人肝癌巴马小型猪异种移植模型的建立
裸鼠人肝癌原位移植耐药模型的建立的开题报告
裸鼠人肝癌原位移植耐药模型的建立的开题报告【开题报告题目】裸鼠人肝癌原位移植耐药模型的建立【研究背景】肝癌是常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类健康。
目前，肝癌可通过手术、化疗、放疗等综合治疗。
然而，由于肝癌细胞的异质性和基因突变等因素，导致治疗效果仍不尽如人意。
因此，开展肝癌治疗的研究非常必要，尤其是建立一种有效的肝癌耐药模型。
【研究目的】本研究旨在建立一种裸鼠人肝癌原位移植耐药模型，以此用于开展肝癌治疗药物的筛选和耐药机制的研究。
【研究内容】本研究主要包括以下内容：1.采用原位移植方法建立裸鼠肝癌模型，采用人肝癌细胞原位移植至裸鼠肝脏；2.通过连续药物选压，筛选出耐药肝癌细胞株；3.建立肝癌细胞原位移植耐药模型，并研究耐药机制；4.对耐药肝癌细胞株进行化学治疗药物筛选。
【研究方法】本研究采用原位移植法建立模型，连续药物选压筛选出耐药肝癌细胞株。
建立肝癌细胞原位移植耐药模型，并通过实时荧光定量PCR、Western blotting等手段进行耐药机制研究。
在耐药肝癌细胞株中，筛选可逆转耐药的化学治疗药物。
【研究意义】本研究将建立一种裸鼠肝癌原位移植耐药模型，以此作为研究肝癌治疗药物的筛选平台和耐药机制研究的手段。
通过研究耐药机制，并对耐药肝癌细胞株进行化学治疗药物筛选，有望为肝癌的治疗提供有力的参考和帮助。
【研究进展】目前，已通过原位移植法建立裸鼠人肝癌模型，连续药物选压成功筛选出耐药肝癌细胞株，正在进行建立耐药模型，并研究耐药机制的工作。
【研究预期成果】本研究预期能够建立一种裸鼠肝癌原位移植耐药模型，并研究耐药机制。
在此基础上，筛选出可逆转耐药的化学治疗药物，为肝癌的治疗提供新的思路和方法。
【研究周期和预算】本研究周期为2年，预算总共10万元。
包括实验室耗材费、动物实验费、仪器设备购置和维护费、研究人员工资和报酬等。
BALB／c小鼠原位移植肝癌模型的建立及鉴定
ｑ Ａｃ ｔ ａ Ａｃ ａ ｄ Ｍｅ ｄ Ｗｅ ｉ ｆ ａ ｎ ｇ Ｖ ｏ １ ． ３ ７ Ｎｏ ． １ ２ ０ １ ５
肝癌模 型是 目前肝 癌实 验研 究最理 想 的动物 模 型 。但 原位 移植 手术 操作 难度 大 ， 有 很 多技术 难题 需要 攻克 ， 因此 本课 题组 经 反复 实 验 和 改进 ， 建 立 了一 种 简 单有 效 的小 鼠原位 移植 肝 癌 模 型 ， 为 肝 癌 的研 究 提 供 了有
术后 １只小 鼠麻醉 未苏 醒死亡 ， 其 他均 于 当天苏 醒 ， 第
２天 活动正 常 。２周 后 ， 人 道 主义 处 死 小 鼠 ， 解 剖 取 出
肝脏 ， 肉眼可见 有乳 白色瘤 结节 形成 （ 图３ ） ， 除 １只未
见 明显 肿瘤 外 ， 其它 小 鼠均有肿 瘤 发生 ， 小 鼠存 活 率和
常肝 组 织标本 用 １ ０ ％ 中性 甲醛 固定 ２ ｄ后做 病 理 学 检 色， 光 学显微 镜下 观察 。
２ 实 验 结 果
１ ． １ 材料
Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｃ小 鼠 ， 雄性 ， ４～６周 龄 ， 体重 ２ ０ ｇ
左右 ， Ｓ Ｐ Ｆ级 ， 购 自山 东 大学 动 物 中心 ， 动 物 合格 证 号 为０ ０ １ ４ ６ ５ ４， 实验 和饲 养 条 件 严 格 按 照 Ｓ Ｐ Ｆ动 物 的规 范要 求 ； Ｈ ２ ２细 胞 ， 本 室 常规 保 存 ， 传 代 培 养 。Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养基 及 １ ６ ４ ０培 养 基 购 自 Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ Ｏ公 司 ， 胎 牛 血 清 购 自杭州 四季青 生 物制 品研 究 所 。 １ ０ ％水 合 氯 醛 、 注 射 器、 剪刀、 镊子 、 美翼牌 可 吸收 Ｐ Ｇ Ａ无 菌 缝合 线 及爱 惜 康 的慕 丝 非 吸 收性 缝 线 购 自潍 坊 市 人 民医 院。 １ ０ １ ￣ １
