基因工程考试复习教材
2012级《基因工程》考试复习
姓名：__________电话：___________
一
基因工程是指将一种或多种生物体(供体) 的基因或基因组提取出来, 或者人工合成的基因, 按照人们的愿望, 进行严密的设计, 经过体外加工重组, 通过一定的方法, 转移到另一种生物体(受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术.
基因工程是指在体外将目的基因插入病毒、质粒或者其他载体分子中、构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原来没有这些基因的寄主细胞内，且能稳定的遗传。
基因工程三要素：供体受体载体
基因工程的操作步骤：切→接→转→检
基因工程研究的内容：
基因的分离与克隆转化体的筛选[书本]:（GE克隆载体的研究
载体的选择与构建外源基因整合和表达的检测GE受体系统的研究
基因转化受体系统的建立外源基因在细胞中的表达调控目的基因的研究
基因转化技术外源基因的遗传GE工具酶的研究
GE新技术的的研究）
基因工程诞生的理论基础及技术基础
1)理论基础
20世纪40年代，确定了遗传信息的携带者是DNA而不是pro,从而明确了遗传物质的基础问题。
50年代，DNA双链和DNA结构的双螺旋模型和DNA半保留复制机理解答了DNA的自我复制和遗传信息传递问题。
50年代末和60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功破译了遗传密码，从而阐明了基因遗传信息的流向和表达方式。
2）技术基础
限制性核酸内切酶的发现
DNA连接酶的发现
GE载体的发现
转化（导入）方法
基因表达
6如何正确看待基因工程(正反两方面）
虽然GE解决了生产生活中的一些问题，如：
①红色GE:指的是医疗部门的GE，涉及的基因改造的细菌产生的基因药物如胰岛素。
②白色GE:包括环境微生物学，环境技术和其他技术或工业应用。
③绿色GE:在农业上的应用，用在作物育种的主要重点是植物的不敏感的害虫和疾病。
但是基因工程的安全性引起了强烈的关注和质疑：
问题1用于筛选的标记基因或报告基因是否会对人畜有害，同时导致病原菌抗药性的提高。问题2抗除草剂基因会不会使转基因植物变成不可控制的杂草，或漂移到杂草上使杂草泛滥。
问题3外源基因插入的位置效应是否会引起有害的沉默基因的表达。
问题4转基因动物是否会演变成对人类有极大威胁的新物种。
问题5基因治疗是否对人体的正常功能产生不良影响。
二
DNA提取（基因组，质粒DNA，噬菌体）
原核基因组DNA提取方法：苯酚氯仿抽提法。
植物组织中DNA 的提取CTAB的作用:
CTAB[十六烷基三甲基溴化铵]是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液[0.7mol/LNaCl]中是可溶的，当降低盐溶液的浓度到一定程度[0.3mol/LNaCl]时从溶液中沉淀，通过离心可将CTAB与合算的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。
动物组织中DNA 的提取SDS的作用:
溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂；
溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来；
对RNase、Dnase有一定的抑制作用；
SDS能够与蛋白质结合形成R1-O-SO3-…R2+-蛋白质复合物，使蛋白质变性沉淀。
载样缓冲液的作用①增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色，使加样操作更方便.
质粒DNA提取的两种方法：氯化铯密度梯度离心法,利用碱变性法提取质粒DNA方法及原理）p91
氯化铯-EtBr密度梯度离心法是根据“在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子质量的细菌染色体DNA易发生断裂形成相应的线性片段，而质粒DNA则由于其分子质量较小、结构紧密，仍能保持完整的状态”这种差别建立的纯化质粒DNA的技术。
原理：当将含有溴化乙锭EtBr的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中时，溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应。线性的或开环的DNA分子，如大肠杆菌染色体DNA片段，可结合大量的EtBr分子，直至达到饱和（每个碱基对大约结合一个溴化乙锭分子）。而像质粒这样的共价闭合环状的DNA（cccDNA）分子，由于在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入，EtBr分子的结合数量相对较少。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分子在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯中的浮力密度也有所不同。在DNA-EtBr复合物中，结合的EtBr分子数量越来越多，其密度也就越低。通过氯化铯密度梯度离心之后，根据它们的不同密度，就会平衡在不同位置。取出DNA，用异丙醇抽提溴化乙锭，再用缓冲液透析除去残余氯化铯，最后用两倍体积冷乙醇沉淀，就得到了纯化的质粒DNA。
碱变性法提取质粒DNA方法及原理
碱变性法提取质粒DNA方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片段之间在拓扑学上的差异而发展出来的。在pH12.0~12.5时，线性的DNA会完全变性分开，甚至出现断裂；而共价闭合环状质粒DNA虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开。通过冷却或恢复中性pH使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，在离心时，大部分主染色体与细胞碎片、杂质等缠绕在一起被沉淀，通过离心即可除去线性染色体，而可溶性的cccDNA留在上清液中，将含有cccDNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。
DNA样品浓度的测定方法
a,在琼脂凝胶上用荧光染料进行标准比对。
b，利用分光光度计测吸收值。A260.
DNA Concentration（浓度）Measurement
Comparison with a standard using a fluorescing dye （荧光染料）on an agarose-gel 琼脂糖胶凝.
