核酸染色剂

电泳后，核酸需经染色才能显色出带型，常用以下核酸染色剂：

1.溴化乙锭（ethidium bromide, EB）最常用的核酸荧光染料，这种扁平分子可嵌入

核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。激发荧光的能量来源于两个方面，一是核酸吸收波长为260nm的紫外线后能将能量传送给溴化乙锭，二是结合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波长为300nm和360nm的紫外线的能量，来源于这两方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。 EB-DNA 复合物中的EB发出的荧光，比游离的凝胶中的EB发出的荧光强度大10倍，因此无需洗净背景即可清楚观察核酸带型。若EB背景太深，可将凝胶浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非结合的EB褪色，这样可检查到10ng的DNA样品，EB也可用于检测单链DNA或RNA，但其对单链核酸的亲和力相对较小，荧光产率也相对较低。在凝胶或电泳缓冲液中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，染色可在电泳过程中进行，能随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。但EB带正电荷，嵌入碱基后增加了核酸分子的刚性，使迁移率减慢，故不宜用于测定核酸分子量的大小，这时应在电泳后将凝胶浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min进行染色。EB见光易分解，应于4℃避光保存。

2.吖啶橙（acridine orange,AO）：吖啶橙可嵌入双链核酸碱基对之间，在254nm紫外

线激发下发出530nm的绿色荧光；还通过静电与单链核酸的磷酸基结合，在254nm紫外线激发下产生640nm的红色荧光。因此可区分单链和双链核酸，灵敏度分别为0.1μg 和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求严格，应在 22℃，0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盘中用该缓冲剂4℃脱色过夜或22℃脱色1~2小时。

3.银（Ag+）试剂： Ag+与核酸形成稳定复合物，然后用甲醛使Ag+还原成银颗粒。AgNO3

等试剂可使聚丙烯酰胺凝胶上的单链，双链DNA及 RNA都染成黑褐色。银染法的灵敏度比EB染色高200倍左右，比亚甲蓝染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝胶中，能检测出0.5ng的 RNA，其缺点是专一性不强，能与蛋白质，去污剂反应也产生褐色，而且对DNA的染色定量不准确。银与DNA稳定结合，对DNA有破坏作用，不适于DNA 片段回收的制备。

4.亚甲蓝（methylene blue）：可将RNA染成蓝色，但灵敏度不高，而且操作时间长。

染色过程：胶浸泡于0.02%的亚甲蓝，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用净水洗5-8h（反复换水），带型肉眼可见，最低检测量为 250ng。

5.Gold View Ⅰ型核酸染色剂与溴化乙锭：Gold View是一种可代替溴化乙锭（EB）的新

型DNA燃料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA成红色荧光。通过小鼠皮下注射实验，尚未发现Gold View有致癌作用，而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Gold View代替EB不失为一种明智的选择。

实验操作步骤：100mL溶胶液在微波炉中融化，冷却至60℃左右（不烫手）后加入10vL Gold View，轻轻摇匀后倒胶，待胶完全凝固后上样电泳，电泳完毕在紫外灯下观察。

注意事项：

1)胶厚度不要超过0.5cm,胶太厚会影响检测灵敏度

2)加入Gold View的琼脂样凝胶反复融化可能会对DNA检测的灵敏度产生一定影响，但不

明显。

3)Gold View在pH 3.6-7.0之间能更好的与核酸结合，因此电泳时最好使用新鲜的电泳

缓冲液。

4)由于Gold View产生绿色荧光，因此不适合于用一般单色胶卷拍照，可以使用凝胶成像

系统保存图像。

5)含有Gold View的凝胶不适合于进行凝胶回收试验。要进行回收试验，请使用EB胶或

supper GreenⅠ型核酸染色剂。

6)Gold View特别适合于大片段DNA的检测（大于1kb的片段，检测灵敏度与EB相当）；

当DNA片段小于1kb时，检测灵敏度低于EB，特别是低于500bp的片段，Gold ViewⅠ型可能亮度很弱或者检测不到，如要检测小片段的DNA，请选用supper GreenⅠ型核酸染色剂，该染色剂适合检测所有片段大小的DNA片段。

7)虽然尚未发现Gold View有致癌作用，但由于Gold View溶液酸性较强，一次对皮肤，

眼睛会有一定的刺激，操作是应戴手套。