黑曲霉发酵
黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究
黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究黑曲霉固态发酵产纤维素酶条件优化及秸秆糖化研究摘要：纤维素酶在生物能源领域中扮演着重要角色，能够有效降解秸秆等废弃物，并转化为发酵产物，如生物乙醇。
本研究通过固态发酵的方式培养黑曲霉，优化产纤维素酶的条件，并利用优化的酶解液对秸秆进行糖化实验，探究最佳的糖化条件。
关键词：黑曲霉；固态发酵；纤维素酶；秸秆糖化1. 引言随着能源危机的严峻形势和环境问题的日益突出，生物质能源作为一种可再生、环境友好的能源逐渐受到人们的关注。
秸秆作为生物质资源的一种，具有庞大的潜在能量价值，但其利用率低下。
纤维素作为秸秆主要成分之一，具有较高的结晶度和难以降解的特点，传统的物理、化学方法不能有效降解纤维素。
2. 方法及实验步骤2.1 培养黑曲霉产生纤维素酶选择黑曲霉作为研究对象，进行固态发酵培养。
黑曲霉菌种接种于固态培养基中，控制温度、湿度等条件。
根据黑曲霉固态发酵产酶曲线，确定最佳培养时间和培养温度。
2.2 优化产纤维素酶的条件通过单因素实验以及响应面试验，探究培养基配方、碳源浓度、氮源浓度、pH值等因素对纤维素酶产量的影响。
通过分析实验数据，确定最佳的产酶条件。
2.3 秸秆糖化实验利用优化的纤维素酶酶解液对秸秆进行糖化实验。
调整酶解液的酶解时间、温度和pH值等参数，探究最佳的糖化条件。
通过测定糖化液中的还原糖含量，评估糖化效果。
3. 结果与讨论3.1 产纤维素酶的固态发酵条件优化在黑曲霉固态发酵条件下，最佳培养时间为7天，最佳培养温度为32℃。
该条件下，纤维素酶的产量达到最高。
3.2 产纤维素酶的条件优化通过单因素实验和响应面试验优化产纤维素酶的条件，得到最佳培养基配方为：碳源浓度5g/L，氮源浓度4g/L，pH值5.5。
3.3 秸秆糖化效果评估在最佳糖化条件下，糖化液中的还原糖含量达到最高值，说明纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素，释放出糖分。
4. 结论通过本次研究，确定了黑曲霉固态发酵产纤维素酶的最佳条件，并利用优化的纤维素酶对秸秆进行糖化实验，证实了纤维素酶能够有效降解秸秆中的纤维素。
7 黑曲霉发酵柠檬酸
实验目的
了解产物发酵生产的机理； 了解产物发酵生产的机理； 柠檬酸发酵的发酵条件 掌握发酵过程步骤
实验原理
柠檬酸的发酵
80%的糖代谢走EMP途径
生产菌中存在TCA的酶系
草酰乙酸的来源不是由TCA 供应，而是由2个CO2固定 提供，故C0mL三角瓶） 每组2瓶，其中一瓶放置数颗玻璃珠 其他灭菌物品 （每组1套） 小包装1.5mL离心管、蓝色黄色枪头若干， 培 养皿每组1包（每包不少于6个）
问题与思考 影响黑曲霉发酵生产柠檬酸的因 素有哪些？ 素有哪些？ 试设计分离筛选酵母菌发酵生产 酒精实验并阐述酒精产生机理
实验步骤
菌种获得（纯种） 种子液制备 无菌操作，取5mL无菌水至黑曲霉平板上， 用接种环轻轻刮下孢子，用枪吹吸数下制 成孢子悬液。 液体深层发酵 无菌操作，取3mL孢子悬液接种于玉米粉摇 瓶发酵培养基中。在转速为200rpm旋转摇 床上，30℃培养5～6天。
后续实验准备 黑根霉的分离培养 制作马铃薯培养基平板2块 单号组用接种环无菌操作，从酒酿样品中挑取 1环，在1块马铃薯培养基平板上进行划线分离。 双号组取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻珠的无 菌水三角瓶进行稀释溶解，取稀释液0.1mL， 在1块马铃薯培养基平板上进行均匀涂布。 另外一块平板置于冷藏柜备用。 将划好的培养基平板置于517房间30℃培养箱 内正置培养3天，至周一进行结果观察和转接。
柠檬酸发酵的条件： 柠檬酸发酵的条件：
1、合适的碳源（淀粉、麦芽糖、甘露糖 等），高浓度的糖； 2、限制有机氮源、选择适量的无机氮源 （铵盐）； 3、合适的pH值； 4、发酵液中溶氧量要高（摇床的转速 250r/m）； 5、限制重金属离子如Mn2＋、Fe2＋、Zn2＋含 量。
黑曲霉的发展历程
黑曲霉的发展历程
黑曲霉最早可以追溯到公元前3000年的古埃及时期。
当时，
人们意外地发现面团在发酵过程中变黑，产生了一种奇特而美味的香味。
然而，人们并不了解这种黑色霉菌的真正来源和发酵机制。
随着时间的推移，黑曲霉逐渐被用于食品加工。
在中国，黑曲霉是酱油和豆瓣酱等传统调味品的重要成分。
在日本，黑曲霉被广泛应用于酱油、味噌汤和其他传统食品的制作过程中。
黑曲霉能够产生丰富的酶和香气物质，为这些食品增添了风味和口感。
然而，直到20世纪初，人们对黑曲霉的掌控仍然非常有限。
这是因为黑曲霉存在多种亚种，每种亚种都有着不同的发酵特性和产物生成能力。
为了进一步了解黑曲霉的发酵机制和利用价值，科学家们开始对黑曲霉进行深入研究。