Using absorption of DNA in a UV-spectrophotometer分光光度计
DNA纯度的测定
DNA在260纳米处有最大吸收峰，但蛋白质核酸的主要污染源在280nm处有最大吸收峰，A260/A280适合纯度测定。
纯DNA=A260/A280=1.8
纯RNA=A260/A280=2.0
低于1.8含苯酚或蛋白质，高于1.8含RNA和单核苷酸。
DNA纯化的方法：
a 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法（CsCl-EB）适合纯化大剂量DNA。
b 阴离子交换层析法
c 琼脂糖凝胶电泳洗脱法，适合小剂量DNA的纯化和酶切DNA片段的回收纯化。
d 基因纯试剂盒
核酸杂交类型：
A转移印迹
southren杂交：检测DNA
Northren杂交：检测RNA
Western杂交：检测蛋白质
B 点印迹、狭缝印迹[dot blotting /slot blotting ]
C原位杂交[in situ hybridization]
质粒特性：
1什么叫质粒
一类存在于细菌或真核细胞中，独立于染色体之外能自主复制的裸露的双连环状（少数为线状和RNA）DNA分子，是与细菌或真核细胞共生的遗传成分。
2质粒的构型，及不同构型的大小迁移顺序
绝大多数质粒是环状双链，其分子具有3种不同的构型：
1）当其两条多核苷酸链均保持着完整的环状构型时，成为共价闭合环形DNA，即cccDNA。这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型。
2）如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环状结构，另一条出现一至数个缺口时，称为开环DNA（ocDNA），此即OC构型。
3）若质粒DNA经过适当的限制酶切割后，发生双链断裂而成线性分子（L-DNA)，通称L 构型。
在正常的电泳条件下，不同构型的质粒DNA，尽管分子质量相同，但是仍然具有不同的电
泳迁移率，其大小顺序为：cccDNA(scDNA)>L-DNA(线性DNA）>OC-DNA>D-DNA(二聚体DNA）>T-DNA（三聚体DNA）。
经过合适的限制酶处理后所有结构的DNA都转化为线性分子。
3质粒的大小差异大，最小的不到1kb,最大的甚至超过500kb。
4宿主细胞在标准培养条件下，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。5理论上讲，几乎所有的细菌都含有质粒。
几乎所有的质粒都会带有一个至多个基因，而这些基因的表达常常赋予细胞有用的特性。6质粒DNA都含DNA的复制起始点，这使得质粒可在宿主细胞中独立复制，分子质量小一点的DNA可利用宿主细胞中的DNA复制酶来进行自身的DNA复制；分子质量大一点的DNA本身含有DNA复制时所用酶的基因，质粒DNA复制时所用的DNA复制酶是自身DNA 基因表达的产物，还有一些质粒DNA能将自身的DNA插入到寄主细胞染色体上，随寄主染色体复制而复制。
TAE 50×
242gTris
57.1ml冰乙酸
100ml0.5mol/L EDTA(pH8.0)双链DNA分子的泳动速率比另两者快10%，超螺旋在其中电泳时更符合实际分子质量，回收DNA 片段时首选，大片段分离效果好，缓冲容量小，过夜电泳不可选用。
TBE 5×
54gTris
27.5硼酸
20mol0.5mol/L EDTA pH8.0 小片段（＜1kb）分离效果好，回收率差，不宜用于回收电泳。缓冲容量大，过夜电泳适合
TPE 10×
108gTris
15.5ml磷酸（85%，1.679g/ml)
40ml 0.5mol/L EDTA pH8.0 磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀，也不适合回收电泳，缓冲容量大，过夜电泳适合
类型6×缓冲液储存温度
I 0.25%溴酚蓝
4℃
0.25%二甲苯氰FF
40%蔗糖水溶液
II 0.25%溴酚蓝室温
0.25%二甲苯氰FF
15%聚蔗糖水溶液
III 0.25%溴酚蓝4℃
0.25%二甲苯氰FF
30%甘油水溶液
增加样品密度，确保DNA均匀沉入加样孔中；
在电泳中形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳速度和位置；
使样品呈色，使加样操作更方便。
DNA沉淀两种方法的优缺点
1乙醇
优点：
对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。
缺点：
需要量大，一般要求低温操作。
2异丙醇
优点：
需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。缺点：
易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离物质原理（三个效应）
不连续电泳凝胶采用两层或3层性质不同的凝胶（样品胶，浓缩胶和分离胶）重叠起来会用，前两种胶的缓冲液、PH和孔径大小完全一样，不同的是浓缩胶中无样品。分离胶的孔径较小，PH也不同，能使能读较低的各组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率。
第一三个不连续：凝胶孔径的不连续
缓冲液离子组成及各层凝胶ph的不连续
在电场中形成的电位梯度的不连续
第二不连续系统中的三种物理效应
电荷效应酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电荷作用下向一定的电极及一定的速度移动。
分子筛效应相对分子质量或构型不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，所受摩擦不同，受阻程度不同，表现出不同的迁移率
浓缩效应使待分开样品中的各组分在浓缩胶中被压缩成层。
基因的化学合成：人工合成的短DNA片段5’末端为OH，而天然的DNA5’末端为—P. （磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法）
基因组装方法：
①全片段酶促链接法：
带上必要的5’磷酸基团，与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，加入T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因片段，这些组装的产物插入到适当的载体上，转化受体细胞，最后用DNA序列分析检测所组装的基因。例如：α—干扰素和牛视紫红质基团。
②酶促填充法：
将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，产生的单链区断在加入的klenow酶的聚合作用下合成互补链，再和载体连接。
PCR组成成分，标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR引物设计原则
Primer Design:
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②引物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
什么是PCR
PCR技术是一种通过模拟体内DNA的复制方式，在体外两种分别与基因两端不同DNA链互补的特异引物，经聚合酶酶促作用下选择性地将DNA某个特殊区域快速扩增出来的技术。
什么是不对称PCR Asymmetric PCR
不对称PCR是用不等量的一对引物（非限制性引物与限制性引物），PCR扩增后产生大量的单链DNA。
什么是反向PCR Inverse PCR
一种用于指数式扩增位于一个已知DNA区段的PCR法。
什么是巣式PCR Nested PCR.
