叶绿素荧光分析方法

叶绿素荧光分析方法

叶绿素荧光分析具有观测手续简便,获得结果迅速,反应灵敏,可以定量,对植物无破坏、少干扰的特点。它既可以用于叶绿体、叶片,也可以遥感用于群体、群落。它既是室内光合基础研究的先进工具,也是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。现在人们可以通过叶绿素荧光分析估计量子效率、光合能力,利用荧光参数计算光合电子传递速率、胞间CO2浓度,并且试图利用荧光参数快速筛选遗传变异的植物。有人甚至预言,将来荧光分析可能会代替气体交换测定。20世纪80年代以来,调制荧光仪,特别是便携式荧光仪的商品化,使荧光分析在光合作用研究中得到这样广泛的应用,以至如果不懂荧光分析技术,便很难看懂近年的光合作用研究文献。

1.基本原理

光合机构吸收的光能有三个可能的去向：一是用于推动光化学反应,引起反应中心的电荷分离及后来的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、还原二氧化碳的同化力(ATP和NADPH)；二是转变成热散失；三是以荧光的形式发射出来。由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系,所以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化(图4-1)。实际上,以荧光形式发射出来的光能在数量上是很少的,还不到吸收的总光能的3%。在很弱的光下,光合机构吸收的光能大约97%被用于光化学反应,2.5%被转变成热散失,0.5%被变成红色(在体内,叶绿京的荧光发射峰在685nm左右)的荧光发射出来；在很强的光下,当全部PSII反应中心关闭时,吸收的光能95%～97%被变成热,而2.5%～5.0%被变成荧光发射[l]。在体内,由于吸收的光能多被用于光合作用,叶绿素a荧光的量子产额(即量子效率)仅仅为0.03～0.06。但是,在体外,由于吸收的光能不能

图4-1叶绿素分子的光激发

被用于光合作用,这一产额增加到0.25～0.30[2]。在室温条件下,绝大部分荧光来自PS II 天线[1,3],而不是反应中心的叶绿素a分子[4,5]。这是因为反应中心的叶绿素分子仅占叶绿素总量的几百分之一。叶绿素荧光发射的高峰在685nm(天线色素)和695nm(反应中心)。在体内,决定荧光产额的主要因素是电子的第一个稳定的醌受体QA的氧化还原状态。实际上,在暗适应的健康叶片和良好的叶绿体,所有的QA都处于还原态时的最大荧光产额与所有的QA 都处于氧化态时的最小荧光产额之比大致为5~6[6]。然而,这个比值可以发生很大变化,取决于照光状态和一些处理。多种因素影响荧光强度：激发光强,反应中心对激发能的捕获和转化速率,激发能以热的形式耗散的程度和两个光系统间能量的分配等。当PS II的光化学反应被阻止时,最大荧光产额的减少是反应中心和天线热耗散增加的反映。由于可以测定完整叶片的荧光,叶绿素a荧光诱导动力学可以成为原位检测PS II重要步骤的极好的探针[5]。1.1 叶绿素荧光诱导动力学

当一片经过充分暗适应的叶片从黑暗中转入光下后,叶片的荧光产额会随时间发生规律性的

变化,即kautsky效应[7],记录下来的典型荧光诱导动力学曲线上几个特征性的点分别被命名为O、J、D、P、S、M和T[8.9](图4-2)。在照光的第一秒钟内,荧光水平从O上升到P,这一段被称为快相;在接下来的几分钟内,荧光水平从P下降到T,这一段被称为慢相。快相与PS II的原初过程有关,慢相则主要与类囊体膜上和间质中的一些反应过程包括碳代谢之间的相互作用有关。

