人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因mRNA表达的研究
姜黄素逆转肿瘤多药耐药的研究进展
分是姜黄素（ｃｕｒｃｕｍｉｎ，Ｃｕｒ），具有多方面的药理作用，如抗炎、 抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化及抗肿瘤等。Ｃｕｒ逆转
肿瘤多药耐药的作用已日益引起人们的重视，成为近年来研究
的热点。现将肘肿瘤多药耐药机制及Ｃｕｒ对其逆转的研究进
因的表达。从而逆转其对阿霉索的耐药。Ｖａｒａｄｋａｒ等［１６］发现
亡诱导药物的敏感性。 １．３凋亡相关基因介导的肿瘤多药耐药许多化疗药物都是 通过诱导细胞凋亡来杀伤肿瘤细胞的，所以说阻ｌｆ：细胞凋亡可
酶等共同完成，当肿瘤细胞中这些酶的活性增强或合成增加
时，ＤＮＡ的修复机制加强，削弱了抗癌药物的作用，从而导致
ＤＮＡ复制所必需的酶。Ｌｅｅ等［５］发现无糖状态下的人结肠癌 细胞ＨＴ－２９中的ＴｏｐｏⅡ表达降低。致使肿瘤细胞对鬼臼乙叉
苷等抗肿瘤药物产生耐药，而使用链霉菌属的分离物ＡＡ一９８
耐药。Ｙａｎｇ等¨¨用反义寡核苷酸技术特异性抑制人胃癌细 胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ中的ＨＳＰ２７后，发现其对长春新碱及阿霉 素更加敏感，再用免疫共沉淀检测ＨＳＰ２７后发现其具有ＤＮＡ 修复功能。
等【ｌ川将Ｃｕｒ作用于人乳腺癌细胞ＭＣＦ－７及ＭＣＦ－７ＡＨＲ，发 现其能通过抗透明质酸酶反应（ＡＨＲ）依赖信号途径，有效降
低细胞中ＢＣＲＰ的表达。
２．２
Ｃｕｒ逆转酶系统介导的肿瘤多药耐药
Ａｎｄｊｅｌｋｏｖｉｅ等¨］
研究发现，Ｃｕｒ作用于人非小细胞肺癌耐药细胞ＮＣＩ—Ｈ４６０／Ｒ 后，能使细胞中ＴｏｐｏⅡ和ＧＳＴ下调，增加药物的细胞毒性，使 细胞周期停滞于Ｓ期和Ｇｚ／Ｍ期，以及增加ｐ５３等凋亡相关基
［１ ７３ Ａｎｔｍａｎ ＥＭ，Ｈａｎｄ Ｍ。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ Ｐｗ，ｅｔ ａ１．２００７ ｆｏ—
多 药 耐 药(MDR)
多 药 耐 药（ＭＤＲ） 肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍，也是白血病化疗效果改善缓慢的主要原因。
尽管各种新的化疗药物和新的治疗方案连续不断地推出，但是收效却总是不太令人满意。
在临床上，许多肿瘤特别是白血病的初次化疗一般可取得较好的结果，然而最终仍难免要复发，且复发后的治疗效果往往较差，其主要原因就是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药性。
据估计，癌症死亡中有90%以上存在着耐药这一现象。
因此对肿瘤耐药现象的研究与治疗方法的研究具有同样的重要性。
肿瘤细胞的耐药性可分为原发性耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance）。
前者在化疗前就存在于肿瘤细胞中，与药物的使用无关，后者是由化疗药物诱导产生的，即在药物使用前对药物敏感，而在药物应用后产生的耐药。
获得性耐药根据耐药谱不同可分为原药耐药（primary drug resistance, PDR）和多药耐药（multi resistance, MDR）。
原药耐药只对使用过的药物产生耐药，对其他药物不产生交叉耐药，而多药耐药则是由一种药物诱发，而同时对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐药，导致一些联合化疗方案的失败。
一，肿瘤细胞耐药机制白血病治疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞对化疗药物产生了耐药。
虽然人们作了很大的努力来证明肿瘤细胞产生耐药的机制，但总的来说耐药的形成过程的了解还很少，从实验观察到的结果，可以归纳为以下几方面。
（一）药物吸收减少药物对肿瘤细胞的杀伤作用，依赖于进入细胞内的药物浓度。
许多药物通过细胞膜进入细胞，这是个个主动的领带能量的过程，与药物浓度梯度有关。
参与此过程的载体蛋白结构的改变，可导致细胞对药物吸收的减少，细胞内有效药物浓度降低，其后果就细胞对药物产生耐药性。
对MTX转运的研究认为，耐药性的产生可由于药物与细胞膜结合载体蛋白的亲和力下降，或者细胞所表达的载体蛋白的数量下降。
肺癌化疗中铂类耐药的研究进展
肺癌化疗中铂类耐药的研究进展张亚娟;常德;张健鹏【摘要】铂类化疗药物是治疗多种恶性肿瘤的基础用药,在非小细胞肺癌中,铂类联合其他药物仍是治疗的主要方案,早期效果显著.随着疗程进展,肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是影响疗效和预后的重要因素,其耐药机制复杂,如膜蛋白表达异常、DNA 修复功能增强、凋亡调控机制异常、细胞解毒功能增强等.本文总结了肺癌细胞铂类耐药的一些主要机制,以期帮助开发新的靶点类似物或抑制剂,与铂类药物联合使用提高疗效.%Platinum-based chemotherapy is the the cornerstone of treatment of many binations of platinum drugs with other agents are still the mainstream therapies for non-small cell lung cancer, showing significant effectiveness in an early phase.Along with the treatment, the tumor cells can become resistant to chemotherapy drugs, which affect the efficacy and prognosis.The mechanisms of drug resistance are complicated, including abnormal expressions of membrane proteins, enhanced DNA repair functions, abnormal regulation mechanisms of apoptosis, and enhanced cellular detoxification function.In this article we summarize some of the main mechanisms of platinum resistance in lung cancer cells, with an attempt to identify new potential target analogues or inhibitors and improve the efficacies of the combined use of platinum-based drugs.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2017(039)001【总页数】6页(P150-155)【关键词】肺癌化疗;铂类化疗药物;耐药机制【作者】张亚娟;常德;张健鹏【作者单位】中国人民武装警察部队总医院呼吸内科,北京100039;锦州医科大学临床医学系,辽宁锦州121001;中国人民武装警察部队总医院呼吸内科,北京100039;中国人民武装警察部队总医院呼吸内科,北京100039【正文语种】中文【中图分类】R73肺癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率增长迅速，多数患者发现时已属晚期，丧失了手术机会，因此化疗是肺癌治疗的主要手段。