经过多年的努力，科学家们逐渐揭示了黑曲霉发酵的基本原理。
他们发现黑曲霉能够通过代谢产生一系列有机酸、氨基酸和香气物质，这些物质对食品的风味和营养价值具有重要作用。
通过对黑曲霉的改良和优化，科学家们成功地开发出了一系列高效的黑曲霉株，为食品行业带来了巨大的发展机遇。
如今，黑曲霉已成为食品工业中不可或缺的一部分。
除了传统的调味品之外，黑曲霉还被广泛应用于肉制品、食品添加剂、保健品等领域。
科学家们也在不断探索黑曲霉在生物制药和环境修复等方面的潜力。
总之，黑曲霉作为一种重要的霉菌资源，经历了从未知到被利用的发展历程。
科学家们通过不断的研究和改良，使得黑曲霉在食品工业中发挥了巨大的作用，为人们带来了更美味和健康的食品。
黑曲霉的使用范围
一、黑曲霉在发酵饲料方面的应用：《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。
1、黑曲霉能够提高发酵后饲料的营养水平和消化吸收率。
本品所含的微生物能分解饲料中的大分子糖类为单糖和寡糖,并生成多种有机酸、维生素、生物酶、未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化吸收率；2、使饲料脱毒。
通过微生物自身的生命活动，使饲料内所含的有毒有害物质被降解而脱除，从而大大提高了饲料的安全性；3、提高动物的抗病力。
本品所含的微生物直接参与动物肠道的屏障作用，补充动物肠道有益微生物的数量，通过生物竞争机制阻止病原微生物的定植和生长繁殖.恢复和维护动物肠道的微生态平衡，从而提高动物的免疫力和抗病能力；4、提高饲料的适口性，显著增加食欲。
在饲料中添加本产品可以提高饲料利用率、提高动物的生产性能，降低生产成本，改善养殖环境。
黑曲霉在发酵剂方面还能发酵能量饲料、蛋白饲料、粗饲料等所有种类饲料。
发酵的饲料既适用于猪、牛、羊等家畜动物，又适用于鸡、鸭、鹅等家禽动物，而且适用于鱼虾水产、黄粉虫昆虫等各种动物。
发酵饲料能使饲料解毒脱毒，大大提高饲料的安全性，而且在发酵的过程中会产生淡淡的香味，从而增加了动物的适口性；发酵过程中还能生成多种有机酸、维生素、生物酶、氨基酸及其他多种未知生长因子，大大提高了发酵饲料的营养水平和消化利用率；提高动物的抵抗力，降低饲料成本。
二、黑曲霉孢子粉使用说明：《2014年饲料添加剂目录》有关于黑曲霉可以直接添加使用的决定。
产品优势：1.孢子含量高，便于产品的存放2.产品有效菌对环境的适应性强3.孢子的发酵再生能力高产品用途：1.用于生物肥料秸秆腐熟剂等发酵时添加；2.用于复合微生物肥料接种剂；3.用于禽畜的粪便、有机垃圾发酵剂；4.用于动物饲料发酵时添加；产品配方：麦片、豆皮、微量元素、纯种米曲霉/黑曲霉菌株等。
使用量：万分之三到万分之五，即每吨加300克——500克（根据实际菌孢子量和生产工艺的要求添加）。
黑曲霉发酵泔水的条件优化及效果研究
中 图 分 类 号 ：ＴＱ ２ ． ９０９
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实验24-黑曲霉发酵生产柠檬酸
黑曲霉发酵生产柠檬酸柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。
商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。
另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。
柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。
1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。
1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。
我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。
能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。
至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。
目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。
本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。
柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。
将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。
精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。