方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对引物产生扩曾产物，然后用一对内引物对第一轮扩增的产物进行第二轮扩增，用于DNA及RNA病毒的检测。
什么是基因定点诱变Site-directed mutagenesis
是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。
（体外特异性改变某个碱基的技术）
盒式诱变cassette mutagenesis
是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列获得数
量众多的突变体。
kunkel定点诱变原理
诱变之前将复制型的MB噬菌体转化到dut和ung双缺陷型菌株中生长，dut突变导致dutp 水平升，ung突变则会使尿嘧啶取代DNA链中的胸腺嘧啶，因此，从dut-ung-大肠杆菌寄主中制备MB 单链DNA模板含有许多尿嘧啶残基，进行寡核苷酸引物诱变，产生的异源双链DNA导入大肠杆菌ung+菌株野生型模板复制之前被降解，合成链不会被降解，正常复制，从而产生大量的突变体，提高突变的效率。
常见的印记杂交
A
southern杂交：检测DNA
northern杂交：检测RNA
western杂交：检测蛋白质
B
点印记，狭缝印迹（dot blotting/slot blotting)
C
原位杂交（in situ hybridzation)
什么是放射自显影
Autoradiography(放射自显影): 利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，用显影液显示这种潜影，成为可见的“像”。
三
限制性内切核酸酶的种类
I型、II型III型
ATP、Mg2+ AAC N6I GCT TGA N8T GCT 1000bp以外切割Mg2+
回文序列
切割位点在识别位点区域
ATP Mg2+
AG AAC
CAGCA
24-26bp外切割
限制性内切核酸酶的命名方法
例如EcoRI
E:表示大肠杆菌属名的第一个字母；
co:表示种名的前两个字母
R：表示株名；
I:表示该菌种中第一个被分离出的酶。
同裂酶同尾酶新裂酶的区别
同裂酶：相同识别位点和切割位点不同但来源不同的酶称为同裂酶。
新裂酶：来源不同相同识别位点但切割位点不同的酶。
同尾酶：来源不同，识别位点不同，切割位点也不同，但产生了相同的粘性末端的酶。
影响限制性内切核酸酶酶活性的因素
a能源分子浓度；
b酶浓度，例如，T4DNA连接酶在连接平末端时酶用量为1~2单位连接效率最高；而在连接粘性末端时酶用量为0.1单位时便能得到最佳的连接效率。
c反应时间;
d反应温度，对DNA连接酶而言，连接粘性末端最适37℃，在此温度下，粘性末端处氢键易遭热破坏降低粘性末端结合的速率；因此，连接粘性末端最佳温度应介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是4-15℃比较合适。
e作为底物的DNA片段的摩尔比等。
典型酶切反应体系组成
无菌水14ul
10×buffer 2ul
BSA牛血清蛋白（保护酶）2ul
DNA样品0.2-1ug在TE 1ul
保护酶2-10ug 1ul
最终体系20ul
酶在冰上，最后加入反应中，加入酶前把它们全混匀。酶加样顺序一般为：水+缓冲液+DNA+
酶，以保证酶的活性。
什么是星号活性及其引起因素
星号活性：某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶，在每位同一种DNA片段时会产生新的酶切微位点而得到不同的酶切片段，这种酶活性则称星号活性。
引起因素：
高浓度的甘油（＞5%）
低离子强度小于25mM
高PH(＞8.0）
乙醇，乙二醇等有机溶剂
Mn2+、Cu2+、Co2+等正离子，与Mg2+竞争
物理图谱physical map （Restriction Maps限制性图谱,)
(限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱)。
限制性图谱分布图，顺序，距离
（如图）
常用DNA连接酶的特性
T4DNA连接酶:来源T4噬菌体，粘性末端和平末端都可连接，必须以ATP作为辅助因子E.coliDNA连接酶:来源于大肠杆菌，只催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接。
连接反应温度16℃
匹配末端连接的方法存在的问题及其解决方案
匹配粘性末端：同一种酶切割，混合在一起，自己发生配对，连接。
I产生的问题：
a.载体自身环化降低了重组子的效率
b.插入的外源DNA片段有两个方向
解决方法：
a.碱性磷酸酶的处理，去除载体DNA片段的5’磷酸，阻止载体DNA分子的自身环化，从而增加了重组DNA的比率。
b.利用双酶切的方法来实现基因的定向克隆，没有合适的双酶切的位点可以通过加衔接物的方法实现定向克隆。
II 不匹配粘性末端如何进行连接？
a.将粘性末端修饰成平末端。
b.将平末端修饰成互补粘性末端（补平）
III平末端的连接方法（提高平末端的效率）
a.T4DNA连接酶连接平末端
提高T4DNA酶的浓度；
提高DNA片段的浓度；
降低ATP浓度，以增强连接物与DNA结合；
加入多胺化合物，如亚精胺，降低DNA静电排斥力；
加入浓缩剂，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、强水化合物三氯化六氨钴等。
b.同聚物加尾法ccc一般用GC更稳定
c.衔接物连接法两端平末端，人工合成双链使得一端为平末端，另一端为粘性末端
d.DNA片段接头连接法
接头
它是一类由人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
衔接物
是指用化学法合成的一段由10~12个核苷酸组成具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。
Klenow大片段
DNA聚合酶I在枯草杆菌蛋白酶下生成大片段和小片段，，大片段即为klenow片段，是具有3’—5’核酸外切酶活性及聚合酶活性。
末端脱氧核苷酸转移酶的特性
①合成方向5’→3’
②合成时不要模板，但底物至少要3个核苷酸，
③对dNTP非特异性，任一种都可以作前体物，
④可催化3’－OH末端单链或3’－OH突出的双链，
需要Mg++或Mn++，
⑤用Co++代替Mg++作辅助因子，可在平末端
DNA分子上进行末端转移。
用途：①给载体或cDNA加上互补同聚物尾，
②标记DNA片段的3’－OH端，可用α－32P－dNTP
也可催化非放射性标记物参入DNA 3’－末端
③可按底物合成多聚脱氧核苷酸同聚物。
修饰酶：
碱性磷酸酶
将DNA RNA或蛋白质的5”磷酸基团切掉，防止DNA的自身环化和5”末端标记前的去鳞。
多聚核苷酸激酶
将ATP的5’磷酸盐催化转移到DNA RNA的5”端，常用于正向反应，交换反应。RNA酶A（核糖核酸酶A）
a可特意剪切3”末端为嘧啶核苷酸的单链RNA，将RNA降解为3’磷酸化的单核苷酸和低聚核苷酸。
b低盐(0~100mmol/L)可以切割单链\双链\杂交双链
c 高盐0.3mol/L只切单链
S1核苷酸酶（Nuclease)的特性
以内切酶方式降解单链DNA及RNA，产生以5”磷酸为末端的产物，双联核苷酸不能被降解，除非是有极高浓度的醇。该酶可以用于去除双链DNA的单链末端、单链DNA的选择性切除和RNA转录图谱。
四
载体:是细菌的DNA，运载外源基因进入宿主细胞，并在宿主细胞内进行复制和
表达。
穿梭载体：
质粒的迁移：有一些非接合型质粒在接合型质粒的帮助下，从一个细胞转移到另一个细胞的作用称之为质粒的迁移性。
载体需要满足的条件/具有的特点
低分子量；
选择标记；
高拷贝的宿主细胞；
复制序列（复制起始位点）；
有多个限制酶的识别位点且切点是单一的，供外源基因插入；
较高稳定性，可以稳定遗传不易丢失；
安全性；
扩增。
质粒的不相容性
