DNA重组技术：酶切、连接
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
基因克隆的原理
基因克隆的原理基因克隆是一种重要的生物技术手段，可以通过复制和传递DNA 分子，实现对特定基因的扩增和增殖。
基因克隆的原理是利用DNA 重组技术，将所需基因的DNA片段插入到载体DNA上，然后将重组的DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆的过程可以分为DNA分离、DNA切割、DNA连接和DNA转化等几个步骤。
需要从源生物体中提取目标基因所在的DNA。
DNA分离是基因克隆的第一步，通常使用细菌或真菌等生物作为DNA的来源。
提取DNA的方法有很多种，常见的有碱裂解法和酚氯仿法等。
这些方法能够将DNA从细胞中释放出来，获得纯净的DNA溶液。
接下来，通过DNA酶切割技术将目标基因从DNA中剪切出来。
DNA酶切割是基因克隆的关键步骤，通过使用特定的限制性内切酶，可以将DNA分子切割成特定的碎片。
限制性内切酶能够识别特定的DNA序列，并在特定的酶切位点上切割DNA，产生具有粘性末端的DNA片段。
然后，将目标基因与载体DNA进行连接。
载体是一种能够自我复制的DNA分子，可以将目标基因插入到载体中进行复制和表达。
常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
连接的方法有多种，常见的是使用DNA连接酶将目标基因与载体DNA连接起来。
连接后的DNA分子称为重组DNA。
将重组DNA转化到宿主细胞中。
转化是指将重组DNA导入到宿主细胞中，使其能够进行复制和表达。
常用的转化方法有热激法、电穿孔法和化学法等。
转化后，宿主细胞将能够复制和表达重组DNA 中的目标基因。
基因克隆技术的应用非常广泛。
通过基因克隆，可以获得大量目标基因的DNA，用于研究基因的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方法。
此外，基因克隆还可以用于制备重组蛋白、产生转基因生物和进行基因治疗等领域。
总结起来，基因克隆的原理是利用DNA重组技术将目标基因插入到载体DNA中，然后将重组DNA转化到宿主细胞中进行复制和表达。
基因克隆技术的应用非常广泛，对于研究基因和开发生物技术具有重要意义。
基因工程的核心技术是()技术
基因工程的核心技术是( )技术基因工程的核心技术是（DNA的重组）技术DNA重组技术一般知第一节工具酶基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（ligase）；要结合基因或其中的一个片段，需要DNA酶（DNa polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所要用的酶统称为工具酶。
一、DNA限制性内切酶Lurva和Human（1952）以及Bertani和Weigle（1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA受到后一种宿主的“限制”。
由此发现了限制-修饰系统。
各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。
这些酶切割DNA的双链，因为它们的功能就是切割DNA，限制外源性DNA存在于自身细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。
合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用，因为细胞还合成了一种修饰酶，它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构，使限制酶不能起作用。
限制-修饰系统是细胞的一种防卫手段。
如果用噬菌体去感染限制-修饰系统有活性的细菌，噬菌体DNA 没有先经修饰，它与先经修饰的噬菌体相比，感染效率要低几个数量级。
未经修饰的噬菌体DNA进入细胞后被限制酶切成片段，片段的数目与DNA分子中限制酶的识别点数目成正比，这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解，就会开始裂解感染，由此产生的子代噬菌体全部带有修饰过的DNA，因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修饰系统的细菌。
目前，从各种生物中分离出的限制性内切酶已超过175种，其中80多种是切割DNA双链。
（一）命名原则限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
双酶切及连接
目录
• • • • • • • 原理 类型 命名法 实验 注意事项 连接 常见问题及对策
DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于 抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
连接反应
• DNA 分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 • DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的 5'磷酸和3'羟基间可由联接酶催化形成磷酸 二酯键，即能完成联接反应。
连接体系
10× Buffer 载体 DNA T 4酶 无菌水 2.5μL 1μL 10μL 1μL 10.5μL 共25μL
原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
1. 2.