RPN2基因促进乳腺癌多西紫杉醇耐药
Ｓ ＡＴ Ｔ ３抑 制 剂 所 抑 制 ， 并 不 能 通 过 Ｐ ３ 和 ＭＥ Ｅ Ｋ 而 但 ＩＫ Ｋ／ Ｒ 抑 制 之 。而 且 ， 成 性 激 活 的 Ｓ Ｔ３可 明显 活 化 Ｔｗ ＩＴ 启 组 ＴＡ ｓ
Ｍｅ ， ０ ８ １ （ ） ９ ９ ９ ８ ｄ ２ ０ ，４ ９ ：３—４ ．
Ｔ Ｓ １ 表 达 与 原 发 结 直 肠 癌 淋 巴 结 浸 润 以 及 男 性 性 别 有 ｗＩ Ｔ 过
关
ＴＷ Ｉ Ｔ１ ｖ ｒ ｘ ｅ ｓ ｏ ｉ ａ ｓ ｃ ａ ｅ ｗｉ ｈ Ｓ ｏ ｅ ｅ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｓ ｓ ｏ ｉ ｔ ｄ ｔ ｎｏ ａｌ ｎｖ ｓ ｏ ｄ ｉ ａ ｉ ｎ ａ ｄ ｎ
（ Ｐ ２ 基 因 可显 著促 进 多 西 紫 杉 醇 诱 导 的 ＭＣ ７ＡＤ 细 胞 Ｒ Ｎ） Ｆ一 Ｒ 凋亡 。 由 多药 耐 药 基 因 ＭＤ 编 码 的 蛋 白产 物 Ｐ糖 蛋 白 （ — Ｒ１ 一 Ｐ ｇ ） 导 的多 药 耐 药 被 认 为 是 肿 瘤 细 胞 抵 抗 传 统 化 疗 药 物 的 Ｐ介 经典 机 制 ， Ｐ Ｒ Ｎ２基 因沉 默 可 降 低 Ｐｇ —Ｐ糖 基 化 而 导 致 其 膜 定 位 受 阻 ， 而 增 加 ＭＣ ７ＡＤ 细 胞 多 西 紫 杉 醇 的敏 感 性 。体 进 Ｆ一 Ｒ
陈 玉 乐摘 译 贺 大 林 审 校
ＲＮ Ｐ ２基 因促 进 乳 腺癌 多 西 紫 杉 醇 耐 药
Ｒ ＰＮ２ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｄｏ ｅ ａ ｅ ｒ ｓ ｓ ａ ｅ ｉ ｂｒ ａ ｔ ｃ ｎｃ ｒ Ｎａ ｇ ｎｅ ｏ ｆ ｒ ｃ ｔ ｘ ｌ ｅ ｉ ｔ ｎｃ ｎ ｅｓ ａ ｅ ． ｔ
P-glycoprotein的新功能在肿瘤研究中的进展
P-glycoprotein的新功能在肿瘤研究中的进展张飞;牛瑞芳【摘要】肿瘤多药耐药性（multiple drug resistance，MDR）的发生往往伴随着多药耐药基因如MDR1、MRP1和BCRP等高表达，其中MDR1基因编码的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是目前公认可以诱发癌细胞发生MDR的重要分子。
传统研究认为P-gp主要是作为一个药物泵将化疗药物从细胞内排出从而导致MDR。
然而系列研究发现，除了介导MDR以外，P-gp还能够调节癌细胞的生长、增殖、凋亡、迁移和侵袭等其他生物学行为；而且研究表明P-gp的这些作用可以依赖，也可以不依赖于其药物泵的功能。
这些结果表明P-gp能够通过一些新的机制促进肿瘤的进展。
本文主要针对P-gp在促进肿瘤进展中的作用进行综述。
%The acquisition of multiple drug resistance (MDR) phenotype is associated with the overexpression of multidrug resis-tance-associated genes, such as MDR1, MRP1, and BCRP. P-glycoprotein (P-gp), encoded by MDR1, is one of the most extensively characterized MDR transporters in cancer. P-gp mainly functions as a drug pump that excretes chemotherapeutic drugs from cancer cells. However, P-gp participates in cancer progression-related processes, such as cancer cell proliferation, growth, apoptosis, migra-tion, and invasion. Several functions are independent of drug transporter activities. These data suggest that novel mechanisms are em-ployed by P-gp to promote cancer progression. Thus, novel functions of P-gp should be understood and mechanisms by which P-gp pro-motes cancer aggravation should be determined to improvecancer diagnosis and treatment. In this review, recent research progress on novel contributions of P-gp to cancer progression is summarized.【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】5页(P632-636)【关键词】P-glycoprotein;多药耐药;增殖;凋亡;迁移;上皮间质转化;血管生成【作者】张飞;牛瑞芳【作者单位】天津医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室天津市300060;天津医科大学肿瘤医院，肿瘤研究所公共实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市肿瘤防治重点实验室，乳腺癌防治教育部重点实验室天津市300060【正文语种】中文P-gp（P-glycoprotein，P-gp）是1976年由Juliano等［1］在中国仓鼠卵巢癌耐药细胞中发现的一种跨膜蛋白，是第一个被发现能够介导肿瘤细胞多药耐药的蛋白，也是目前公认与癌细胞多药耐药关系最为密切的蛋白［1-2］。
紫杉醇高分子前药
紫杉醇⾼分⼦前药紫杉醇⾼分⼦前药摘要: 紫杉醇是⼀种⾮常有⽤的药物且应⽤⾮常之⼴。其具有极⾼的开发利⽤价值，是继阿霉素和顺铂之后，⽬前世界上最好的抗癌药物。紫杉醇前体药物很好地解决了紫杉醇⽔溶性差的问题，可避免辅助溶剂聚氧⼄烯蓖⿇油(Cremophor EL)的毒性问题，因此，临床使⽤⽆需抗过敏预处理。其在药代、药效及毒副反应⽅⾯具有明显优势，临床应⽤前景良好。本⽂将对其历史、抗癌机理，以及紫杉醇前体药物的研发及其临床应⽤进展。
关键词:紫杉醇作⽤机制研究前体药物近年来，⼴谱抗肿瘤药物紫杉醇及其前体药物的研究开发⼀直是作为研究的热点。紫杉醇前药作⽤机制独特，对很多耐药瘤株均有效，20世纪90年代起紫杉醇制剂在全球包括美国、中国等在内的近40个国家和地区先后上市。
1紫杉醇前药研究历史紫杉醇前药主要⽤于卵巢癌和乳腺癌治疗，其对肺癌、结肠直肠癌、⿊⾊素瘤、头颈部癌、淋巴瘤及脑瘤也有⼀定疗效。有关紫杉醇前体药物开发主要在于改善其⽔溶性，克服紫杉醇⽔中溶解度低的问题，同时降低药物毒性和提⾼抗肿瘤活性也是研究的⽬标之⼀。
1.1紫杉醇概述紫杉醇于1967 年为美国北卡罗莱纳州三⾓研究所发现，其英⽂名为Taxol。它来源于红⾖杉科植物红⾖杉的⼲燥根、枝叶以及树⽪。其外观为⽩⾊结晶体粉末。⽆臭，⽆味。微溶于⽔，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。它的分⼦式为C47H51NO14，分⼦量853.92，结构式如下图：
