实验十、细胞系的传代培养
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞系实验报告
实验名称：细胞系建立与鉴定实验时间：2023年X月X日实验地点：实验室一、实验目的1. 掌握细胞系的建立方法。
2. 了解细胞系的鉴定方法。
3. 观察细胞系在不同培养条件下的生长情况。
二、实验原理细胞系是指经过体外培养后，能够在一定条件下无限增殖的细胞群体。
细胞系的建立通常从原代细胞开始，通过多次传代培养，使其在体外条件下保持稳定生长。
细胞系的鉴定主要包括细胞形态、染色体数目、细胞周期、细胞表面标志物等方面。
三、实验材料1. 原代细胞：小鼠胚胎成纤维细胞。
2. 细胞培养液：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素。
3. 试剂：胰蛋白酶、DNA染色剂、细胞周期检测试剂、细胞表面标志物抗体。
4. 仪器：细胞培养箱、显微镜、离心机、移液器、酶标仪等。
四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取小鼠胚胎组织，剪成1mm³大小的组织块，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
（2）将细胞悬液接种于培养皿中，放入细胞培养箱中培养。
（3）每日观察细胞生长情况，待细胞融合至80%时，用胰蛋白酶消化传代。
2. 细胞系建立（1）将原代细胞传代培养，观察细胞生长情况。
（2）当细胞生长稳定后，收集细胞，进行细胞系鉴定。
3. 细胞系鉴定（1）细胞形态观察：在显微镜下观察细胞形态，记录细胞大小、形状、密度等特征。
（2）染色体数目检测：将细胞进行DNA染色，制作染色体涂片，观察染色体数目。
（3）细胞周期检测：将细胞进行细胞周期检测试剂染色，观察细胞周期分布。
（4）细胞表面标志物检测：将细胞进行细胞表面标志物抗体染色，观察细胞表面标志物表达情况。
五、实验结果1. 细胞形态：细胞呈长梭形，细胞核较大，细胞密度较高。
2. 染色体数目：细胞染色体数目为2n=40。
3. 细胞周期：细胞周期分布为G1期、S期、G2期、M期，比例约为1:1:1:1。
4. 细胞表面标志物：细胞表面表达CD29、CD44等标志物。
六、实验讨论1. 细胞系建立过程中，应注意无菌操作，避免污染。
动物细胞培养及传代
一些特殊的促细胞附着的物质可能参加细胞的贴附过程。 （存在于细胞膜表面或培养液尤其血清中的蛋白质）
贴附过程：带阳电荷的促贴附因子先吸附于介质上，悬
浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的介质附着，以后 细胞将伸展成其原来的形态．
运动的接触抑制及生长的密度抑制 接触抑制:
当两个正常的细胞移动而互相靠近时，其中之一或两 个将停止移动并向另一个方向离开，使细胞不会重叠。 当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时, 细胞不再移动,此即接触抑制。 正常细胞不互相重叠于其上面生长,但肿瘤细胞可重叠 生长。
5、还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸 利用。
DMEM培养基配方(1L)
DMEM粉末 碳酸氢钠 谷氨酰胺 丙酮酸钠 青霉素 链霉素 HEPES
13.48g 3.7g 0.584g 0.11g 105U/L 105U/L 5.96g
核移植 细胞融合 细胞培养
胚胎移植
动物细胞培养技术之成就与贡献
生物制品
细胞生理\ 药理\病理 研究
有毒物质
检测
• 病毒疫苗 • 干扰素 •单克隆抗 体
•筛选抗癌 药物
动物细胞培养
动物细胞培养
教学目标
理解动物细胞的特点； 掌握动物细胞培养的定义； 理解动物细胞的体外培养生长特性； 掌握动物细胞培养过程、条件及 了解动物细胞的特点掌握动物细胞培养 的定义 基本技术。
（7）促生长因子等物质
通常情况下,血清可以提供这些生长因子.