图4-2 叶绿素荧光诱导动力学曲线

荧光水平从O到I的上升已经被归因于不能将电子传递到PQ库的失活的PS II中心[10],这些中心具有有功能的水氧化系统,但是对净电子传递没有明显的贡献。在饱和光下,当反应中心的电荷分离速率超过从QA到QB的电子传递速率时,I水平大大提高[11]。从D到P的荧光增加是由于Fd-NADP氧化还原酶以前电子传递链中电子受体的还原[4]。荧光水平从FO到FP(当光强不足以使全部PS II反应中心关闭时)的上升受多种因素的影响:①PS II的协作性;②PS II的异质性;③PQ库的大小及其重新氧化的速率;④PS II以外的电子传递速率,包括碳同化;⑤向

P680+供给电子的速率。荧光水平到达Fm表明QA已经完全还原[12]。结合在D1蛋白上QB 部位的DCMU能够阻断QA－向PQ的电子传递,所以在这种抑制剂存在时比没有它时从F。到Fm的荧光水平上升快得多。从F。上升到Fm所需要的时间的一半(T1/2)是估计PQ库大小的一个简单的指标。与阳生叶相比,阴生叶具有大的叶绿素天线和小的PQ库,因此表现出一个短的T1/2[13]。叶龄从幼变老,P、M、T的水平降低,幼叶和老叶无M峰。M峰的出现意味着光合诱导期的结束,快速碳同化的开始。当光合作用受到突然干扰(高光强、高CO2、磷缺乏等)时荧光诱导动力学曲线会出现波动。这时,用叶圆片氧电极同时记录下来的光合氧释放和荧光两条动力学曲线大体上呈镜像对称,但是有一点相位差。这种波动现象可能反映了条件急剧变化后同化力的产生与使用之间的不平衡以及为达到平衡而发生的快速调节过程。但是,在遭受环境胁迫的叶片看不到这样的波动[14],可能是由于胁迫削弱了光合机构的同化力生产和调节能力的缘故。

1.2 低温荧光(77K)

人们通常在植物正常生长的生理温度(文献中常称之为室温)下测定叶绿素荧光。但是,有时为了某种研究的需要,也在液氮(即77K,-196℃)温度下进行观测。在这样的低温下,任何与温度有关的酶反应和电子传递能力对荧光水平的影响都被避免,因此只有原初光化学反应的变化被反映出来[10,12]。77K荧光是测定PS II光化学效率(Fv/Fm)的一个重要工具,多种维管束植物健康而未遭受环境胁迫的叶片的Fv/Fm值为0.832±0.004[15]。77K荧光也常被用于研究两个光系统之间的能量分配,因为在这样的低温下,PS II和PS I分别在695nm和735nm处(高等植物)有各自的荧光发射峰[6]。PS I在735nm处的荧光增加往往是PS II向PS I增加激发能分配的结果(见第15章)。与室温荧光不同,在77K下,天线和核心复合体不同组分之间激发能的快速平衡是不可能的。因此,在关于天线和反应中心组织结构的研究中,77K荧光光谱分析具有重要的用途。

1.3 调制荧光

在用于叶绿素荧光测定和猝灭分析仪器上的一个革命性进展,就是使用调制光于测定系统中

[16]。在这样的系统中,用于测定荧光的光源被调制,也就是使用以很高频率不断开关的光源。并且,在这样的系统中,使用的检测器通过选择性放大仅仅检测被这种调制光激发的荧光。因此,利用这样的系统,不仅可以大大提高信号/噪声的比例,而且还可以在背景光,特别是在田间很强的太阳光存在的情况下测定相对的荧光产额。Schreiber(1986)[17]及其同事(1986)[18]研制的PAM荧光仪(德国Walz公司制造)就是这样的调制式荧光测定系统,用它可以测定Fo、Fo'、Fm、Fm‘、Fs,计算Fv/Fm、(Fm'-Fs)/Fm'、NPQ、qp和qN等。