5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。
微生物工程实验-黑曲霉发酵生产a-淀粉酶
黑曲霉发酵生产a-淀粉酶姓名：专业：09生物技术学号：09121007摘要：本实验按照5%的接种量向10L机械搅拌式发酵罐接种，并测量了发酵期间的PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化，每6h取样检测一次，发酵三天后放罐（大约66h），并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产a-淀粉酶各种物质和理化性质的变化。
关键词：黑曲霉发酵 a-淀粉酶生物量 pH 酶活残糖含量一、材料和方法：1.1材料菌种：黑曲霉PDA培养基：土豆200g（去皮）煮沸30min过滤，加糖20g，加水定容至1L.碘液：称取0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，褐色溶剂瓶内保存，避免阳光直射。
稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。
此溶液现配现用。
0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5g，加5ml缓冲液搅拌混合，再徐徐倾入70ml煮沸的缓冲液中，继续煮沸2min，冷切至室温，定容至100ml。
此溶液需要当天配制。
KH2PO4 30g;CaCl2 1.0g;七水硫酸亚铁 0.1g；七水硫酸镁 0.1g；水 14L（12L 蒸馏水加上后来在发酵罐中产生的冷凝水差不多是14L），pH调至5.00；消泡剂 4.0mL。
〃蒽酮试剂：溶解0.2g蒽酮于浓硫酸1L中，当天配制使用。
1.2方法1.21菌种制备先配制好PDA培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm 摇瓶，28°c培养。
1.22设备发酵罐主要部件：罐身、搅拌器、挡板、冷却装置、空气分布装置、轴承、夹套、进料口、补料口、取样口等水通道：分为冷却水和夹套水。
冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。
空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水分离进入玻璃转子流量计，经过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。
1.23空消打开蒸汽发生器开关，等其压力上升到0.2Mpa,然后打开发酵罐上与之连通的相应的一些阀门，使蒸汽进入其中，当温度上升到121℃压强在0.1-0.15Mpa之间，稍微打开蒸汽出气口使体系温度和压强维持稳定，灭菌20min左右，结束后关闭蒸气管路，打开管道。
黑曲霉产纤维素酶液体发酵
黑曲霉产纤维素酶液体发酵工艺优化和控制纤维素酶是生物降解含β-1,4 糖苷键的纤维素生成葡萄糖的一类复合酶的总称。
纤维素酶也是具有纤维素降解能力酶的总称，纤维素酶系包括3 种水解酶，即内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，只有各组分酶共同作用才能将纤维素彻底水解为葡萄糖[1-2]。
纤维素酶已经广泛应用于酿造果汁与蔬菜加工，粮食工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面[3-8]。
目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于丝状真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中曲霉是公认产纤维素酶最高的菌种之一[9]。
而黑曲霉是公认安全(GRAS)的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生长快、发酵周期短，具有明显的优越性，可望用于食品和医药等领域。
植物纤维是再生的生物资源，笔者是以植物纤维为碳源，对黑曲霉（A. niger）生产纤维素酶条件进行研究，为利用植物纤维素工业化生产纤维素酶提供技术参数。
故希望通过对黑曲霉A3 产纤维素酶的液体发酵产酶条件的优化，以获得酶的高产量，为纤维素酶的生产应用奠定基础。
1．材料与方法1.1 菌种黑曲霉A3(Aspergillus niger A3)：当地采取。
1.2 培养基及培养条件1.2.1 营养盐液Mandels 氏营养盐液[3]，再加入NaNO3 4.0 g/L。
1.2.2 斜面培养基(1)菌种保藏培养基(g/L)：麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，用营养盐液配制；(2)产孢子培养基：PDA 培养基。