在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒是不能在同一宿主细胞中稳定共存的，这一现象称为不亲和性或者不相容性。
常见的载体结构pEMB PBR PUC
pEMBL8
PBR:
PUC:
如何鉴定重组λ噬菌体：
a.蓝白筛选：清亮噬菌斑为重组子，蓝噬菌斑为非重组子。
b.SPI表型筛选原理定义
野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶原性E.coli的生长会受到限制的表型，称作SPI，即对P2噬菌体的干扰敏感。这种生长抑制作用是受λ噬菌体red 和gam这两个基因编码的产物控制的。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red 和gam同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2溶原性E.coli 中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作spi-，因此，通过λ噬菌体载体DNA的red或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶原性鉴别重组和非重组λ噬菌体，能够在噬菌体P2溶原性的大肠杆菌中生长并形成噬菌斑。
λ噬菌体载体的野生型为什么不能作为基因克隆的载体？
a.λDNA基因组大而且复杂，特别是其中具有许多基因克隆常用的限制酶识别位点。
b.λ噬菌体外壳只能接纳一定长度（相当于λ基因组75%~105%）DNA分子。因此，λDNA只能作为小片段外源DNA分子（2.5kb左右）的克隆载体。这一克隆容量是显然不能满足大多数基因克隆工作的要求，必须对其进行改造。
λ噬菌体包装限制范围
70%＜λ噬菌体＜150
构建的λ噬菌体载体类型（两种）
插入型载体：一类可容纳一定长度DNA片段的噬菌体载体，在克隆时无需去除与插入大小相当的片段。容纳外源基因15kb
替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA 片段的克隆载体。
MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位点）:由许多限制酶切位点组成，往往是人工合成的一段供外源基因的插入部位的DNA序列。
cos site (cos位点):λDNA分子两端粘性末端结合形成的双链区域。
Conjugation结合：
Transformation转化：重组质粒DNA分子通过于膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞中稳定表达的过程。
Transfection转染将重组的λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞内的过程。Transduction转导通过的λ噬菌体颗粒感染宿主细胞，将外源DNA分子导入受体细胞内并稳定遗传的过程。
什么叫柯斯质粒载体cosmid
人工构建的含有λ噬菌体的粘性末端和质粒复制子的特殊类型的质粒载体.
MB侵染宿主形成什么？浑浊型噬菌斑
什么叫噬粒：由部分质粒载体和单链噬菌体载体组成的具有双功能的新型载体系统有两个ori,一个来自质粒，一个来自单链噬菌体。
什么叫亚、伴染色体
红白筛选：（重组子筛选）：与TAC配套的宿主酵母菌的胸腺嘧合成基体带有赭石
突变ade2-1带有则个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变的抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成白色的菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，用于筛选载体中含有外源DNA 片段插入的重组子。
常用载体克隆能力（mb)
质粒≤10kb Cosmid:35-45kb
插入型噬菌体15kb BAC:75-300kb
YAC:100-1000kb MAC:＞1Mb
五
1.分离目的基因的常用方法：a 直接分离;b 人工合成；c PCR扩增；d 从基因文库里筛选
2.基因库（gene pool)：特定生物体全基因组的集合。（天然存在）
3.基因文库（gene library or gene bank):某生物DNA片段群体与载体分子重组，重组后转化宿主细胞，转化细胞在选择培养基上生长出的单个菌落（或噬菌斑）（或成活细胞）即为一个DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库。
4.cDNA文库（cDNA library):是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合体。
5.基因组文库（genomic library）：是指将某生物的全部基因组DNA切割成一定的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。
6.基因组文库构建程序：总DNA提取随机剪切载体连接转化扩增到保存
7.cDNA文库构建程序：提取总DNA ，纯化mRNA，合成cDNA双链，去除小片段，将双链cDNA连接到载体，转化或包装，扩增及保存。
8.cDNA文库与基因组文库的区别：（版本一）a.基因组文库中的一个基因片段可以出现在不同序列中，某个基因可能会被打成不同的片段，cDNA文库不会出现这种情况。B cDNA文库不含内含子，基因组文库有内含子和不表达序列C 基因组文库在一个基因组上都是一个拷贝数，出现的概率接近。cDNA文库有一定的时效性，不同时期的DNA不同，基因的比例在基因组文库中相似，而在cDNA文库中相差较大
（版本二）A 基因组文库包含了所有的基因，而cDNA文库只包含特定时空下表达的mRNA 基因，缺乏内元和调节序列，因此在研究基因结构时没有多大用处
B cDNA文库代表了mRNA的来源，其中一些特定转录很丰富，而另一些很少，所以存在
丰度的差别;而基因组文库在理论上均等的代表了所有的基因序列
C 从不同细胞类型制备的cDNA文库包含一些共同序列和独特序列，可用于分离差别表达基因；基因组文库不能
D 基因组文库由于含有不表达序列，因此比cDNA文库大
E mRNA在不同的组织之间存在风度的差异，因此cDNA文库的构建时如果mRNA少就比较困难，而基因组文库不存在这样的问题。
9.如何评价cDNA文库和基因组文库（公式，计算）：A 能代表整个基因组；稳定存在：N=Ln(1-p)/Ln(1-F);其中，N：要求克隆的数目，Ln为自然对数，P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，，F：克隆片段的平均大小/生物基因组的大小，1/N：目的RNA 在总RNA中出现的分数
B 评价cDNA文库的标准：N=Ln(1-P)/Ln(1-1/n)
10.mRNA完整性及其纯度检测方法：完整性,确保mRNA未被分解：a.利用无细胞翻译系统如麦胚抽提物或兔网织红细胞溶解产物看mRNA是否能够翻译，b.凝胶电泳分析，mRNA500-8000bp,最大 1.5kb-2.0kb。纯度检测方法：OD260/OD280~~2.0 OD260/OD230>2.0
11.cDNA文库中如何解决外源基因DNA片段的连接问题！！！：
a.对随机切割过的外源DNA片段按分子质量的大小进行分级分离，回收与载体装载量相适应的DNA片段，然后进行重组。
b..用碱性磷酸酶去除外源DNA的5’磷酸基团
c.用末端转移酶在外源DNA的两个末端加上同聚物。
12.mRNA的分离方法;.利用3’末端polyA尾巴的特性；
A.柱层析法：人工合成T，制成层析柱
B.磁珠分离：总RNA——》生物素标记的poly(T)——>加入磁珠与生物素抗体的复合物——》磁铁捕捉——》用一定盐溶液洗脱——》去离子水洗脱mRNA
C.蔗糖溶液梯度离心
13 检测mRNA完整性：a.确保mRNA不被降解，b.使用无细胞的翻译系统，c.用电泳法分析mRNA：看是否在0.8-2.0kb的区段，是否集中大量mRNA.