紫杉醇的化学名称为5β，20-环氧-1，2α，4，7β，10β，13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-⼆⼄酸酯-2-苯甲酸酯-13[（2’R，3’S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]。同其它抗癌药物⼀样，紫杉醇在使⽤时也会出现过敏反应与副作⽤。过敏反应轻微症状为⾯潮红、⽪肤反应、⼼率略快、⾎压稍降，严重反应为⾎压低、⾎管神经性⽔肿、呼吸困难、全⾝寻⿇疹等。副作⽤有指趾⿇⽊、⼀过性⼼动过速和低⾎压、关节和肌⾁疼痛、消化道反应、轻度脱发以及胆红素、碱性磷酸酶、⾕草转氨酶升⾼等。
地塞米松诱导肺腺癌对紫杉醇耐药与Survivin基因表达
地塞米松诱导肺腺癌对紫杉醇耐药与Survivin基因表达康马飞;李林凤【摘要】目的观察不同浓度地塞米松(DEX)预处理后,再予紫杉醇(PTX)干预后人肺腺癌细胞的耐药情况及Survivin基因mRNA及蛋白表达的变化.方法用四唑盐(MTT)试验测定不同浓度PTX作用于肺腺癌A549细胞后的细胞存活率,筛选出PTX的半数抑制浓度(IC50).用不同浓度DEX预处理A549细胞后,再予不同浓度PTX作用于A549细胞,用MTT试验测定细胞存活率,用RT-PCR和Western Blot 法检测细胞中Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平.结果不同浓度的DEX预处理A549细胞后能诱导其对PTX产生耐药,细胞耐药率随DEX浓度的增加而增高.Survivin基因mRNA和蛋白的表达水平随DEX浓度的增加而增高.结论地塞米松能诱导肺腺癌细胞对紫杉醇产生耐药,其机制可能与地塞米松诱导肺腺癌细胞抗凋亡基因Survivin基因表达增加有关.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2015(013)033【总页数】3页(P1-3)【关键词】地塞米松;肺肿瘤;Survivin;抗凋亡基因;癌;细胞系;抗药性【作者】康马飞;李林凤【作者单位】桂林医学院,广西桂林541001;桂林医学院,广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R734.2化疗是治疗恶性实体瘤的主要手段之一，糖皮质激素因能促淋巴细胞凋亡，广泛用于淋巴、血液系统肿瘤及其他肿瘤的联合治疗（如止吐，某些化疗药物使用前的预处理）。
然而，新的资料表明，糖皮质激素能诱导大多数恶性实体瘤产生化疗耐药，但机制尚未完全明确。
本研究通过不同浓度地塞米松预处理肺腺癌细胞后再给予紫杉醇干预，观察细胞耐药发生情况及细胞耐药发生与抗凋亡基因survivin基因表达的变化关系，以探讨地塞米松诱导实体瘤化疗耐药的机制。
1.1 材料：①细胞株：采用人肺腺癌A549细胞株（中科院细胞库提供）。
参芪扶正注射液调节多药耐药相关蛋白7改善紫杉醇和吉西他滨非小细胞肺癌耐药
参芪扶正注射液调节多药耐药相关蛋白７改善紫杉醇和吉西他滨非小细胞肺癌耐药李㊀磊(新汶矿业集团有限责任公司中心医院药学部,新泰㊀２７１２３３)摘要:目的㊀探讨参芪扶正注射液改善肺癌细胞紫杉醇和吉西他滨耐药的作用及机制.方法㊀建立不同耐药细胞株,检测细胞存活率㊁胞内药物含量及多药耐药相关蛋白７的表达.结果㊀耐药细胞多药耐药相关蛋白７表达升高;紫杉醇和吉西他滨胞内含量显著降低;参芪扶正注射液能显著升高化疗药对耐药细胞敏感性及胞内药物含量,并降低多药耐药相关蛋白７的表达.结论㊀参芪扶正注射液可改善非小细胞肺癌(N S C L C)对紫杉醇及吉西他滨的耐药性.关键词:紫杉醇;吉西他滨;非小细胞肺癌;联用增效D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００４Ｇ２４０７．２０１８．０４．０２１中图分类号:R９６５㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀㊀文章编号:１００４Ｇ２４０７(２０１８)０４Ｇ０５０７Ｇ０５E f f e c t o f S h e n q iF u z h e n g I n j e c t i o n s o n r e g u l a t i n g t h em u l t i d r u g r e s i s t a n c eＧa s s o c i a tＧe d p r o t e i n７a n d i m p r o v i n g t h e r e s i s t a n c e o f p a c l i t a x e l a n d g e m c i t a b i n e i n n o nＧs m a l l c e l l l u n g c a n c e rL IL e i(D e p a r t m e n t o fP h a r m a c y,C e n t r a lH o s p i t a l o fX i n w e n M i n i n g G r o u p L i m i t e dC o m p a n y,X i n t a i２７１２３３,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t a n dm e c h a n i s mo f S h e n q i F u z h e n g I n j e c t i o n so n t h e r e s i s t a n c eo f l u n g c a n c e r c e l l s t o p a c l i t a x e l a n d g e m c i t a b i n e．M e t h o d s D i f f e r e n t r e s i s t a n c e c e l l l i n e sw e r e e s t a b l i s h e d,c e l l s u r v i v a l r a t e,i n t r a c e l l u l a r d r u g c o n t e n t a n d m u l t i d r u g r e s i s t a n c eＧa s s o c i a t e d p r o t e i n７(M R P７)e x p r e s s i o n w e r ed e t e c t e d．R e s u l t s T h ee x p r e s s i o no f M R P７i nd r u gＧr e s i s t a n t c e l l s i n c r e a s e d;t h e i n t r a c e l l u l a r c o n t e n t o f p a c l i t a x e l a n d g e m c i t a b i n e d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y;S h e n q i F u z h e n g I n j e c t i o n s s i g n i f i c a n tＧl y i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y a n d i n t r a c e l l u l a r d r u g c o n t e n t o f c h e m o t h e r a p y d r u g s a n d d e c r e a s e d t h e e x p r e s s i o n o fM R P７．