1.2.3 发酵产酶基础培养基产纤维素酶基础培养基(g/L)[4]：玉米芯80，用改良Mandels 氏营养盐液配制，250 mL 三角瓶30 mL 装液量，起始pH5.5～6.0。
上述所有培养基均在1.0×105 Pa、121 ℃灭菌30 min。
1.2.4 斜面培养将接种后的斜面于28 ℃培养4～5 d。
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黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。
广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。
是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。
有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。
生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。
黑曲霉是发酵常用的菌种。
食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。
黑曲霉产生的孢子很多，很适合于用沙土管法进行保存。
沙土管保藏法。
取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2～4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的pH达到中性，烘干备用。
同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将
处理好的沙与土以（2～4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5～2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2～3小时）1～2次，进行无菌检验，合格后使用。
将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3～5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。
将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。
真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。
制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。
但是沙土管保存使用起来不是很方便，而且只是适用于长期的保存，容易导致大量的孢子特性下降，用之前需要进行分离纯化。
还有以下保藏方法可以应用：
1、斜面保藏方法，可以取部分孢子重新分离，然后传斜面待斜面张满孢子后在4度冰箱进行保存可以保存1－2个月没有问题，我们做过相关的试验。
而且可以随时使用，进行活化或者直接接种，非常方便。
2、深冷管保存，可以用无菌水配成20％甘油加入到斜面中刮下孢子进行保存。
或者用专用的GSH（甘油
和脱脂乳）保护液进行深冷管保存。
液很方便，大约可以保存1－2年没有问题。
使用起来液很方便。
不过一定要注意无菌操作，用专用的冷藏管。
生产上经常使用这种方法。
3、液氮保存，可以加入保护液放入液氮保存管中进行保存，保存时间很长大约可以保存5－10年
传统食醋的生产工艺流程
用米糠制醋的工艺流程为：米糠饼→粉碎→入缸→封缸→加色→淋醋→蒸煮→米醋
①粉碎、搅拌把米糠饼粉碎后磨细，过筛，制成糠饼粉。
每300kg糠饼粉加水200kg，充分拌和，使湿度一致。
②入缸将上述糠粉分成4份，每份加入200kg鲜酒糟（23～30℃），拌和均匀，装入缸中，盖上稻壳5kg 左右，以后的4d，每天重复换缸和加酒精及酒糟，再盖上稻壳。
5d以后，仍然翻缸。
③封缸翻缸结束后，用粘土封缸口，7d后，撬开泥土，再翻缸一次，翻后封缸，此后，隔15d和30d各翻一次，最后封缸。
④加色在淋醋前，每00kg原料加入4～5kg炒干的籼米粉，用适量的水拌匀，加入原料中。
⑤淋醋将4缸原料平分6次放入淋醋缸中，进行淋
醋，先塞住淋醋缸的放水孔，然后每缸淋水200kg，一段时间后打开孔放出醋液。
流完后再加入250～300kg水，继续淋醋，淋至基本无醋味为此。
⑥蒸煮向淋出的醋液中加入醋水量2.5％的食盐，然后把醋液倒进锅中蒸煮，煮到食盐溶解为止，即制成食醋。
在食醋生产中黑曲霉的作用是什么黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能,能分解原料中的淀粉等，生成葡萄糖，再生成酒精，最后酿造出醋来黑曲霉发酵在黑曲霉有氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。