无细胞翻译体系：又称无细胞蛋白质合成系统，是分子生物学中一种常规的表达系统，该系统可以用于蛋白质快速分析鉴定，基因转录和翻译的调控机理的研究以及分子间的相互作用的研究
14 基因克隆方法及原理：基因文库中获取；功能克隆；图位克隆。
图位克隆定义：根据目的基因在染色体的位置进行基因克隆的一种方法
图位克隆的原理：在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步行最近目的基因或通过染色体登陆的方法最终找到该目的基因的克隆。
15 EST（表达序列标签）：基因序列中一段特异标记或表征该基因的序列，通常它含有足够的结构信息以显示该基因与其他基因的差异，长度一般在100-500kb
16 .酵母双杂交系统原理：在基因转录的过程中，有很多转录激活因子参与，大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（BD)，一个是转录激活域（AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的，具有激活特定基因表达的激活因子必须同时具有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。据此可将两个待测蛋白（X和Y）分别与这两个结构域建成融合蛋白（BD-X和AD-Y)，并共表达与同一个酵母细胞内，如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD和BD形成一个完整的转录激活因子，并激活相应的报告基因表达，通过对报告基因的检测就能很容易的知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用，进一步可以用已知蛋白X作为诱饵，分离获得与之相互作用的蛋白质Y及其编码序列等。
17.TA克隆定义：
18差异筛选原理：需要两个细胞群体，一个目的基因正常表达，另一个不表达。制备两种细胞群体的mRNA提取物，以两种总mRNA（或cDNA拷贝）为探针，分别表达目的基因的细胞群体构建的cDNA文库进行筛选，挑选含有目的基因的探针有杂交信号，不含目的基因的探针没有杂交信号的菌落供进一步研究。
19.转座子标签法：原理：当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失适，并诱导产生突变型而当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可恢复，遗传分析可确定某基因的突变是否是由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子的DNA 片段为探针，从突变株的基因组文库中调出含有该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终获得完整的基因。
20.序列克隆（重点）：
八
一，常用动物的标记基因
1,胸苷激素（tk）通过TK合成胸苷酸筛选氨基嘌呤（抑制嘌呤和胸苷从头合成) 2，二氢叶酸还原酶（DHFR）通过DHFR变体酶抗Mtx筛选
3.氨基糖苷磷酸转移酶（DHFR）利用APH钝化G418，来筛选G418（抑制蛋白质的合成）
4.潮霉素B磷酸转移酶(XGPRT)，利用XGPRT从黄嘌呤合成GMP筛选霉芬酸（抑制鸟苷酸从头合成）
5.天冬酰胺合成酶（AS）
6.腺苷脱氨酶（ADA）
二，转染动物细胞的方法
<1>机械化方法
1，裸露DNA直接注射——适合于基因表达技术
2，电穿孔
3，显微注射
4，基因枪法
<2>化学方法
1.磷酸钙共沉淀法
2.DEAE-葡聚糖法
3.脂质体介导法
<3>生物方法
1.转导
三，共转染现象：在磷酸钙沉淀物中，两个物理上毫无联系的DNA分子混合物往往能侵染同一个细胞产生共转染的现象。
四．基因治疗（gene theraphy）：将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。
五．应用转基因动物培育的方法：
1，获得胚胎 2，受精卵移植
3，显微注射，将目的基因在显微镜下通过玻璃微管向胚细胞注射500-600拷贝基因
九
一，基因沉默.Gene Silencing：外源基因存在于生物体内，并未丢失或损伤，但该基因不表达或表达量极低的现象。
扬州大学基因工程期末试题复习要点整理
基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学，是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一，是现代生物技术的代表，是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用，为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发，或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释：共10题，每题2分，共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息，然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞，又称重组体。 5. 人工接头：是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域，是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质，来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题：共4题，共20分。 1．简述获得目的基因常用的几种方法。（5分）
基因工程考试试题.doc
基因工程 一名词解释 DNA，1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染，可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或者说是甲基化酶，能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp，大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性，至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法？ 答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素：①高甘油浓度（>5%）；②酶过量（ >100U/μl ）；③低离子强度（ <25mmol/L）；④高(> ；⑤有机溶剂如DMSO （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等；⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施：①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度；②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇；③提高离子强度到100 ～ 150mM（在不抑制酶活性的前提下）；④降低反应pH至；⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素？（影响酶活性的因素？） 答：外因：反应条件、底物纯度（是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当，反应体系的选择、反应时间的长短 内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答：限制酶切割 DNA 时，对识别序列两端的非识别序列有长度要求，也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ～4 个碱基对。 4、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？ 答：将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内必须能够自主复制（具 备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA 片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于 筛选；④其它：有一定的拷贝数，便于制备。 5 抗性基因（ Resistant gene）是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？ 答：氨苄青霉素抗性基因（ ampr）、四环素抗性基因（tetr ）、氯霉素抗性基因（ Cmr）、卡那霉素和新霉素抗性基因（ kanr , neor ）以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化β - 内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补？如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒？ 答：α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成：LacZ △ M15 ，放在 F 质粒或染色体上，随宿主传代；LacZ' ，放在载体上，作为筛选标记，当在 LacZ' 中插入一个片断后，将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β－半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal （同时可作为生色剂）的作用下，含重组质粒的菌落不能产生有活性的β－半乳糖苷酶，不能分解 X-gal ，呈现白色，而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程？ 答：裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程：由感染复数
武生院基因工程期末试题