C o n c l u s i o n S h e n q i F u z h e n g I n j e c t i o n s c a n i m p r o v e t h e r e s i s t a n c e o f n o n s m a l lＧc e l l l u n g c a n c e r(N S C L C)t o p a c l i t a x e l a n d g e m c i t a b i n e．K e y w o r d s:p a c l i t a x e l;g e m c i t a b i n e;n o n s m a l lＧc e l l l u n g c a n c e r;s y n e r g i s t i c e f f e c t㊀㊀肺癌临床高发,我国肺癌发病率逐年上升,其中非小细胞肺癌占所有肺癌的７５％~８０％[１].非小细胞肺癌目前的首选治疗方法是手术,但对于局部晚期不适合手术的患者及术后治疗,化疗仍是主要手段.紫杉醇和吉西他滨是临床非小细胞肺癌治疗的主要药物,但临床多药耐药问题严重影响了两药在临床的有效使用[２Ｇ３].肿瘤细胞多药耐药的机制复杂,多种因素均可导致肿瘤多药耐药的发生,其中肿瘤细胞多药耐药相关蛋白的高表达是导致肿瘤药物耐药的最主要原因[４].多药耐药相关蛋白７(M R P７)是多药耐药相关蛋白家族中的一种,其对紫杉烷类和长春花生物碱类药物具有细胞外排作用[５Ｇ６].研究表明,在使用过紫杉醇(p e c l i t a x e l)或长春瑞滨并产生耐药的非小细胞肺癌细胞中M R P７具有高表达[６].此外,采用实时定量P C R(R TＧP C R)研究证明,在吉西他滨耐药的非小细胞肺癌中M R P７的基因表达也明显增高,基因组学研究表明,在乳腺癌细胞中M R P７的基因高表达是预测吉西他滨耐药的重要指标[７Ｇ８].参芪扶正注射液是我国传统扶正补气药物,主要成分是党参和黄芪,具有益气扶正㊁益肺健脾的功效[９Ｇ１０].近年临床将参芪扶正注射液用于非小细胞肺癌的辅助治疗,疗效明显.研究表明,参芪扶正注射液配合紫杉醇在治疗非小细胞肺癌中可提高化疗疗效㊁减轻化疗毒性;配合吉西他滨化疗治疗老年晚期非小细胞肺癌,能减轻化疗的毒性和不良反应[１１Ｇ１４],并通过抑制基质金属蛋白酶９(MM PＧ９)的活性而抑制肿瘤的生长和转移[１５].研究发现,参芪扶正注射液可通过调节多药耐药基因(m u l t i d r u g r e s i sＧt a n c t,M D R１)和肺耐药蛋白(l u n g r e s i s t a n c e p r oＧt e i n,L R P)的蛋白表达,改善非小细胞肺癌顺铂耐药[１６].但参芪扶正注射液与紫杉醇和吉西他滨联用提高疗效的作用机制还有待研究.因此,本研究将建立紫杉醇和吉西他滨非小细胞肺癌耐药细胞株,考察参芪扶正注射液对紫杉醇和吉西他滨在非小细胞肺癌耐药方面的改善作用及其机制.１㊀仪器与试药１．１㊀仪器㊀H FＧ９０型二氧化碳培养箱(中国力康生物科技公司);T e c a n M p r o２００多功能酶标仪(瑞士T e c a n公司);B S CＧⅡA２生物洁净工作台(苏州安泰空气有限公司).１．２㊀试药㊀非小细胞肺癌细胞株A５４９,购自中国科学院上海细胞库;D M E M培养基㊁胎牛血清(F e t a l７０５西北药学杂志㊀２０１８年７月㊀第３３卷㊀第４期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e tb o v i n e s e r u m,F B S),购自G I B C O公司;３Ｇ(４,５Ｇ二甲基噻唑Ｇ２)Ｇ２,５Ｇ二苯基四氮唑溴盐和MT T,购自S i gＧm a公司,质量分数９５％;紫杉醇(质量分数９８％,批号３２５０２２),吉西他滨(质量分数９５％,批号B I F K００２３),均购自北京百灵威科技有限公司;甲醇㊁乙腈均为分析纯(美国F i s h e r公司);其他试剂均为国产分析纯.２㊀方法２．１㊀紫杉醇和吉西他滨耐药A５４９细胞的建立㊀采用逐步增加药物浓度的方法,持续刺激A５４９细胞,分别建立紫杉醇和吉西他滨耐药细胞,取对数生长期A５４９细胞,分别加入紫杉醇和吉西他滨使其作用浓度为１和３n m o l L－１的低浓度持续作用于A５４９细胞,保证A５４９细胞在该药物浓度下稳定生长㊁传代;待细胞适应紫杉醇和吉西他滨并可稳定增殖时,增加紫杉醇和吉西他滨的作用浓度(３和５n m o l L－１)继续培养,维持药物浓度直至存活细胞能在此浓度下稳定生长㊁传代;２个月后获得稳定的紫杉醇和吉西他滨非小细胞肺癌耐药细胞株[１７].２．２㊀MT T法检测紫杉醇和吉西他滨耐药A５４９细胞存活率㊀将紫杉醇和吉西他滨耐药A５４９细胞以２ˑ１０４个 孔－１接种于９６孔板中,细胞贴壁后,在３７ħ㊁体积分数为５％的C O２孵箱中孵育２４h,后加入不同浓度的紫杉醇和吉西他滨并设置空白对照,每孔总体积为２００μL,孵育２４h后吸出培养基,每孔２００μL,各浓度设５个复孔,培养１２h,用于MT T检测;每孔加入质量浓度为５m g m L－１的MT T溶液１００μL,继续孵育４h,吸去MT T液;每孔加入２００μL D M S O,振荡１５m i n,使D M S O充分溶解,在４９０n m 波长处用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值.２．３㊀M T T法检测参芪扶正注射液联合紫杉醇和吉西他滨对耐药A５４９细胞存活率的影响㊀将紫杉醇和吉西他滨耐药A５４９细胞以２ˑ１０４个 孔－１接种于９６孔板中,细胞贴壁后,在３７ħ㊁体积分数为５％的C O２孵箱中孵育２４h后,加入含有不同剂量的参芪扶正注射液的培养基及紫杉醇和吉西他滨并设置空白对照,每孔总体积为２００μL,孵育２４h后吸出培养基,每孔２００μL,各浓度设５个复孔,培养２４h后,用于M T T检测;每孔加入质量浓度为５m g m L－１的M T T溶液１００μL,继续孵育４h后,吸去M T T液;每孔加入２００μL D M S O,振荡１５m i n,使D M S O充分溶解,在４９０n m波长处用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值,以对照组吸光度值为对照,计算细胞相对存活率.２．４㊀胞内紫杉醇和吉西他滨的浓度检测㊀将A５４９细胞及耐药A５４９细胞以５ˑ１０６个 孔－１接种于６孔板中,细胞贴壁后培养１２h,在含有１０n m o l L－１紫杉醇和２０n m o l L－１吉西他滨的培养液中培养４h,用冷P B S缓冲液冲洗２次,以２７００r m i n－１离心５m i n,然后用高效液相色谱仪测定细胞内紫杉醇和吉西他滨的含量(浓度用测定每５ˑ１０６个细胞中的紫杉醇和吉西他滨含量表示).另外,测定联合给予参芪扶正注射液后,细胞内紫杉醇和吉西他滨的含量.紫杉醇色谱条件为:色谱柱D i a m o n s i lC１８(２５０m mˑ４ ６m m,５μm);柱温:２５ħ;流动相比例为水ʒ甲醇ʒ乙腈＝２５ʒ４０ʒ３５;流速:１m L m i n－１;检测波长:２５４n m[１８Ｇ１９].吉西他滨检测条件:色谱柱P h eＧn o m e n e xC１８(２５０m mˑ４．６m m,５μm);炔诺酮为内标;流动相为甲醇ʒ乙腈ʒ水＝４０ʒ３０ʒ３０;流速:１．０m L m i n－１;检测波长:２２７n m;柱温:４０ħ[２０].２．５㊀W e s t e r nB l o t实验检测细胞中的M R P７㊀对数生长期的A５４９耐药细胞(４ˑ１０５个 m L－１)接种于６孔板中,其中每板设１孔阴性对照,其余４孔细胞贴壁后加入终浓度为６０m L L－１的参芪扶正注射液,培养２４h后裂解㊁收集进行S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白在质量分数为８％的分离胶中电泳,电泳后转膜,２h后蛋白条带转移至硝酸纤维素滤膜中,后将滤膜在质量分数为５％的脱脂奶中封闭１．