小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表现
小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表现
小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表现
肝癌是一种常见的恶性肿瘤，对于它的治疗一直是科研领域的热点。
而原位移植性肝癌模型是研究肝癌发展与治疗的常用模型之一，本文将阐述该模型的建立及其磁共振表现。
一、模型建立：
1. 选用小鼠作为实验对象，并注射人肝癌细胞或小鼠肝癌细胞至小鼠肝脏内；
2. 观察小鼠肝脏的变化及肿瘤的生长情况；
3. 通过剖尸解剖及病理学检查进行确诊。
二、磁共振表现：
1. 外形特征：在磁共振扫描图像中，肝癌呈现为圆形或椭圆形的异常信号病灶；
2. T1加权成像：肝癌呈低信号，且不均匀分布；
3. T2加权成像：肝癌呈高信号或略高信号，并且有较清晰的分界；
4. 坏死表现：部分肝癌在中心区域会出现坏死，造成信号呈现低值或空白。
综上所述，小鼠原位移植性肝癌模型是研究肝癌发展与治疗的常用模型之一。
在磁共振扫描中，肝癌具有特定的形态和信号特征，可提供诊断参考。
此模型的建立与研究对于深入了解肝癌的病理生理特征和寻找新的治疗方法具有重要意义。
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法
人肝癌裸鼠皮下-肝原位移植瘤模型的建立实验具体步骤及方法先用组织学完整的新鲜人肝癌组织接种于裸鼠皮下，形成皮下移植瘤，然后用此移植瘤组织再接种于裸鼠肝内，建立肝原位移植瘤模型（间接肝原位移植瘤模型），并将其与直接肝原位移植瘤模型、皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型作比较。
一、间接肝原位移植瘤模型的制备1. 用新鲜的肝癌外科手术切除标本（来自长海医院，患者为1名47岁男性，病理诊断：肝左叶肝细胞癌，粗梁型，Ⅱ级），在Hanks液中，去除坏死组织和非癌组织后切成1～2 mm3小块。
2. 取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠腰背部皮下，待皮下移植瘤长到直径约1 cm时切取肿瘤，在Hanks液中，去除坏死组织后切成1～2 mm3小块，裸鼠用戊巴比妥钠腹腔麻醉后，行左上腹横切口，暴露肝脏。
3. 取上述2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头植入裸鼠肝右叶深部实质内，全层关腹。
二、直接肝原位移植瘤模型的制备1. 同一例新鲜肝癌手术切除标本，处理方法同皮下移植，裸鼠处理同间接肝原位移植，取2块瘤组织，在离体40 min内用粗针头直接植入裸鼠肝右叶深部实质内。
2. 皮下移植瘤模型和腹腔内移植瘤模型的制备。
三、病理检查和相关指标检测1. 解剖和组织学检查（1）所有裸鼠接种后，分组分笼饲养，自由进食，每天观察1～2次。
（2）当裸鼠处于全身衰竭状态时处死并作大体解剖，对接种瘤和转移瘤分别进行观察、测量，记录肿瘤侵袭和转移情况，重要器官（主要为肝和肺）经10%中性甲醛固定后，常规石蜡制片，光学显微镜检查。
2. 周围血甲胎蛋白(AFP)检测处死前，均采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。
3. 瘤细胞DNA含量分析留取部分移植瘤标本采用流式细胞术进行DNA含量分析。
注意事项目前，肝癌的复发和转移仍然是其术后长期存活的主要障碍。
为了研究肿瘤的转移机制，建立接近于人体的肿瘤动物模型显得尤为重要。
广西巴马小型猪浅低温心脏不停跳体外循环模型的建立
［ 摘要 ］ 目的
探讨 广西 巴马小 型猪 浅低 温心脏不停跳体外循环 （ Ｃ Ｐ Ｂ） 模 型的建立 。方 法
选用 ３ ２～
４ ０ 健康的广西 巴马小 型猪 １ ３只 ， １ ０只用于实验 ， ３只用 于取血预 充。全麻下胸 正中切 口， 心包 外法建立 体 外循环 。阻断上 、 下腔静脉 ， 不 阻断 主动脉 ， 不灌注 心脏停跳液 ， 维持心 脏窦性节 律空跳 。Ｃ Ｐ Ｂ期 间保持心 率