2013-2014年度第二学期基因工程期末考试 卷型：A 考试时间：90分钟满分：100分 一、名词解释（3×5） 限制性内切酶(或其它工具酶)：能在特异位点上催化双联DNA分子断裂，产生相应的限制性DNA片段 荧光定量PCR:所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 （半定量PCR:是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量） 星活性：非标准条件下切割相似序列，产生非特异性片段 同裂酶（或同尾酶）：来源不同但具有相同识别序列，产生相同或不同末端 转基因技术（或转基因动植物等）：就是将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物的目的。 二、填空（1×15） 1.Cosmid 实际上是由cos 位点和质粒构成的杂合载体，也可以说是带有cos 序列的质粒。 2.超螺旋质粒DNA、开环质粒DNA、线状质粒DNA 在琼脂糖凝胶电泳的特点是：电泳的泳动速度由大到小分别是：超螺旋质粒>线状质粒>开环质粒。 3.质粒DNA的提取方法有碱裂解法、煮沸法、去污法。 4.基因工程中常用载体是质粒、噬菌体、动植物病毒。
5.设计引物是一般要求C+G的比例在40%-60%，长度在17-30bp 。 6.BAC载体与常规载体的区别在于复制单元的特殊性。 三、选择题（2×15，实卷应是1×35） 1.基因工程创始人（D） A A. Kornberg B W. Gilbert C P. Berg D S. Cohen 2.迄今为止所发现的限制性内切核酸酶可以作用于（C） A. 既可以作用于双链DNA ，又可以作用于单链DNA B.只能作用于单链DNA C. 只能作用于双链DNA D.只能作用于RNA 3.氨苄青霉素的工作原理为（A ） A.可以抑制细胞壁肽聚糖的合成 B.可以抑制核糖体的转位 C.可以与核糖体50S 亚基结合并抑制蛋白质合成 D.可以与核糖体30S 亚基结合并抑制蛋白质合成 4.反转录酶是一种（C ） A. 依赖DNA的DNA聚合酶 B. 依赖DNA的RNA聚合酶 C. 依赖RNA的DNA聚合酶 D. 依赖RNA的RNA聚合酶 5.II 类限制性内切核酸酶( A ) A．仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 B．限制性识别非甲基化的核苷酸序列 C．有外切核酸酶和甲基化酶活性
2015-2017基因工程高考题附答案
选修3——基因工程高考题 1．（2017?新课标Ⅰ卷.38）（15分） 真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题： （1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________________________________。 （2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用______________作为载体，其原因是_______________________________________________________________。（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_____________________________________________________（答出两点即可）等优点。 （4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A 的基因”或“蛋白A的抗体”）。 （5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_______________________________________________________________________________。2．（2017?新课标Ⅱ卷.38）（15分） 几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题： （1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是______________________________________。 （2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________。 （3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________（答出两点即可）。（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。 （5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是____________________________________________。 3.（2017?新课标Ⅲ卷.38）（15分）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。 回答下列问题： （1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________________________________。（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为________________，加入了________________作为合成DNA的原料。 （3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。 ①由图2 可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是________________________。 ②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。 4．（2017·天津理综卷9）（20分）玉米自交系（遗传稳定的育种材料）B具有高产、抗病等优良性质，但难以直接培育成转基因植株，为使其获得抗除草剂性状，需依次进行步骤I、II试验。 Ⅰ．获得抗除草剂转基因玉米自交系A，技术路线如下图。 （1）为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用2种限制酶，选择的原则是______（单选）。 ①Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点 ②G基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点
基因工程和细胞工程测试题(附答案,可用于考试)
5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 （时间：90分钟分数：100分） 一．选择题（本大题包括25题，每题2分，共50分。每题只有一个选项符合题意。） 1．以下说法正确的是（） A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B．质粒是基因工程中惟一的运载体 C．运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接D．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不．相符的是（） A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B．植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C．植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3．有关基因工程的叙述正确的是（） A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4．能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是（） A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5．下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是( ) A．培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B．培养人的B细胞能够无限地增殖 C．人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D．用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6．PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7．以下对DNA的描述，错误的是（） A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是（） A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9．细胞工程的发展所依赖的理论基础是（） A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10．下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是：（） A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11．在以下4种细胞工程技术中，培育出的新个体中，体内遗传物质均来自一个亲本的是（） A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12．动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是（） A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13．下列哪一项属于克隆（） A．将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B．将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C．将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞
华东理工大学2004–2005学年第二学期基因工程期末考试