1.4 荧光猝灭

荧光猝灭就是荧光产额降低。一切使荧光产额低于其最大值的过程,都被称为荧光猝灭过程。对于不同荧光猝灭组分的分辨,能够提供关于光合机构功能状态的重要资料。荧光猝灭可分两类:光化学猝灭,即由光化学反应引起的荧光产额的降低,它有赖于氧化态QA的存在。非光化学猝灭,即由非光化学过程例如热耗散过程引起的荧光产额的降低。它是植物体内光合量子效率调节的一个重要方面[19]。非光化学猝灭涉及三个不同的机理[20]:

qE――依赖类囊体膜内外的质子浓度差,暗弛豫的半时间t1/2<1min,快相。

QT――依赖状态1向状态2的转换,PS II的捕光复合体磷酸化,脱离PS II,从类囊体的基粒区迁移到间质片层区,从而减少激发能向PS II的分配,增加激发能向PS I的分配,t1/2=8min,中间相。它比qE和qI小得多,强光下qE和qI增加,而qT受抑制。

QI――与光合作用的光抑制有关,它常表现为可变荧光与最大荧光比值的降低,t1/2=40min,慢相。关于这后一种非光化学猝灭,有三种假说。假说一：这种非光化学荧光猝灭起源于PS II 的反应中心,部分PS II中心发生变化,虽然还能捕捉激发能,但不能进行光化学反应,而把能量变成热。假说二：这种非光化学荧光猝灭起源于PS II的天线色素,它通过非辐射能量耗散消耗激发能,与叶黄素循环过程中生成的玉米黄素有关。假说三:这种非光化学荧光猝灭与D1蛋白(曾用名QB蛋白)的失活和降解有关。

2 荧光参数

关于各种荧光参数的命名和定义,在不同时期和不同作者的文章中很不一致。对于Fo、Fi、Fp、Fs、Fm、Fm'、Fo'、Fv和Fv',这里采用的基本上是van kooten和Snel(1990)[19]统一的命名。

2.1 基础参数

Fo――有多种名称,最小(minimal)、基底(ground)、暗(dark)、初始(initial)和不变

(un-changed,constant)荧光强度等。它是已经暗适应的光合机构全部PS II中心都开放时的荧光强度,qp=1,qN=0。绝大部分学者都认为,Fo荧光来自天线叶绿素(Chl)a[12]。

Fi――荧光诱导动力学曲线O-I-D-F-T中I水平的荧光强度。

Fp――荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中P水平的荧光强度。

Fs――荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中T水平的荧光强度。

Fm――黑暗中最大(maximum)荧光,它是已经暗适应的光合机构全部PS II中心都关闭时的荧光强度,qp=0。这时所有的非光化学过程都最小,qN=0,这是标准的(classical)最大荧光。

Fm'――光下最大荧光,在光适应状态下全部PS II中心都关闭时的荧光强度,qp=0,qN≥O。Fm'受非光化学猝灭的影响,而不受光化学猝灭的影响[4]。

Fo'――光下最小荧光,在光适应状态下全部PSII中心都开放时的荧光强度,qp=1,qN≥0。为了使照光后所有的PSII中心都迅速开放,一般在照光后和测定前应用一束远红光(波长大于