用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振 荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶 切效率的核酸顺序
3’…… CTA
ATC …… 3’
TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母 表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表 示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌 (Heamophilus influenzae)Rd 菌株用d，即 Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
同源重组与酶切连接
同源重组与酶切连接
最近总是有⼈问⼩编
你们构建载体怎么做的
“我的基因上有很多酶切位点，
没有可选的酶切位点⽤来构建表达载体呀”
别着急，容⼩编来⼀⼀讲解
传统的载体构建⽅法——酶切连接法
⼀、引物设计，引物的长度⼀般为15-30bp，引物中需要加⼊酶切位点（如XbaI、EcoRI）及保护性碱基（可增加酶切效率）。
⼆、 PCR扩增⽬的基因。
三、⽤特定的限制性内切酶对⽬的基因进⾏酶切（⼀般酶切效率⽐较低），同时对⽬的载体进⾏酶切。
四、⽤T4 DNA连接酶进⾏连接，⽬的基因与⽬的载体的摩尔⽐很重要，⽽且连接反应体系的体积对效率也有很⼤关系，之后进⾏测序鉴定。
专治各种“疑难杂症”——同源重组法构建载体
采⽤同源重组法构建载体与常规双酶切构建载体⽅法不同，该⽅法不受酶切位点的限制。
⼀、设计引物时上游引物5’端前⾯加的是酶切位点（如BamHI）及该酶切位点在载体中对应前⾯的15个碱基载体⽚段（上游同源臂），下游引物5’端前⾯加的是酶切位点（如HindIII）及该酶切位点在载体中对应后⾯的15个碱基载体⽚段（下游同源臂）。
⼆、将载体进⾏双酶切(或者是单酶切，单酶切假阳性率很⾼)，使得载体成为两端分别带BamHI、HindIII位点的线性载体；同时PCR扩增⽬的基因。
三、PCR产物直接⽤于重组连接，不需要酶切产⽣粘性末端，⽽且重组酶的重组能⼒强于T4 DNA连接酶的连接能⼒，⼀般只需要⼀步即可重组连接成功，因此可以在重组反应之后进⾏测序鉴定。
总的来说：
酶切连接同源重组
酶切位点依赖性依赖性较⾼依赖性较低
构建耗时长短
难易程度繁琐简单
重组效率⾼较⾼。
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
基因连接转化实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 学习目的基因与载体连接的实验操作步骤。
3. 熟悉转化实验的基本流程，包括感受态细胞的制备、转化、涂布培养和筛选等。
4. 了解基因表达载体的构建和鉴定方法。
二、实验原理基因连接转化实验是基因工程中重要的基本操作之一，其原理主要包括以下几个方面：1. 基因克隆：通过酶切、连接等操作，将目的基因与载体连接起来，构建成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒导入宿主细胞，使其在宿主细胞内复制、表达。
3. 筛选：通过选择性培养基和分子生物学方法，筛选出含有目的基因的转化子。
4. 鉴定：对筛选出的转化子进行鉴定，确认其是否含有目的基因。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、T4连接酶、DNA连接缓冲液、DNA分子量标准、DNA聚合酶、PCR引物等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱、超净工作台等。
3. 细胞：感受态细胞（如大肠杆菌DH5α）。
4. 基因组DNA：目的基因片段和载体DNA。
四、实验步骤1. 目的基因片段的制备：采用PCR技术扩增目的基因片段。
2. 载体DNA的制备：提取载体DNA，进行酶切处理。
3. 基因连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
4. 转化：将连接产物转化感受态细胞。
5. 涂布培养：将转化后的细胞涂布在选择性培养基上，培养过夜。
6. 筛选：挑选生长良好的单克隆菌落进行PCR检测。
7. 鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切和测序鉴定。
五、实验结果与分析1. PCR检测结果：根据PCR检测结果，筛选出含有目的基因的转化子。
2. 酶切鉴定：对PCR检测阳性的菌落进行酶切，观察酶切图谱，确认重组质粒是否构建成功。
3. 序列鉴定：对酶切鉴定阳性的菌落进行测序，与目的基因序列进行比对，验证其是否正确。
六、实验总结1. 通过本次实验，掌握了基因连接与转化的基本原理和操作方法。
2. 成功构建了含有目的基因的重组质粒，并对其进行了鉴定。
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DNA重组技术：酶切、连接
实验原理:
DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’
3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’
构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。
通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。
酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
限制性内切酶的一个活性单位U
理论上， 1hr,切1ug DNA 样品中所有专一位点的所用酶量实际反应，1U酶：能完全切割1ul λDNA的一个位点不能完全切割1ug 带有4个酶切位点的样品和不纯的样品.
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
限制性内切酶的使用注意事项：
10x bf o 无盐
注意混匀 L 低盐
H 高盐
一.仪器
水浴锅(37℃，65℃) 凝胶电泳灭菌锅紫外检测离心机
二.试剂及溶液
λ DNA EcoR I
pUC18 无菌水
终止液 (40%蔗糖) 70％，100％酒精
3Mol/L KAc(pH5.2) ice
琼脂糖溴酚蓝
TE TAE
EB marker
三. 用品
移液器20ul 一次性手套
tip 20ul 防护镜
离心管0.5ml 吸水纸
胶带浮子
PUC 18/19, λDNA
2人／组，一人做 PUC18 酶切（20ug） Takara 25ug/个
一人作λDNA 酶切（15ug）
EcoR1 1ul/人（10 u） (20ul) Takara 4000u/个
四：酶切反应:
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸
管头.
[注意]
1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。
2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时
完全降解1mg λDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA不象λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。
反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。
3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。
另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控
制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。
37℃,2hr
终止反应65℃ 10min
各取2ul酶解液，电泳
EcoRI切割λDNA后电泳得到6个片段,
长度分别为 21.2, 7.4, 5.8, 5.6, 4.9 和 2.5kb。