 形成细胞团的方法。由Jones等在1960年 设计的。 • 优点：可对培养细胞连续进行显微观察， 了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 • 缺点：培养基少，营养和水分难以保持， pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 • 细胞起始密度：30～80个/室。
– 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液
与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然 后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm 左右。
细胞平板培养（plating culture)
• 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植 板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细 胞总和中所占的比例。
每个平板形成的细胞团数
• 悬浮培养 是细胞培养的基本方法，是将单
个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行 培养增殖的技术。 • 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。
细胞悬浮培养的应用
Suspension cells Plants Artificial seeds Mutation select Secondary pro大小 • 方法 – 常规分选方法是梯度离心 – 精细的分选可采用流式细胞仪 • 优点 – 操作简单 – 分选细胞维持了自然生长状态，不会有 其它处理带来的副作用 • 缺点 – 分选精细度较差
低温处理
• 可以提高培养体系中细胞同步化的程度 – Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细 胞较好地同步化。 – 梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆 杉细胞也获得较明显同步化效果。 • 可能的原因 – 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的 影响，在一定范围内，温度下降使细胞分 裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地 延长了分裂期的时间，使分裂指数提高， 细胞同步化率升高。
植物细胞培养
是指在离体条件下， 将愈伤组织或其它 易分散的组织臵于 液体培养基中进行 振荡培养，得到分 散成游离的悬浮细 胞，通过继代培养 增殖，获得大量细 胞的一种技术。
细胞培养与组织培养的区别
• 1979年国际组织培养协会专业术语委员会 建议： – 组织培养：从机体内取出组织或细胞， 模拟机体内生理条件，在体外进行培养， 使之生存或生长成组织。 – 细胞培养：动植物细胞在体外条件下的 存活或生长，此时细胞不再形成组织。
细胞培养培养类型
• 根据培养规模：小规模和大批量培养 • 根据培养方式：悬浮、平板、看护培养 • 根据要求产物：用于诱变和生产次生(级)产 物(Secondary products)的细胞培养
悬浮培养 单细胞培养
细胞规模化培养 培养细胞的次级代谢及产物积累
悬浮培养（Suspension culture）
抑制剂法
• 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞 滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。
– 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟 基尿(HU)。 – 用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、 玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。
• 利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用 的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较 小。
植物细胞规模化培养体系的建立
• 种子细胞选择 – 外植体 – 高产细胞 • 种子细胞增殖与放大培养 • 大规模培养体系建立
种子细胞选择
• 外植体选择 – 植物类型：遗传基础。在确定生产某一 种化合物以后，首先必须准确选择那些 能够产生目的化合物的植物种类及品种 或单株。 – 组织器官：由于天然产物一般为次生代 谢产物，而植物次生代谢产物的积累具 有组织器官的特异性，因此，在起始细 胞培养时尽量选择自然状态下产生天然 产物的器官、组织作为外植体。
部分代表性植物次生产物及其植物资源
工业用途 医药 次生产物 可待因
薯蓣皂苷配基 奎宁 地高辛 莨菪胺 长春花碱 除虫菊酯 留兰香 茉莉油
植物资源 罂粟
三角叶薯蓣 金鸡纳树 狭叶毛地黄 曼陀罗 长春花 除虫菊 薄荷 茉莉花
农业化学 食品，饮料 化妆品
植物细胞大规模培养的技术要求
• 从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜 于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的 控制和调节系统。 • 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件： – 培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产 量恒定的产物。 – 细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物 – 产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中
悬浮细胞的生长动态
悬浮细胞生长的衡量
• 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞 质量变化。 • 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然 对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养 时间(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t • 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生 长情况 • 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量
克隆愈 伤组织
细胞悬浮
过滤
与培养基 混合
植板
培养
细胞平板培养 (plating culture)
• 指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培 养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 – 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞 团不能超过6个细胞。 – 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养 基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升
• 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌 式）；分批培养，半连续培养和连续培养 • 温度 25℃ • 继代周期
–指具有一定起始密度的细胞，从开始培养 到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 –培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟 期的长短、生长速率等决定。 –继代培养（Subculture）：继初代培养之 后的连续数代的扩繁殖培养过程。
双层滤纸植板培养
Horsch 等 （ ） 建 立 1980
转移滤纸 培养基 培养细胞 培养皿 看护滤纸 饲养细胞层
植物细胞规模化培养
• • • • 意义 规模化培养体系的建立 生物反应器 规模化培养的技术问题
意义
• 应用培养细胞系统合成有用的天然产物在 医药、食品、轻化工业等领域具有重要意 义。 – 目前有约25％的法定药品来自植物，其 有效成分均为次生产物。 – 许多植物次生代谢产物是优良的食品添 加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒 素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，而 对环境和人畜无害，是理想的环保产品
影响悬浮细胞生长的因素
• 起始愈伤组织的质量 • 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般 在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的 细胞密度过低往往使延迟期加长。 – 最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖 的最低接种量。 • 培养条件：培养基、方式、温度、继代周 期。