ｓ ｏ ｔ Ｔ ｃ ｅ ｉ ｌ ｓ ［ Ｊ ］ ． Ｊ Ｅ ｘ ｐ Ｍ ｅ ｄ ， ２ ０ ０ １ ， １ ９ ３ （ Ｉ １ ） ： １ ７ ４ １ — １ ７ ４ ６ ．
１ Ｏ 黄 业华 ，任 １ １ 杨 伟 ，杨 沐．调 节性 Ｔ细胞 对 肾脏疾 病 的影 响 ［ Ｊ ］ ．中国临床保健杂 志 ， ２ ０ ０ ７， １ ０ （ ３ ）： ２ ３ ６—２ ３ ８ ． 军 ，李成荣 ， 黄 惠君 ，等．泼尼 松治疗 原发性 肾病 综合征
—
１ ３ ７ ０．
９ Ｓ ｈ ｅ ｖ ａ ｃ ｈ Ｅ Ｍ．Ｃ ｅ ｒ ｔ ｉ ｆ ｉ ｅ ｄ ｐ ｒ ｏ ｆ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｓ ：Ｃ Ｄ ４ （＋） Ｃ Ｄ ２ ５（＋）ｓ ｕ ｐ ｐ ｒ ｅ ｓ —
１ ３丁
楠， 郝
丽， 黎
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巴细胞 亚群 关系分析 ［ Ｊ ］ ．中 国煤炭工业 医学杂志 ， ２ ０ ０ ４ ， ７ （ ８ ） ：
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ｍｅ ｒ ｕ ｌ ｏ ｎ ｅ ｐ ｈ ｉ ｒ ｔ ｉ ｓ ｉ ｎ ｍｉ ｃ ｅ ［ Ｊ ］ ．Ｊ Ａｍ Ｓ ｏ ｃ Ｎ ｅ ｐ ｈ ｒ ｏ ｌ ， ２ ０ ０ ５ ， １ ６ （ ５ ） ： １ ３ ６ ０
使用供体腹主动脉进行肝动脉重建小型猪肝移植的护理配合
肝动脉重建是肝移植手术的重点和难点，其重建方式复杂多样，肝动脉重建成功与否对肝功能的恢复至关重要。
本院近期采用广西巴马小型猪成功建立了使用供体腹主动脉进行肝动脉重建的肝移植模型，对使用供体腹主动脉进行肝动脉重建的小型猪肝移植的手术技巧和可行性等进行了有益的探讨[1]。
现将实验中的护理配合报道如下。
1资料与方法1.1术前准备1.1.1实验动物的准备采用健康广西巴马小型猪（广西大学动物学院提供）10头，体质量12～15kg，随机分为供体组或受体组，每组5头，供、受体动物术前均禁食24h、禁水6h，术前1d对实验动物进行清洁，去除动物身上污垢及异味[2]。
1.1.2手术室准备术前1d，动物实验手术室用紫外线消毒空气[3]。
手术当天，调整手术室温度在22～24℃，湿度在40%～60%。
1.1.3实验物品准备术前1d准备好实验所需的液体、药品、器械和设备，尤其需要注意肝移植手术专用器械和物品的准备，如肝移植血管器械，变温水毯，血管缝线5-0、6-0Prolene线，胆管缝线6-0PDS，4℃UW液，4～8个无菌冰盐水袋等。
1.2术中观察监测和护理1.2.1外周静脉通道的开通配合麻醉医生行基础麻醉后将实验动物仰卧固定于铺有变温水毯的手术操作台上，维持变温水毯的温度在37℃，连接PHILIPS-V24E多功能监护仪监测心电图（ECG）。
选用猪的耳缘静脉作为外周静脉通道，穿刺置入20G静脉留置针，由于猪耳肥大而且较软，较难固定，可用缝针进行缝合固定。
静脉开通后遵医嘱静脉滴注和静脉用药。
1.2.2术中观察监测和护理术中观察监测实验动物的生命体征、血氧饱和度、中心静脉压、血流动力学、血气和电解质变化。
抽吸多巴胺、硝酸甘油、阿托品、肾上腺素、去氧肾上腺素、氯化钾和葡萄糖酸钙等药物备用，必要时遵医嘱适当输入新鲜全血、使用血管活性药物维持血流动力学稳定，滴入5%碳酸氢钠防治酸中毒，术中如血钾异常增高，静脉推注10%葡萄糖酸钙适量进行处理。
巴马小型猪胚胎-胎仔发育毒性试验基础数据的建立
题促使各国加强了对生殖毒性评价的重视［１］ 。 生 殖毒性试验是研究有害因素对亲代生殖功能和子 代生长发育造成的有害作用，是药物非临床安全 性评价的重要组成部分［２］ ，其对实验动物种属的 选择也越来越严格。 随着人们对小型猪研究的逐 渐深入，发现其性成熟时间为 ６ 个月，发情周期和 妊娠期短，胎仔数量多，胚胎大，便于观察微小畸 形［３］ ，与人类在解剖学、生理学、疾病发生机理等 方面存在一定的相似性［４ －５］ ，是潜在的生殖毒性 评价的良好动物模型。 因此，本研究对妊娠不同 时期的巴马小型猪进行解剖，观察孕猪的生殖功 能指标和胎仔的各项发育指标，为生殖毒性研究 提供正常值的参考依据。