５h,加入M R P７一抗过夜(１ʒ５００),再加入二抗(羊抗鼠辣根过氧化物酶)２h,在室温条件下孵育６０m i n.采用E C L显色曝光,使用凝胶成像系统扫面分析,同时检测G A P D H蛋白作为内参.２．６㊀统计分析㊀分析结果使用S P S S统计软件,数值用xʃs表示,结果比较采用单因素方差分析和s t u d e n tᶄSＧt检验统计分析.P＜０．０５表示有统计学差异,P＜０．０１表示具有显著统计学差异.３㊀结果３．１㊀紫杉醇和吉西他滨耐药细胞对紫杉醇和吉西他滨的敏感度明显降低㊀通过MT T实验证明紫杉醇和吉西他滨耐药细胞模型,低剂量紫杉醇和吉西他滨诱导建立的A５４９耐药细胞株在同等紫杉醇和吉西他滨给药剂量下(紫杉醇:１．２５,２．５,５,１０,２０和４０n m o l L－１,吉西他滨:６．２５,１２．５,２５,５０,７５和１００n m o l L－１),对A５４９非小细胞肺癌细胞的抑制率相对于正常A５４９细胞显著降低,说明紫杉醇和吉西他滨耐药细胞造模成功,见图１.３．２㊀紫杉醇和吉西他滨耐药细胞内紫杉醇和吉西他滨含量明显降低㊀采用H P L C法检测A５４９细胞中紫杉醇和吉西他滨的含量,实验结果见图２.A５４９耐药细胞内紫杉醇和吉西他滨的浓度显著降低,给予１０n m o l L－１的紫杉醇或２５n m o l L－１的吉西他滨８０５西北药学杂志㊀２０１８年７月㊀第３３卷㊀第４期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e th t t p ://X B Y Z ．c b pt ．c n k i ．n e t 后,正常A ５４９细胞中每５ˑ１０６个细胞中含有紫杉醇１８．２ʃ１．８５和３．１１ʃ０．７４n g;A ５４９耐药细胞中每５ˑ１０６个细胞内紫杉醇和吉西他滨含量分别为４．３８ʃ０．４７和０．７４ʃ０．１７n g.耐药细胞中紫杉醇及吉西他滨含量相对于正常A ５４９细胞差异具有统计学意义(∗P ＜０．０５).图１㊀非小细胞肺癌细胞及耐药细胞抑制率A．正常A ５４９细胞与紫杉醇耐药细胞抑制率;B ．正常A ５４９细胞与吉西他滨耐药细胞抑制率.(n ＝３).F i g ．１T h e i n h i b i t i o n r a t e o f n o r m a l c e l l s a n dd r u g r e s i s t a n c e c e l l s A．t h e i n h i b i t i o n r a t e o f n o r m a lA ５４９c e l l s a n d p a c l i t a x e l d r u gr e s i s t a n c e c e l l s ;B ．t h e i n h i b i t i o n r a t e o f n o r m a lA ５４９c e l l s a n d g e m c i t a b i n e d r u g re s i s t a n c e c e l l s ．(n ＝３)．图２㊀细胞内紫杉醇和吉西他滨的含量A．正常细胞与紫杉醇耐药细胞;B ．正常细胞与吉西他滨耐药细胞.∗P ＜０ ０５,n ＝５.F i g．２T h e c o n t e n t o f p a c l i t a x e l a n d g e m c i t a b i n e i n c e l l s A．n o r m a l c e l l sa n d p a c l i t a x e l r e s i s t a n c ec e l l s ;B ．n o r m a l c e l l sa n d g e m c i t ab i n e r e s i s t a nc e c e l l s ．∗P ＜０ ０５,n ＝５．３．３㊀参芪扶正注射液明显提高紫杉醇和吉西他滨耐药细胞敏感性㊀在含有不同剂量的(５,１５,３０和６０m L L －１)的参芪扶正注射液的培养基中,加入紫杉醇和吉西他滨耐药A ５４９细胞,细胞增殖实验结果见图３,参芪扶正注射液对耐药细胞无明显抑制作用.将含有６０m L L －１的参芪扶正注射液的培养液与不同浓度紫杉醇５n m o l L －１(a )和２０n m o l L －１(b )单独与联合作用于A ５４９紫杉醇耐药细胞后,细胞增殖实验结果见图４.紫杉醇２０n m o l L －１组,细胞存活率为７３．３％ʃ７．５％,而参芪扶正注射液与等剂量紫杉醇联用后,细胞存活率为５２．７％ʃ６．４％,与单一组比较差异具有统计学意义.将含有６０m L L －１的参芪扶正注射液的培养液与不同浓度吉西他滨单独与联合使用后,实验结果见图５.吉西他滨２０n m o l L －１(a )和４５n m o l L －１(b )单一组细胞存活率分别为９２．３％ʃ４．５％和８７．３％ʃ４．６％,而等剂量吉西他滨与参芪扶正注射液联用后,细胞存活率分别为８０ ６％ʃ６ ４％和７４．７％ʃ４．４％,与单一吉西他滨组比较差异具有统计学意义.图３㊀参芪扶正注射液对A ５４９耐药细胞抑制率A ．紫杉醇耐药A ５４９细胞;B ．吉西他滨耐药A ５４９细胞(n ＝５).F i g ．３T h e i n h i b i t o r y r a t eo fS h e n q i F u z h e n g I n je c t i o n so nr e Ｇs i s t a n tA ５４９c e l l sA．p a c l i t a x e lr e s i s t a n t A ５４９c e l l s ;B ．g e m c i t a b i n er e s i s t a n t A ５４９c e l l s (n ＝５)．图４㊀参芪扶正注射液提高紫杉醇在紫杉醇耐药A ５４９细胞中的敏感性注:∗P ＜０．０５v s 紫杉醇２０n m o l L －１,n ＝５.F i g ．４S h e n q iF u z h e n g I n j e c t i o n si m p r o v e dt h es e n s i t i v i t y of pa c l i t a x e l i n p a c l i t a x e l Ｇr e s i s t a n tA ５４９c e l l s N o t e :∗P ＜０．０５v s p a c l i t a x e l ２０n m o l L －１,n ＝５．９０５西北药学杂志㊀２０１８年７月㊀第３３卷㊀第４期h t t p ://X B Y Z ．c b pt ．c n k i ．n et 图５㊀参芪扶正注射液提高吉西他滨在吉西他滨耐药A ５４９细胞中的敏感性注:∗P ＜０．０５,n ＝５.F i g ．５S h e n q iF u z h e n g I n j e c t i o n si m p r o v e dt h es e n s i t i v i t y of ge m c i t a b i n e i n g e m c i t a b i n e Ｇr e s i s t a n tA ５４９c e l l s N o t e :∗P ＜０．０５,n ＝５．３．４㊀参芪扶正注射液明显增加紫杉醇和吉西他滨耐药细胞内紫杉醇和吉西他滨浓度㊀检测细胞中紫杉醇和吉西他滨含量,结果显示,紫杉醇和吉西他滨与参芪扶正注射液联合使用后,紫杉醇耐药A ５４９细胞中每５ˑ１０６个细胞内含有紫杉醇７．２０ʃ１．２７n g ,吉西他滨耐药A ５４９细胞中每５ˑ１０６个细胞内含有吉西他滨１．５ʃ０．