华东理工大学2004–2005学年第二学期 《基因工程》课程期末考试试卷B2005.6 开课学院：生物工程学院，考试形式：开卷，所需时间：120分钟 考生姓名：学号：专业：班级 一、问答题（共15分） 某表达质粒上含有一个能在大肠杆菌中可溶性表达的基因A，若将外源基因B插入到基因A的3' 末端，使之产生可溶性融合蛋白A-B，试设计合理的重组方案。（15分） ___ 起始密码子 A 基因全序列ATGATCGGGATTCGCTGGGATAAAGTGCACCTCAATATAGCACACGCTTGCAACGCAAAGAGC CCCGATTTCTGTAACCGCCAGCACAAAGATGCGGAACACCCAAAAGTGGCGGCAAACGCCTTC AACCGGATCCCGGGATATCAGCTGAGATCTGCTTTCTAG ___ 终止密码子 ___ 起始密码子 B 基因部分序列TCCCGGGATCCATGCTC.........................CGCTAAGAGGATCCTCCCGGGT ___ 终止密码子 BamHI：G\GATCC BglII：A\GATCT EcoRV：GAT\ATC EcoRI： G\AATTC SmaI：CCC\GGG PvuII：CAG\CTG 二、问答题（共15分） 简述基因洗牌术（DNA Shuffling）的工作原理及用途。 三、问答题（共10分） 为什么说多型汉逊酵母表达系统有可能比巴斯德毕赤酵母表达系统更优越？
四、问答题（共20分） 人促红细胞生长素（EPO）系一糖蛋白，其生物活性严格依赖于糖基侧链的序列和大小，临床上主要用于改善癌症患者由于放疗化疗所引起的红细胞降低症侯群。试设计一种高产人EPO的重组表达系统，内容包括： （1）选择合适的受体系统，并说明理由；（6分） （2）选择合适的载体系统，并说明理由；（6分） （3）确定合适的高效表达方案，并简述其机制。（8分） 五、问答题（共20分） 随着植物转基因技术的日趋成熟，世界范围内被批准上市的转基因农作物也不断涌现，然而人们对转基因产品的安全性仍有争论，至少他们要求对餐桌上的食物是否由转基因植物加工而成拥有知情权。为此，建立一种能区分转基因植物和天然植物的检测方法十分重要。目前，世界各国批准上市的转基因植物种类繁多，但绝大多数使用花椰菜花斑病毒（CaMV）的35S启动子。请设计一种能快速灵敏地检测转基因植物的实验程序，并简述其机制。 六、问答题（共20分） 下图是链霉菌的某段DNA序列，试分析其可能的开放阅读框（ORF），并写出： （1）N端10个氨基酸序列；（7分） （2）C端10个氨基酸序列；（7分） （3）潜在的SD序列。（6分） 5’CGCTTGAATTCGTTCCATCTGGAGTCTGTACATGACCAGCCGATACGGCAGCCGGCAGGAACT CGGCCAGAAGTTCCTCGTCGACCCCGACATCATCAAGCTGATACGCCGAGCCGCCGAACGAACGG AAGGTCCCATCGTTGATCTGGGCGCCGGAGACGGCGCCCTGACGCTGCCCTTGAGTCGATTGGGC CGCCCTGTCACCGCGGTTGAGCTCGATCCCCGCCGGGTCAAACGGCTTTCGGCGCGTGCCCCGGA AAACGTCAAGGTCGTCGGCGAGGACATTCTGCGCTTTCGGCTTCCGACCGTTCCGCACACCGTCG TGGGGAACATCCCCTTCCATGTCACGACGGCCACGATGCGCCGGATCCTGGTGGCTCCCGCATGG GTGTCGGCCGTCCTCGTGGTGCAGTGGGAAGTGGCGCGCCGCCGGGCCGGCATCGGCGGCTGCTC GCTGGTCACGGCGGAGTCCTGGCCGTGGTTCGACTTCTCGGTGCTCAAGCGGGTGCCGAGGTTCG CCTTCCGGCCCGCGCCCTCCGTGGACGGCGGGATCCTCGTCATCGAGCGGCGGCCCGAGCCACTG GTGCGGGAGCGCAGGGAGTACCAGGACTTCGTCAGACAGGTCTTCACCGGGCGCGGTCACGGGCT GCGGGAGATCCTCCAACGCATCGGGCGGGTCCAGGACAGCGACCTGTCCGCGTGGTTCAGGGCAC ATGGAGTCTCGCCGCAGGCGCTGCCGAAGGACCTCACCGCCGAGCAGTGGGCGTCGCTCTGGGGC ATGGCGCGTGGCGGCCGGTCCGTGCCGCGGACGCGGATACTCCGGGACCTGCCGCACCGCACGTC CCTCGGGCCGCGGCGCAACAGCGGCTGACGCGGGCGGCAACCGGCGTGGCGGGCCGG 3’
基因工程测试题
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA 分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基 生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA 连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30 多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有
基因工程期末考试重点知识整理教学文案
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)
第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ
基因工程概论
连接产物 ●重组分子 ●未连接的载体分子 ●未连接的D N A片段 ●载体的自连 ●含有错误插入片段的重组D N A分子 1转化—细菌吸收D N A的方式 自然界中，转化并不是细菌获取遗传信息的主要方式。 细菌必须经过物理或化学处理后可提高吸收D N A的能力，经过这样处理的细菌称为感受态。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 1.1大肠杆菌感受态的制备 ●在冷的盐溶液中转化效率提高。一般利用50m M的C a C l2，或者氯化铷。 –原理：与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，并发生收缩，使细胞膜出现孔隙。 ●42°C热激处理。 1.2筛选转化细胞 1n g的p U C8可以产生1000-10000个转化子，意味着只吸收了0.01%的D N A分子。 1.3其他的转化方法 ●电穿孔驱动的完整细胞转化（电激转化法） ●接合转化 ●微注射法 ●λ噬菌体的转染 ●P E G介导的细菌原生质体转化 1.3其他的转化方法 ●电激转化 –受体细胞在脉冲电场作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得D N A分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。 –可以转化较大的质粒，适用于所有的细菌。 1.3其他的转化方法 ●接合转化 –是由接合型质粒完成的。 –涉及到三种菌株的混合：受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。
–重组质粒和接合质粒必须有相容性。 1.3其他的转化方法 ●P E G介导的细菌原生质体转化 –高渗溶液中细菌培养至对数生长期 –溶菌酶的等渗液处理，形成原生质体。 –加入D N A样品和聚乙二醇等渗液 –离心除去聚乙二醇，固体培养。 ●适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性菌、酵母、霉菌甚至植物。 表5-1大肠杆菌5种常用转化方法的比较 2重组子的鉴定 ●利用插入失活选择p B R322重组 ●载体：含有β-半乳糖苷酶基因l a c Z的调控序列和头146个a a的编码序列 ●宿主：缺失了l a c Z’基因，可编码β-半乳糖苷酶C端序列 ●α-互补：l a c Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体可以与带有完整的近操纵基因区段的β- 半乳糖苷酶隐性突变体之间实现互补。 ●转染：是将纯化的噬菌体D N A通过热激的方法转化感受态大肠杆菌的过程。 ●体外装配i n v i t r o p a c k a g i n g：将重组的λ分子装配成头-尾结构的病毒粒子。 ●体外装配 –c o s位点突变的噬菌体的单品系系统 –另一种系统需要两种缺陷品系。一个是基因D的突变体，另一个是基因E的突变体。 3.1噬菌斑 ●λ形成的是真正的噬菌斑。 ●M13引起细菌生长的减慢，而使细菌的浓度低于周围细胞。 4重组噬菌体的鉴定 ●利用插入失活鉴定 ●λ噬菌体的c I基因的插入失活 ●利用S p i表型选择 ●根据λ基因组的大小筛选 4.1利用插入失活鉴定 4.2λ噬菌体的c I基因的插入失活 4.3利用S p i表型选择 4.4根据λ基因组的大小筛选 λ装配系统，只有37k b-52k b的D N A分子可以进入头部结构。 思考题
高中生物基因工程试题
阶段质量检测（一）基因工程 （时间：45分钟，满分：100分） 一、选择题（每小题3分，共45分） 1 ?下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（） A. 重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和载体 B. 所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列 C. 只要是细菌中的质粒都可以直接作为基因工程中的载体 D. 载体必须具备的条件之一是有多个限制酶切割位点，以便与外源基因进行连接 2. （浙江高考）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而 开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确 的是（） A. 提取矮牵牛蓝色花的mRNA经逆转录获得互补的DNA再扩增基因B B. 利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因B C. 利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞 D. 将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞 3. 日本下村修、美国沙尔菲和钱永健因在发现绿色荧光蛋白（GFP）等研究方面做出突出贡献，获得2008年度诺贝尔化学奖。GFP在紫外光的照射下会发出绿色荧光。依据GFP的特性，你认为该蛋白在生物工程中的应用价值是（） A. 作为标记基因，研究基因的表达 B. 作为标记蛋白，研究细胞的转移 C. 注入肌肉细胞，繁殖发光小白鼠 D. 标记噬菌体外壳，示踪DNA路径 4. 下列有关质粒的叙述，正确的是（） A. 质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 B. 质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状 DNA C. 质粒只有在侵入宿主细胞后，才能在宿主细胞内复制 D. 基因工程中常用的载体除了质粒外，还有核 DNA动植物病毒以及入噬菌体的衍生物