血清 常用的血清是小牛血清CS、胎牛血清FBS、 马血清HS和人血清HS。最常用的是小牛血清, 胎牛血清次之。 血清是极其复杂的混合物
细胞的换液与传代培养
传 代
成细胞悬液再传代。
培 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，
养 沉淀物加新培养液后再混匀传代。原代细胞
传代按1：2接种，细胞系传代按1：3-4接种。
动
2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）
物 细
此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不
胞
牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，
传
进行传代。
代
一、传代培养（passage）
❖无论是否稀释，将细胞从一个培养 瓶转移或移植到另一个培养瓶，也 称再培养（subculture）
二、单层培养细胞的一传代步骤:
倒出旧液 PBS洗涤 胰蛋白酶消化 倾出消化液 培养 稀释 计数 吹散细胞 加入培养液
三、原代培养物需要换液和传代 (subculture)的指标
细胞的换液与传代培养
细胞系cell line：原代培养物经首次传代后即成。 有限细胞系finite cell line: 不能继续传代或传代数有限。 连续细胞系continuous cell line：可连续传代的细胞系， 即已建成的细胞系。 细胞株cell strain：通过选择法和克隆形成法从原代培 养物或细胞系中获得的具有特殊性质和标志的培养物。
动 1.pH值下降（红变黄色）；
物 细
2.细胞浓度；
胞 3.细胞类型；
传
代 4.细胞形态学；细胞核四周充满颗
培
粒，细胞质呈空泡化，细胞变圆，
养
或出现细胞与底物脱离时。
四、细胞传代方法
动 1．悬浮生长细胞传代
物 直接传代法：静置数分钟，悬浮细胞沉淀在
细 瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然
胞 后加入等量的新鲜培养基用吸管直接吹打形
乳腺腺癌细胞系SK-BR-3的传代方法
乳腺腺癌细胞系SK-BR-3的传代方法
刚开始养SK-BR-3时，细胞状态不是很好，贴壁也不均匀，于是开始想办法，考虑
是不是吹打的不够，或是传得过多，或是其它的什么，后来发现的确如此，细胞的生长状态与传代的方法有很密切的联系。
我的传代方法是：
以50平方厘米培养瓶为例，待细胞长满瓶底70％－80％
1 、吸除或倒掉瓶内旧培养基。
2 、PBS 5ml加入培养瓶，轻轻晃动培养瓶，让PBS流遍细胞表面，倒掉。
3 、PBS 5ml加入培养瓶重复洗一次，倒掉。
4 、加入1ml胰蛋白酶消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然
后置37度5％的二氧化碳培养箱放置5分钟，在显微镜下观察，发现细胞脱壁、变圆即可。
5、加入含血清的培养基5ml中止消化，吸取瓶内培养液，反复轻轻吹打瓶壁细胞，确保所有的瓶底都要吹打到。
6、吸1/3至1/4的细胞悬液接种至新的培养瓶，然后加8ml的新的细胞培养基，置3 7度5％的二氧化碳培养箱完成传代。
实验二 ——细胞的传代培养
实验材料
猪肾细胞 (pk15细胞)；
10%FCS和双抗的1640培养液；消化液（0.25%胰蛋
白酶—0.02%EDTA溶液）；D-Hank’s液 细胞培养瓶； 巴氏吸管； 75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸
操作步骤
弃去细胞瓶中的原有培养液。 加入适量D-Hank’s液，轻轻摇动，洗去老化的细胞及 残留的培养液。重复两次。 加入适量消化液，轻轻摇晃至平铺细胞瓶底层，37℃ 静臵30sec-2 min，直至细胞层发白、卷边、有间隙， 即将脱落。 弃去消化液，加入2-3 mL营养液。 用吸管反复均匀吹打瓶壁，使细胞脱落，并形成单个 细胞状态。再加入20-30 ml的营养液。 吸出一半细胞悬液，加入新的细胞培养瓶中，拧好瓶 盖，放入培养箱中。37℃培养24-48 h后观察结果。
第二讲 细胞的传代培养
实验目的
1.掌握细胞传代培养的方法 2.建立严格的无菌操作观念
实验原理
传代培养是组织培养常规保种方法之一，也是
几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培
养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细 胞才能继续生长，这一过程就叫传代。传代培 养可获得大量细胞供实验所需。传代要在严格 的无菌条件下进行。
实验结果
1、观察细胞形态 2、注意是否污染
注意事项
操作前要洗手，进入超净台后手用75%的酒精 擦拭。试剂等瓶口也要擦拭。 所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。 吸过营养液的用具不能再灼烧，以免烧焦形成 碳膜。 不能用手接触已消毒器皿的工作部分。培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的 交叉污染。每次最好只进行一种细胞的操作。 每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分 开。 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标 准：健康细胞的形态饱满，折光性好，平铺细 胞瓶底层，生长致密时即可继续传代。
实验四 动物细胞的传代培养
实验四动物细胞的传代培养1.实验目的（1）了解动物细胞培养的基本知识。
（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。
（3）掌握动物细胞的传代培养法。