680nm,几秒钟)。

Fv――黑暗中最大可变(variable)荧光强度,Fv=Fm-Fo。

Fv'――光下最大可变荧光强度, Fv'=Fm'-Fo'。

2.2 表明PSII光化学效率的参数

Fv/Fm――没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物叶片PSII最大的或潜在的量子效率指

标,它是比较恒定的,一般在0.80~0.85之间。有时,Fv/Fm也被称为开放的PSII反应中心的能量捕捉效率[1]。Fv/Fo是Fv/Fm的另一种表达方式[12],Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。尽管Fv/Fo不是一个直接的效率指标,但是它对效率的变化很敏感。因为一些处理引起的Fv/Fo变化的幅度比Fv/Fm变化的幅度大得多,所以Fv/Fo在一些情况下是表达资料的好形式。此外,Fm/Fo也是Fv/Fm的另一种表达方式,因为Fm/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。当Fv/Fm为0.86~0.90时,Fm/Fo则相应地为7~10[6]。(Fm'-Fs)/Fm'――作用光存在时PSII的实际的量子效率,即PSII反应中心电荷分离的实际的量子效率[6]。这里,Fs是稳态荧光水平,Fm'是在作用光存在时一个饱和光脉冲激发的荧光水平。计算这个参数不需要准确测定Fo,因此它不受Fo变化的影响[21]。PSII 实际的电子传递的量子效率这个参数[φPSII=(Fm'-Fs)/Fm']不仅与碳同化有关,也与光呼吸及依赖O2的电子流有关[22]。由于它是PSII光化学反应的量子效率,所以可以利用它计算非循环电子传递速率(J)以及体内的总光合电子传递能力[22,23]:J=φPSII×PFDa×0.5这里,PFDa是被吸收的光通量密度(μmol·m-2·s-1),0.5代表光能在两个光系统间的分配系数。如果假设入射到叶片表面的光能平均有84%被叶片吸收,并且平均分配给两个光系统,则上式可以写成[6]:J=φPSII×PFD×0.42。

Fv'/Fm'――开放的PSII反应中心的激发能捕获效率[24]。由它可以计算某PFD下量子效率的相对限制或光合功能的相对限制L(PFD)[22]:qp和Fv'/Fm'的降低。只有当qp=1和Fv'/Fm'=0.83时,L(PFD)=0,即不存在限制。DemEnig--Adams等(1996)提出[25],使用Fv'/Fm'来估计光合机构吸收的光能被用于光化学反应和天线热耗散的相对份额,两者分别为:前者P=Fv'/Fm'×qp,后者D=1-Fv'/Fm'。热耗散的速率为:(1-Fv'/Fm')×PFD。有证据表明,在自然生境中,陆生植物Fv'/Fm'的日变化一般是由PS II天线复合体热耗散水平的变化引起的。这和Fv'/Fm'的变化与NPQ的变化成比例的结果相一致[25]。我们在一个叶绿素缺乏的大麦突变体观察到,突变体光系统II光化学效率(Fv/Fm)比其野生型高,并提出其可能的原因是光系统II向光系统I传递的激发能少[26,27]。

2.3 荧光猝灭参数

qp=(Fm'-Fs)/(Fm'-Fo'),光化学猝灭系数[21]。这里,(Fm'-Fs)代表光化学猝灭的荧光。qp是表示总PSII反应中心中开放的反应中心所占比例的指标,而1-qp则是关闭的反应中心所占比例,反映QA的还原程度,有时被称为PSII的激发压(excitation pressure)[28]。因为氧化态的QA是PSII 电子传递的原初醌受体,它决定PSII的激发能捕获速率,所以光化学猝灭也被称为Q猝灭。qp 和Fv/Fm、φPSII之间有如下关系[23]:Fv/Fm=φPSII/qp。qN=1-(Fm'-Fo')/(Fm-Fo)=1-Fv'/Fv。实际上,qN是一个定量非光化学猝灭的旧术语,它的计算以测定Fo和Fo'为前提,而Fo和Fo'的

测定不准确会造成计算结果的偏差。NPQ=(Fm-Fm')/Fm'=Fm/Fm'-1。这里(Fm-Fm')代表非光化学猝灭的荧光[6,22,23,29]。NPQ的变化反映热耗散的变化。这个计算不需要测定Fo和Fo',但是必须测定一个充分暗适应叶片的参比值Fm,最好是经过一个夜晚暗适应的黎明时刻的Fm值,这时光化学效率最大,而热耗散最小。

3 测定与分析

3.1 光源

荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源:

(1)检测光――绿光,光强PPFD小于10μmol·m-2·s-1,用于测Fo。

(2)作用光――通常用白光,用于推动光合作用的光化学反应,光强可因实验目的不同而变化。

(3)饱和脉冲光――通常用自光,光强PPFD大于3000μmol·m-2·s-1,确保QA全部还原,用于测Fm和Fm'。

(4)弱远红光(或暗)――以便PSI推动QA氧化,测Fo'前使用。

3.2 基本步骤

在植物对各种环境胁迫响应的分子机理研究中,为了获得未遭受任何环境胁迫的对照叶片的

基本荧光参数,首先需要让对照叶片经过一个充分的暗适应过程。最好是经过一个黑暗的夜晚。首先,给一个经过充分暗适应的叶片照射检测光,经过一小段时间(1~2min)荧光水平稳定后得到荧光参数Fo。接着,给一个饱和脉冲光,一个脉冲后关闭,得到荧光参数Fm,于是得到荧光参数Fv/Fm(Fv=Fm-Fo),即潜在的PS II的光化学效率。其次,打开可以引起叶片光合作用的作用光,一般PPFD为几百μmol·m-2·s-1,可因植物生长条件或实验目的不同而变化,几分钟到几十分钟后叶片光合作用达到稳态,得到荧光参数Fs(图4-3)。这时再给饱和脉冲光一个脉冲后关闭,得到荧光参数Fm',于是可以计算作用光存在时PS II的实际的量子效率(Fm'-Fs)/Fm'和荧光的非光化学猝灭系数NPQ即(Fm-Fm')/Fm'。再次,关闭作用光,立即打开远红光,几秒钟后关闭,这时得到荧光参数Fo',于是可以计算荧光的光化学猝灭系数qp,即(Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')。如果想区分非光化学猝灭的三个不同的组分,可以按Quick和Stitt(1989)[20]的方法进行测定和计算。我们使用这项技术发现,在小麦叶片发育期间这三个组分的相对贡献发生规律性的变化:在刚刚完全展开的旗叶和开始衰老的旗叶qN是类似的。但是在晴天中午,前者中间组分明显降低,而后者的中间组分保持较高水平,并且前者快组分明显高于慢组分,而后者快组分则明显低于慢组分。这些结果说明,保护光合机构免于光破坏的几种不同的机制的相对贡献在叶片发育期间是变化的[30]。另外,我们还曾对珊珊树和大豆叶片的非光化学猝灭及其三个组分的日变化、季节变化等作过一些观测研究[31-33]。

图4-4 叶绿素荧光分析方法示意图图中,Fo、Fm、Fm'、Fs和Fo'分别表示暗适应叶片的初始荧光、最大荧光,在作用光下叶片光合作用达到稳态时的最大荧光、稳态荧光和初始荧光。自从调制式荧光测定技术问世以来,荧光测定和分析技术已越来越广泛地被用于植物主理学和逆境生理学的研究中。例如,光抑制总是导致Fv/Fm的降低,因此Fv/Fm已经被广泛用作光抑制的诊断指标。另外,Fo降低被看作是非辐射能量耗散增加的迹象,而Fo增加被看成是PS II反应中心不可逆破坏或可逆失活的结果。植物对光胁迫的第一个响应似乎是热耗散的增加,它涉及依赖O2的电子流、跨类囊体膜质子梯度(△pH)的形成、叶黄素盾环和PS II反应中心的失活等,以避免光合机构被光破坏。

3.3 值得注意的问题

(1)测定温度:在20℃以下测定时,由于光导纤维和叶片之间的温差引起探头表面结水,造成低估qp。

(2)叶绿体运动:光引起的叶绿体运动会导致高估qN,防止办法是从作用光中除掉能引起叶绿体运动的光(<510nm)。

(3)叶片表面特性:叶片上下表面特性不同,导致不同的Fv/Fm。

(4)获得荧光资料的手续是简单的、容易的,但是对这些资料的解释却是复杂的、困难的。因此,在根据荧光测定资料做出结论之前,做另一些指标的平行的测定是很必要的。也就是说,最好将荧光分析与其他方法相结合,特别是与气体交换测定相结合,以便看清植物对环境变化响应的全景。可能在相当长的时期内,使用红外气体分析技术的气体交换测定仍将处于植物生理生态研究的中心地位[23]。