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件： 一系列新的基因工程操作技术的出现； 各种表达克隆载体的成功构建； 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容（P9） 4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内 特点（参加PPT） 命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。 分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为~。 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如：BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：TCGA；ClaI：A TCGA T；AccI：GTCGAC 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱：（多为质粒图谱）
基因工程概论期末考试
一、名词解释 引物、克隆、探针、转化率、重组率、基因工程、分子克隆技术、限制性核酸内切酶 、基因工程 基因工程是指重组 技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组 技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 、基因表达 是指细胞在生命过程中，把储存在 顺序中遗传信息经转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子 、限制性核酸内切酶 能特异性识别双链 某段特殊序列，并切割 双链的酶，主要存在于原核细菌中，主要作用是保护自身 不受限制，及破坏外源 使之迅速降解 、重组率：重组率 含有外源 的重组分子数 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为 ；重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化 重组的后续操作 、探针 一小段单链 或 片段，用于检测与其互补的核酸序列，双链 加热变性成为单链，
随后用放射性同位素 常用 、荧光燃料或酶标记成为探针 连接酶的酶活性 在最佳反应条件下 反应 ，完全连接 （ 片段）所需的酶量 二、选择题 、重组乙肝疫苗是 由重组酵母或重组 工程细胞表达的乙型肝炎表面抗原，经纯化、灭活及加入佐剂吸附制成。前者为重组酵母乙型肝炎疫苗，后者为重组 乙型肝炎疫苗 、基因工程用于药物筛选模型的战略 、控制质粒拷贝数的意义是使外源蛋白在细胞内更稳定 、酵母作为受体，比大肠杆菌的优势在于 大肠：原核 酵母：真核，具有多种细胞器，在用于生产需加工分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势 、分子杂交的化学本质是形成氢键 、 定点突变 的方法是 碱基的添加、删除、点突变
基因工程试题及答案
基因工程试题及答案 【篇一：基因工程题库以及答案】 因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是： (1)____________， (2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和 __________。 4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的___________。 5．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自_______，第二、三两个字母取自_________，第四个字母则用___________表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。 7．第一个分离的限制性内切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_____________。 8．限制性内切核酸酶bsuri和haeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．dna聚合酶i的klenow大片段是用_____________切割dna聚合酶i得到的分子量为76kda的大片段，具有两种酶活性： (1)____________； (2)________________的活性。 10．为了防止dna的自身环化，可用_____________去双链 dna__________________。 11．egta是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的t7 dna聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记dna的基本原理在于利用 _________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链dna分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。 15．反转录酶除了催化dna的合成外，还具有____________的作用，可以将dna- rna杂种双链中的___________水解掉。
基因工程 重点复习
质粒拷贝数即一个细胞内质粒的数量与染色体数量之比。每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数。根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型：严谨型质粒：分子量大，低拷贝数，1－3拷贝 松弛型质粒：分子量小，高拷贝数，10－60拷贝 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 穿梭质粒载体;人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点;①利用大肠杆菌进行基因克隆、表达 ②也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。 ③可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 蓝白斑筛选的机理 由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色 诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 这样，LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变株与带有完整近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的不同突变株之间实现互补，这种互补现象叫做 -互补 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法2. 渗透破碎法(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提 取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用方法：1. 等电点沉淀法2. 盐析法 （四）样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析 蛋白筛选（SDS）实验原理是：在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在SDS-PAGE中，SDS-复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在15kD～200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。
基因工程概论
一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。 1、基因学说的创立 孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论，揭示了在染色体上基因的线性排列。 2、DNA是遗传物质 从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了DNA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DNA是遗传物质。 3、DNA是基因的载体 4、基因是细胞中RNA及蛋白质的“蓝图”。 5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。 6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展，人们对基因的分子结构有了进一步的认识。 7、随着操纵子模型的提出，人们对基因的表达调控有了进一步的认识。 8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、cDNA文库、分子探针、PCR等技术不断被人们运用。 9、目前，不仅能够分离天然基因，还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。 基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科，它的创立和发展，直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步，基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用。 1、三大理论基础： （1）1940年艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNA可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌； （2）1950年沃森（J.D.Watson）和克里克(F.Crick)发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理； （3）1960年关于遗传信息中心法则的确立。 2、三大技术条件： （1）限制性内切核酸酶和DNA连接酶的发现； （2）基因工程载体； （3）大肠杆菌转化体系的建立。 3、应用：