１������ ３ 统计学方法 所有数据用 ＳＰＳＳ １７������ ０ 统计软件进行处理，检
验水准为 α ＝ ０������ ０５。 实验数据以平均数 ± 标准差（ ｘ������ ± ｓ）表示。
２ 结果
２������ １ 孕期 小 型 猪 生 殖 功 能 指 标 及 胎 仔 生 长 发 育 指标
【 Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｂａｍａ ｍｉｎｉｐｉｇ； ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ； ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｙ
随着时代的发展，各类外源化合物如农药、兽 药、化妆品、食品添加剂、环境污染物日益增多，长
期接触这些化学物质可导致人类生殖细胞损伤， 生育能力下降，胚胎死亡、畸形比例上升，这一问
肿瘤动物模型的构建——肝癌篇
肿瘤动物模型的构建——肝癌篇导语中国人口只占世界总人口的1/4，而肝癌患者却超过了全球的1/2，成为名副其实的“肝癌大国”。
2017年中国癌症年报的数据显示：肝癌发病率居恶性肿瘤的第3位，死亡率在中国大城市仅次于肺癌，高居第二[1]。
然而，目前肝癌的致病机理尚不清楚，因此，建立接近人类肝癌动物模型，对于研究肝癌的发生机制以及药物开发具有极其重要意义。
肝癌在近10年的发病率趋势[1]首先，我们先一起来了解一下肝癌一、肝癌的致癌因素肝癌（Liver cancer ）即指发生在肝脏的肿瘤，包括原发性和继发性2类，原发性肝癌是最常见肿瘤之一。
其中，肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma）占原发性的85.5%以上。
肝癌一般是由病毒、化学致癌物等诸多因素诱发，也与基因的调控和表达密切相关。
主要因素如下：1.乙型肝炎病毒（HBV）感染，肝癌的最主要原因，约50％的成人肝癌患者HBV阳性，几乎所有的儿童患者HBV为阳性。
据估算，我国乙肝病毒携带者约9000万人，其中约2800万人为慢性乙肝患者。
2.丙型肝炎病毒（HCV）感染3.酒精性肝病4.非酒精性脂肪性肝病5.基因突变引起的包括遗传性血色素沉着症，α1-抗胰蛋白酶缺乏症，自身免疫性肝炎等后期引发的肝癌。
二、肝癌的发展过程肝癌的发生，一般都会经历慢性或者急性肝损伤、肝脏自我修复、肝纤维化、肝硬化、最后发展为肝癌[2-3]。
“肝炎——肝硬化——肝癌”，被称为肝癌三部曲。
肝癌发生过程[3]动物模型是我们研究肝癌发生机制以及进行药物开发的必备工具，由于肝癌模型的特殊性（主要指肝癌的致病因素和发展过程），因此，常用的模型也不再仅局限异种移植模型，还包括各种诱导的肝癌模型。
下面就为大家介绍常见的肝癌动物模型：1. 诱发性肝癌模型（实验中常用方法之一）诱发性肝癌模型一般是指使用特定的化学诱导剂诱导肝癌发生的过程。
常用的诱导剂包括二乙基亚硝胺（DEN）, 黄曲霉素（AF），二甲基氨基偶氮苯（DAB）等。
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《实用器官移植电子杂志》２０１８年３月第６卷第２期Ｐｒａｅ ＪＯｒｇａｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＶｅｒｓｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ２０１８，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．２ ·９３· 人肝癌巴马小型猪异种移植模型的建立 吴嫣爽，胡兴琳，周晓囡，雷蕾（哈尔滨医科大学组织胚胎学教研室，黑龙江哈尔滨 １５００８１）