４１n g ;与单一给药组比较,每５ˑ１０６个细胞内分别含有紫杉醇和吉西他滨４．３８ʃ０．４７和０．７４ʃ０．１７n g,差异具有统计学意义(∗P ＜０．０５),见图６.图６㊀参芪扶正注射液提高紫杉醇和吉西他滨耐药A ５４９细胞中紫杉醇和吉西他滨的含量注:∗P ＜０．０５v s 单一给药,n ＝５.F i g ．６S h e n q i F u z h e n g I n j e c t i o n s e n h a n c e d t h e c o n t e n t o f p a c l i Ｇt a x e la n d g e m c i t a b i n ei n p a c l i t a x e lo r g e m c i t a b i n e Ｇr e s i s t a n tA ５４９c e l l s ．N o t e :∗P ＜０．０５v s s i n g l e d r u g,n ＝５．３．５㊀参芪扶正注射液明显抑制紫杉醇和吉西他滨耐药细胞中的M R P ７表达㊀W e s t e r nB l o t 实验结果表明,紫杉醇和吉西他滨诱导的A ５４９耐药细胞中M R P ７明显升高,但给予参芪扶正注射液可显著降低耐药细胞中M R P ７表达,见图７.图７㊀参芪扶正注射液对紫杉醇和吉西他滨诱导的A ５４９耐药细胞中M R P ７的影响注:与正常A ５４９细胞比较,∗∗P ＜０．０１;与耐药A ５４９细胞比较,∗P ＜０．０５,n ＝３.F i g ．７T h e e f f e c t o f S h e n q i F u z h e n g I n je c t i o n s o nM R P ７i n p a Ｇc l i t a x e l o r g e m c i t a b i n e Ｇi n d u c e dm u l t i d r u g re s i s t a n c eA ５４９c e l l s N o t e :c o m pa r e d w i t hn o r m a lA ５４９c e l l s ,∗∗P ＜０．０１;c o m Ｇp a r e dw i t hd r u g r e s i s t a n tA ５４９c e l l s ,∗P ＜０．０５,n ＝３．４㊀讨论肿瘤细胞多药耐药是临床肿瘤治疗面临的重要问题,紫杉醇和吉西他滨是临床非小细胞肺癌治疗的主要用药,而耐药是导致紫杉醇和吉西他滨临床治疗失败的主要原因.近期研究发现,M R P ７在紫杉醇和吉西他滨等非铂类肿瘤药物的耐药中具有重要作用,可减少肿瘤细胞中肿瘤药物浓度和肿瘤药物细胞毒性作用.本研究通过建立非小细胞肺癌紫杉醇和吉西他滨耐药细胞株,表明紫杉醇和吉西他滨耐药细胞对紫杉醇和吉西他滨敏感性显著降低,其中M R P ７蛋白表达升高,通过H P L C 法检测胞内紫杉醇和吉西他滨含量,结果表明,２种肿瘤药物在细胞中的含量显著降低;但将参芪扶正注射液与紫杉醇和吉西他滨联合给药后,在紫杉醇和吉西他滨耐药剂量下,可提高该剂量下对细胞增殖的抑制作用;提高细胞中紫杉醇和吉西他滨含量,降低耐药细胞中M R P ７的表达.化疗在非小细胞肺癌N S C L C 的治疗中至关重要,而多药耐药是导致化疗失败的重要原因.M R P ７是新近发现的A T P 结合盒式蛋白(A T P Ｇb i n d i n gc a s Ｇ０１５西北药学杂志㊀２０１８年７月㊀第３３卷㊀第４期s e t t e t r a n s p o r t e r,A B C)家族C族成员,报道显示, A B C家族膜转运体在M D R中起主要作用,M R P７通过外排功能导致化疗药物从肿瘤细胞中向外排出细胞,导致化疗药物靶浓度减少,疗效降低.早期研究发现,M R P７在紫衫醇耐药中发挥着重要作用,但在吉西他滨的耐药中存在争议,近期研究发现,采用M R P７抑制剂千金藤素作用于非小细胞肺癌细胞可明显提高吉西他滨的疗效[７],此外基因组学研究表明,M R P７的高表达在吉西他滨肿瘤耐药中是重要预测指标[８].实验发现,参芪扶正注射液对非小细胞肺癌紫杉醇和吉西他滨耐药细胞M R P７具有一定的抑制作用,可提高肿瘤细胞中紫杉醇和吉西他滨的含量.因此,参芪扶正注射液提高肿瘤患者的化疗效果与抑制M R P７具有一定的关系.而紫杉醇和吉西他滨肿瘤耐药的作用机制复杂,与多药耐药蛋白家族及PＧ糖蛋白㊁微管蛋白和热休克蛋白基因等均有关系[２１Ｇ２２],因此针对参芪扶正注射液对非小细胞肺癌紫杉醇和吉西他滨耐药细胞的逆转作用机制还有待进一步研究.参考文献:[１]㊀S i e g e lR,M i l l e rK D,J e m a lA,e ta l．C a n c e rs t a t i s t i c s,２０１７[J]．C AC a n c e r JC l i n,２０１７,６７(１):７Ｇ３０．[２]㊀M a c k e y JR,M a n i RS,S e l n e rM,e t a l．F u n c t i o n a l n u c l eＧo s i d et r a n s p o r t e r sa r er e q u i r e df o r g e m c i t a b i n ei n f l u xa n d m a n i f e s t a t i o n o ft o x i c i t y i nc a n c e rc e l ll i n e s[J]．C a n c e rR e 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t,２０１７,８(２３):３８０２２Ｇ３８０４３．[２１]董梅,冯奉仪,林晨,等．人肺腺癌吉西他滨耐药细胞系的耐药机制[J]．中华医学杂志,２００４,８４(４):３２３Ｇ３２８．[２２]喻经纬,鲁智豪,高静,等．紫杉醇耐药机制研究进展及研究方向[J]．中国药学杂志,２０１３,４８(１４):１１４７Ｇ１１５０．(收稿日期:２０１７Ｇ１２Ｇ０１)１１５西北药学杂志㊀２０１８年７月㊀第３３卷㊀第４期h t t p://X B Y Z．c b p t．c n k i．n e t。
紫杉醇:具有里程碑意义的天然抗癌药物
紫杉醇：具有里程碑意义的天然抗癌药物刘先芳;梁敬钰;孙建博【摘要】紫杉醇是从红豆杉树皮中分离得到的微量单体成分,作为世界上最优秀的植物抗癌药,紫杉醇及其衍生物是临床上常用的广谱抗癌药.自20世纪70年代发现紫杉醇后,科学家对此类化合物的构效关系、结构修饰、药理药效方面开展了大量研究,并开发出泰素、多西他赛、卡巴他赛、拉洛他赛、信立他赛、康莫他赛等抗癌药.直到40年后的今天,科学家对紫杉醇的研究依然活跃,对其生物合成、真菌培养、新剂型开发等方面也成为新的研究方向.作为源于天然的单体成分开发成新药的成功典范,紫杉醇类化合物的研发历程对当前开发天然新药提供有益的借鉴.本文对紫杉醇的研发及最新进展进行综述,回顾其开发历程及相关研究,以期为天然药物的开发带来新的思考.