【摘要】目的建立人肝癌巴马小型猪异种移植模型，探索人肝癌细胞是否能在猪的肝脏中存活， 为建立人肿瘤细胞异种移植的大动物模型和临床肿瘤治疗、药物试验等研究奠定实验基础。方法将表达 ＧＦＰ的人肝癌细胞通过腹腔镜手术注入１５只肝部分切除的巴马小型猪的肝实质中。实验分为３组（ＧＯ组、 Ｇ１组和Ｇ２组）。ＧＯ组为对照组，巴马小型猪肝脏实行肝部分切除术后注射生理盐水；Ｇ１组巴马小型猪实 施肝部分切除术后注射人肝癌细胞；Ｇ２组巴马小型猪实施肝部分切除术后注射人肝癌细胞，术后１２小时 饲喂免疫抑制剂。定期采集各组实验动物的外周血，检测实验动物天冬氨酸转氨酶（ＡＳＴ）和丙氨酸转氨酶 （ＡＬＴ）的变化，检测血清中是否存在人类甲胎蛋白（ＡＦＰ）。对巴马小型猪的肝脏进行取材，苏木素一伊红（ＨＥ） 染色后镜下观察猪肝组织病理学特征。对实验组进行绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）免疫组织化学染色，检测组织 中是否有人肝癌细胞的嵌合。结果各组巴马小型猪的ＡＳＴ和ＡＬＴ指标在术后１４天恢复到术前水平。ＧＦＰ免 疫组织化学结果显示在Ｇ１组和Ｇ２组巴马小型猪的肝脏中均能检测到人肝癌细胞。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ） 检测结果显示在实验组的外周血中可以检测到人ＡＦＰ的表达，且Ｇ２组与Ｇ１组相比，差异具有统计学意义 ［ＡＦＰ（￣ｔｇ／Ｌ）：３９．５４－４－２０．３０比１３．７７ ４－７．５２，Ｐ＜０．０５ Ｊｏ ＨＥ染色结果显示Ｇ１组肝组织出现淋巴细胞浸 润和肝细胞坏死。结论通过猪肝原位移植人肝癌细胞的方法可以建立人肝癌巴马小型猪异种移植模型。 免疫抑制剂能促进移植的细胞存活。 【关键词】人肝细胞癌；异种细胞移植； 巴马小型猪；免疫抑制剂
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｂａｍａ ｍｉｎｉ ｐｉｇｓ Ｗｕ Ｙａｎｓｈｕａｎｇ，Ｈｕ Ｘｉｎｇｌｉｎ，Ｚｈｏｕ Ｘｉａｏｎａｎ，Ｌｅｉ Ｌｅｉ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５００８６，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ． Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｌｅｉ Ｌｅｉ，Ｅｍａｉｌ：ｌｅｉＯ８６＠ｅｍｓ．ｈｒｂｍｕ．ｅｄｕ．Ｃｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］０ｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｈｕｍａｎ ｃｅｉｌｓ ｃｏｕｌｄ ｓｕｒｖｉｖｅ ｉｎ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｄｒｕｇ ｔｒｉａｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＨｅｐＧ２一Ｐｕｒｏ—ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｂａｍａ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ’Ｓ ｌｉｖｅｒ ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ ｂｙ ｌａｐａｒｏｓｃｏｐｉｃ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ（ＧＯ，Ｇ１ ａｎｄ Ｇ２）．Ｂａｍａ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇｓ ｉｎ ＧＯ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｎｅ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ（ｓｈａｍ）．Ｐｉｇｓ ｉｎ Ｇ１ ｗｅｒｅ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ＨｅｐＧ２一Ｐｕｍ—ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｐｉｇｓ ｉｎ Ｇ２ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ＨｅＧ２一Ｐｕｒｏ—ＧＦＰ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ，ａｎｄ ｆｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．Ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｔｉｍｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＡＬＴ），ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ （ＡＳＴ）ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ－ｆｅｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）．Ｂａｍａ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｐｉｇ’Ｓ ｌｉｖｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｖｅｓｔｅｄ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｘｙｌ！ｎ－ ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ＨｅｐＧ２一Ｐｕｒｏ—ＧＦＰ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５－５３３２．２０１８．０２．００３ 基金项目：国家科技部９７３项目（２０１２ＣＢＡ０１３０３）；哈尔滨医科大学创新科学研究基金（２０１６ＪＣＺＸ３８） 通讯作者：雷蕾，Ｅｍａｉｌ：１
·论著· ·９４· 《实用器官移植电子杂志》２０１８年３月第６卷第２期Ｐｒａｃ ＪＯｒｇａｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ（ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＶｅｒｓｉｏｎ），Ｍａｒｃｈ ２０１８，Ｖｏ１．６，Ｎｏ．２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＡＩＪＴ ａｎｄ ＡＳＴ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｔｏｒｅｄ ｔｏ ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｌｅｖｅｌｓ ａｂｏｕｔ ２ ｗｅｅｋｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｒｇｅｒｙ．ＧＦＰ－ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｈｕｍａｎ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｔｈｅ Ｇ１ ａｎｄ Ｇ２ ｐｉｇ ｌｉｖｅｒｓ．Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）ｔｅｓｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＡＦＰ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｇｓ ｉｎ Ｇ１ ａｎｄ Ｇ２ ｇｒｏｕｐｓ．Ｇ２ ｇｒｏｕｐ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｇ１ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ［ＡＦＰ（ Ｌ）：３９．５４±２０．３０ Ｖ８．１３．７７ ４－７．５２，Ｐ＜０．０５］．ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｐａｒｔ ｏｆ ｐｉｇｓ ｈａｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｅｃｒｏｓｉｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｐｉｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃａｎ ｂｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｐａｒｔｉａｌ ｈｅｐａｔｅｃｔｏｍｙ．Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｌｏｎｇ ｃｅｌｌｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｂａｍａ ｍｉｎｉ ｐｉｇ； Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ．
肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＨＣＣ）是 临床常见原发性肿瘤，也是第三大癌症相关致死 性疾病 １－２］ｏ癌症动物模型在研究肿瘤病理生理学 特征和药物治疗中扮演了重要角色。近年来，一些 研究小组相继报道了动物ＨＣＣ模型＿３ Ｊ，这些研究 大多使用化学药物破坏肝细胞功能，诱导肿瘤的 发展Ｌ４ Ｊ￣这些模型虽然有效地获得了ＨＣＣ动物模 型，但是较长的建模时间以及较高的致死率限制了 这些模型的应用。此外，这些ＨＣＣ动物模型中肿 瘤细胞来源于动物自体细胞，与人类的肝癌细胞在 生物学特性上还有一些区别，因此，人肿瘤细胞异 种移植的动物模型可能更适用于临床应用性研究。 现有的人肿瘤细胞异种移植模型大多是啮齿类癌症 模型 Ｊ，巴马小型猪在解剖和生理上与人类相似， 更适合作为理想的动物模型用于人ＨＣＣ的研究 Ｊ。 Ｓｅｌｅｋ等…将人胶质瘤细胞移植到猪的顶叶，在给 予免疫抑制剂的情况下，建立了低分化脑胶质瘤猪 模型。Ｒａｉ等 将人肝癌细胞通过门静脉植入免 疫缺陷猪的肝脏内，虽然移植后一周在猪外周血中 检测到人甲胎蛋白（ａｌｐｈａ—ｆｅｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＦＰ）的表 达，但最终未检测到肝肿瘤细胞。本研究通过腹 腔镜原位移植人肝癌细胞，建立人ＨＣＣ的猪模型， 为ＨＣＣ临床药物试验和猪肝脏内细胞移植等研究 奠定了实验基础。 １材料和方法 １．１人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２一ＧＦＰ—Ｐｕｒｏ的培养：含 ｌ％青链霉素、１０％胎牛血清的高糖ＤＭＥＭ培养基， 培养于５％ＣＯ，、３７℃的培养箱中。 １．２ 巴马小型猪肝损伤模型的建立：选取健康， 月龄约为３个月，体重为１６～２５ ｋｇ的巴马小型 猪。术前１２小时禁止喂食和饮水。术前称重，经 耳缘静脉缓慢注射丙泊酚１０ ｍｇ每千克体重诱导麻 醉，用呼吸麻醉机吸人１．５％～２．Ｏ％的异氟烷维 持麻醉。将巴马小型猪固定在腹腔镜操作手术台 上，在腹腔镜引导下，对巴马小型猪的肝左叶切除， 切除完成后进行结扎，取出切除的部分肝脏。术 后微创缝合伤口给予碘酒消毒，同时注射素青霉素 ８Ｏ ｕ，链霉素４０ Ｕ，１次／天，共３天，７天后对 手术缝合的伤口进行拆线，每天检测体温和体重。 １．３腹腔镜下ＨｅｐＧ２一ＧＦＰ—Ｐｕｒｏ植入巴马小型猪 肝实质中：注射细胞前，将培养的ＨｅｐＧ２一ＧＦＰ— Ｐｕｒｏ细胞消化为单细胞悬液，用ＰＢＳ重悬后进行 计数。通过腹腔镜操作，将细胞沿距离肝脏的断面 ２ ｃｍ左右注射入巴马小型猪的肝实质中，注射共 约ｌ０个位点，每个位点约５ Ｘ １０７个细胞。 １．４实验分组：２．５～５．０月龄的１５只雄性巴马小 型猪（体重为１２．０～２５．２ ｋｇ）作为实验动物，随 机分组（表１ ｏ ＧＯ组实验动物肝切除术后在距离 断面约２ ｃｍ的位置注射０．２ ｍｌ生理盐水／位点， 共注射１０个位点，记为假手术组。ｃ１和Ｇ２组实 验动物总计移植５ Ｘ １０ 个细胞，Ｇ２组实验动物术 后饲喂免疫抑制剂［甲泼尼龙１ ｍｇ／（ｋｇ·ｄ）；他 克莫司胶囊１ ｍｇ／ｄ，１０天后，２ ｍｇ／ｄ；霉酚酸酯 Ｏ．２５ ｇ／ｄ，２周后０：５ ｇ／ｄ ｏ