%As a most effective monomer composition from bark of Pacific Yew,paclitaxel and its derivatives are used in clinical practice as broad spectrum anticancer drugs.Since its discovery in the 1970 s,many researches had been carried out,mainly focusing on themodification,structure-activity relationship and pharmacological activity.The great successes pressed ahead the development of a series of taxol-like drugs,includingtaxol,docetaxel,cabazitaxel,larotaxel.Nowadays,studies of taxol are still the hotpots,which concentrated on the new source such as cultivation of tissue,fungus culture and new dosage forms.As the representative of drugs research from natural source,taxol is worth to be summarized of its history and ongoing development for looking forward to bring new innovation mentality in new drugs.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2017(019)006【总页数】9页(P941-949)【关键词】紫杉醇;天然活性成分;广谱抗癌药;研发历程;研究进展【作者】刘先芳;梁敬钰;孙建博【作者单位】中国药科大学中药学院南京210009;中国药科大学中药学院南京210009;中国药科大学中药学院南京210009【正文语种】中文【中图分类】R283据世界卫生组织（WHO）关于癌症的实况报道，癌症已成为全球第二大死因，2012年约有1400万新发癌症病例[1]，2015年导致880万人死亡，预计今后20年新发病例数将增加70%＊＊＊。
紫杉烷类化合物Lx2-32c对乳腺癌耐药细胞生长抑制作用的研究
作用 。结论 ：Ｉ Ｇ Ｐ 与 Ａｕｏａ Ｑ Ａ １ ｒｒ—Ａ激酶存在相互作用 ，且 Ｉ Ｇ Ｐ 可能通过抑制 Ａ ｒｒ—Ａ Ｑ Ａ １ ｕｏａ
激 酶 的 降解过 程 而维持 其稳 定性 。
紫杉烷类化合物 Ｌ ２ ３ｃ ｘ － ２ 对乳腺癌耐药细胞
生 长抑制作用 的研究
周晴 李燕 陈 晓光
多 聚二磷 酸腺苷核糖聚合酶 （ Ｐ
一１ ）抑制剂
筛选 方法 的建立及化合 物筛选
朱枝 祥 金晶 陈 晓光 北 京 １０ ５ ０ ００ 中 国医学科 学 院北 京协 和 医学 院药 物研 究所
近年来的研究发现 ，Ｐ Ｒ 一１ Ａ Ｐ 作为一种重要的 Ｄ Ａ损伤修复酶 ，在肿瘤细胞耐受化疗药 Ｎ 物过程中起重要作用 ，抑制 Ｐ Ｒ 一１ Ａ Ｐ 活性能够 明显增强抗肿瘤治疗的疗效 ，特别是针对 Ｂ Ｃ Ｒ Ａ 基因缺陷的肿瘤患者疗效更为显著 。本研究将带有 Ｐ Ｒ 一１Ｄ Ａ序列及 ６ Ａ Ｐ ｅＮ 个组氨酸表达序列
员 ，位 于人染色体 １ ｑ６ Ｑ Ａ １ ５ ２ 。Ｉ Ｇ Ｐ 作为骨架蛋 白参与 了许多细胞进程 。Ａｕｏａ ｒｒ—Ａ是 Ａ ｒｒ ｕｏａ 激酶家族的重要成员之一 ，主要调节 中心体和微 管的功能 ，在细胞有丝分裂过程中发挥重要作
用 。Ｉ ＱＧＡＰ １和 Ａｕｏａ ｒｒ—Ａ 在 多数 肿瘤 中 均存 在 过 表 达 ，并 对 肿瘤 的转 移 及癌 症 预 后 有重 要 影
可诱导耐药细胞 出现明显 的凋亡现象 。机制研究表 明 Ｌ ２ ３ｃ ｘ － ２ 可影响耐药细胞通讯 ２ １ 年第二 十八 卷第 二期 ０１
蛋 白各亚 型基 因 的转 录表 达 ，改变 Ｐ—ｇ 、Ｂ Ｒ ｐ Ｃ Ｐ的蛋 白表 达 水平 ，但 对 Ｌ Ｐ及 ＭＲ １蛋 白以 Ｒ Ｐ 及 ａ 管 蛋 白的表 达无 显著 影 响 。由此得 出 ，Ｌ ２ ３ｃ具有 较 强 的抗肿 瘤 耐药 作 用 ，不 仅 对 敏 微 ｘ－ ２ 感 株 细胞 ，对 紫杉 醇耐 药 的细胞 亦 有 明显生 长抑 制作 用 。
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人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因mRNA表达的研究陈一帆;张燕;王强;黄卫东;郭嘉义【摘要】目的建立紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol,探讨结肠癌细胞紫杉醇获得性耐药的可能机制.方法反复用紫杉醇处理结肠癌LoVo细胞,诱导建立结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol;通过MTT法检测细胞药物敏感性,光学显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR法测定细胞中多药耐药基因MDR1、MRP1、LRP、GST-π和TopoⅡ的表达.结果建立的紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol对紫杉醇的耐药指数为42,为高度耐药;对阿霉素及5-氟脲嘧啶也产生强烈的交叉耐药,耐药指数分别为796和187.相较于亲本细胞LoVo,LoVo/Taxol细胞形态发生明显的变化,G2/M期阻滞和细胞凋亡率明显降低(P<0.05).在五种经典的耐药相关蛋白中MRP1、MDR1基因mRNA的转录水平分别提高了37倍和2倍,LRP、GST-π基因mRNA的转录水平分别下降了11倍和3倍(P均<0.05),ToPo II基因转录水平无明显变化.结论成功建立的人结肠癌紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol为典型的多药耐药细胞模型,其耐药机制可能与MRP1基因的过表达有关.%Objective To establish a paclitaxel resistant cell line LoVo/Taxol and to investigate the mechanisms of Taxol resistance in colon cancer cells.MethodsDrug-resistant cell line LoVo/Taxol was induced by exposing LoVo parent cells to moderate concentration of Taxol. The IC50 and resistant index(RI)to Taxol was determined by MTT assay.The morphological changes of LoVo and LoVo/Taxol was observed by fluorescence microscope and transmission electron microscopy,cell cycle distribution and apoptosis of cell lines were examined by flowcytometry while the mRNA expressions of mdr1,mrp1,lrp1,GST-πand TopoⅡgenes was detected by qRT-PCR.ResultsA paclitaxel-resistant human colon cancer cell line,LoVo/Taxol,was successfully established. Compared with the parent cell line LoVo,it was 42-fold resistant to paclitaxel,and 696 and 187-fold resistant to Doxorubicin and 5-fluorouracil,respectively(P<0.05). Moreover,the proportion of G2/M phase decreased significantly(P<0.05),meanwhile,the apoptosis rate ofLoVo/Taxol cells was also decreased significantly(P<0.01)than that of LoVo cells after treated with 1.5μmol·L-1 Taxol for 24h. Over-expression of MRP1 was associated with the development of drug resistance in LoVo/Taxol. ConclusionA stable and paclitaxel-resistant human colon cancer cell line LoVo/Taxol was successfully established and the mechanisms of its drug resistance might be related to the overexpression of the multidrug resistance-associated protein MRP1.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2017(039)005【总页数】6页(P545-549,封2)【关键词】紫杉醇;多药耐药;结肠癌;LoVo/Taxol细胞株;MRP1【作者】陈一帆;张燕;王强;黄卫东;郭嘉义【作者单位】宁夏医科大学基础医学院,银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,银川 750004;宁夏医学科学技术研究所,银川 750004;宁夏医科大学基础医学院,银川750004;宁夏医学科学技术研究所,银川 750004【正文语种】中文【中图分类】R735.35紫杉醇（Paclitaxel，Taxol）是从短叶红豆杉（Taxus brevifolia）的树皮中提取得到的一种具有广谱抗癌作用的新型抗微管药物[1]，临床上主要用于治疗卵巢癌、乳腺癌，其对结肠癌[2-3]、子宫颈癌、肺癌和白血病等恶性肿瘤也有一定疗效。
随着紫杉醇药物的广泛应用，肿瘤对紫杉醇耐药的矛盾日益突出，极大地限制了其临床疗效和应用[4]。
紫杉醇耐药机制十分复杂，涉及多种因素和多个机制[5]，其确切的耐药机制仍不清楚。
目前紫杉醇耐药细胞株的体外研究主要集中在乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、食管癌和肝癌等，而结肠癌紫杉醇耐药的体外研究较为少见，结肠癌LoVo细胞对紫杉醇的耐药性研究尚未见报道。
为此，本文拟采用浓度梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株LoVo/Taxol，对比分析亲本细胞株LoVo与耐药细胞株LoVo/Taxol的生物学特性及多药耐药基因1（MDR1）、多药耐药相关蛋白基因1（MRP1）、肺耐药蛋白（LRP）基因、谷胱甘肽S转移酶π（GST-π）基因和拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）基因的表达差异及意义，进一步探讨结肠癌细胞中紫杉醇获得性耐药的发生机制，为耐药逆转研究提供有价值的实验依据。
1.1 材料1.1.1 细胞株人结肠癌LoVo细胞株（TCHu 82）购自中国科学院上海细胞库，贴壁生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中。
1.1.2 抗体及化学试剂细胞培养用的RPMI-1640培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；紫杉醇、阿霉素、5-FU（上海生工公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所，Dojindo）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；SYBR Premix Ex TaqII染料法荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司）；所有引物均由上海生工公司合成；其它常用试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法1.2.1 结肠癌Taxol耐药细胞株的诱导和建立取对数生长期的LoVo细胞接种于含Taxol的RP－MI-1640培养液中，采用体外浓度梯度递增的诱导方法建立紫杉醇获得性耐药细胞株，首先在LoVo亲本细胞培养液中加入0.05μmol·L-1紫杉醇，培养后大约90%的细胞死亡，10%细胞存活，之后更换正常培养液培养2周，待细胞能稳定培养时，再加入更高浓度的紫杉醇进行诱导培养，以此类推，历时10个月，最终得到了耐药细胞株。
为了比较药物剂量与效应关系，在诱导中间过程，我们留取了部分细胞既LoVo/Taxol 0.7作为中间状态，其余细胞继续进行药物诱导，并最终得到LoVo/Taxol 1.5耐药细胞株。
LoVo/Taxol 0.7为能在含0.7μmol·L-1紫杉醇培养液中长期稳定生长（细胞存活率大于90%），其IC50为12.02μmol·L-1。
LoVo/Taxol 1.5为能在含1.5μmol· L-1紫杉醇培养液中长期稳定生长，其IC50为16.21μmol·L-1。
最后分别检测亲本细胞LoVo、耐药细胞LoVo/Taxol 0.7以及 LoVo/Taxol 1.5的IC50值。
1.2.2 细胞形态学观察收集培养的细胞用2.5%戊二醛固定1h，再用0.1mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液洗3次，每次2h。
之后用1%锇酸固定1h，用0.1mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液洗涤，梯度酒精脱水，环氧丙烷渗透，环氧树脂包埋，行半薄切片，用甲苯胺蓝染色，光镜观察并拍照。
将半薄切片中感兴趣部位定位后行超薄切片，醋酸双氧钠和柠檬酸铅双染，H-7650透射电镜下观察并照相。
1.2.3 耐药指数的测定实验前耐药细胞株需要先脱药培养2周。
将对数期生长的亲本细胞和耐药细胞按每孔5×103个细胞分别接种至96孔培养板中，培养24h后，分别加入紫杉醇、阿霉素以及5-氟尿嘧啶化疗药物，每种药物倍比稀释成8个浓度，每个浓度设3个平行孔，培养48h后，按Cell Counting Kit-8说明书操作，用酶标仪检测450nm处的吸光度值，绘制药物浓度-细胞存活剂量效应曲线，采用Graphpad Prism 5计算半数抑制浓度（IC50），然后依公式分别计算出耐药指数（resistance index，RI），耐药指数=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50，实验重复3次。
1.2.4 流式细胞术检测细胞周期与凋亡实验前耐药细胞株需要先脱药培养2周。
将对数期生长的亲本细胞和耐药细胞用胰蛋白酶消化分离后，离心收集，用70%乙醇固定过夜，离心去上清，PBS清洗2次，加入碘化丙锭（PI）4℃避光染色30min，300目尼龙筛网过滤后，用流式细胞仪在激发波长488nm处检测红色荧光，用MODFIT LT 3.0软件分析比较细胞周期分布变化。
在应用1.5μmol·L-1紫杉醇干预24h后，用流式细胞仪检测LoVo和LoVo/Taxol细胞的凋亡情况。