2.实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养: 把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中, 使之成活、生长和繁殖。
严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。
值得注意的是和植物组织培养不同, 目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能, 常最终转变成为细胞培养, 所以动物细胞与组织培养并无严格区别。
（2）原代培养: 直接从供体取来的细胞, 组织或器官进行的初次培养。
通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞, 达到一定密度时, 营养消耗殆尽, 需要补充营养, 分开扩大培养, 使之继续增殖。
注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同, 一代细胞约分裂3~5次, 不要混淆。
（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。
若其形态均一, 生长增殖稳定, 生物性状明确, 即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
不同种类的细胞成系的难易程度也不同, 一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及癌细胞较容易成系, 而神经等细胞则较难成系。
按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等, 大多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境, 因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。
（1）营养: 早期培养主要采用天然的生物性液体, 但其成分不确定, 难以控制营养成分。
现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基, 其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。
培养基中还含有酚红指示剂, 使培养基的颜色可显示细胞生长状态。
HBMEC细胞系培养方法
HBMEC细胞系培养方法HBMEC细胞系是一种人脑微血管内皮细胞系，广泛应用于神经病学和肿瘤学研究中。
本文将介绍HBMEC细胞系的培养方法，包括细胞的来源、培养基的配制、细胞的传代和冻存等内容。
一、细胞来源HBMEC细胞系最初是由美国纽约大学的团队从人脑微血管内皮细胞中分离出来的。
现在，已经有多个实验室从不同的来源成功地分离出HBMEC细胞系。
这些来源包括人脑组织、人脐带、人脑毛细血管和人脑动脉。
二、培养基的配制HBMEC细胞系的培养基需要包含多种营养物质，以维持细胞的正常生长和功能。
下面是一种常用的HBMEC培养基的配方：DMEM/F12培养基（1：1） 500ml胎牛血清 10%L-谷氨酸 2mM乳酸钠 10mMHEPES缓冲液 10mM非必须氨基酸混合物 1X青霉素/链霉素 100 U/ml以上配方中，DMEM/F12培养基是基础培养基，胎牛血清提供细胞所需的生长因子和营养物质，L-谷氨酸和乳酸钠调节细胞内酸碱平衡，HEPES缓冲液维持培养基的pH值，非必须氨基酸混合物补充细胞所需的氨基酸，青霉素/链霉素预防细胞感染。
三、细胞的传代HBMEC细胞系的传代需要注意以下几点：1. 细胞密度：在细胞密度达到80%至90%时进行传代。
2. 细胞分离：使用0.25%胰酶/EDTA溶液将细胞从培养瓶中分离出来。
分离后，加入等体积的培养基，使细胞悬浮在培养基中。
3. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数。
将细胞按照需要的密度重新接种到新的培养瓶中。
4. 培养条件：细胞的培养条件需要保持稳定，包括温度、湿度、CO2浓度等。
四、细胞的冻存HBMEC细胞系的冻存需要注意以下几点：1. 细胞密度：在细胞密度达到80%至90%时进行冻存。
2. 冻存液：使用含有10% DMSO和90% FBS的培养基作为冻存液。
3. 冻存管：使用专门的冻存管，将细胞悬浮在冻存液中，每管放入1-2×10^6个细胞。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。
它具有重要的科研和临床应用价值。
本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。
MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。
优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。
4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。
常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。
结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。
细胞迁移实验详细步骤及说明
细胞迁移实验详细步骤及说明实验目的：本实验旨在通过细胞迁移实验，研究细胞在不同条件下的迁移能力，以深入了解细胞迁移机制。
实验步骤：1. 细胞培养准备：- 选择细胞系：根据研究目的选择合适的细胞系，如癌细胞系、原代细胞系等。
- 细胞培养基准备：根据细胞系要求制备培养基，添加所需的营养物质和补充物。
- 细胞培养器皿准备：选择合适的培养器皿，如细胞培养板、细胞培养皿等。
- 细胞传代：将细胞传代至合适的细胞密度，保证细胞处于快速生长期。
2. 细胞迁移实验装置准备：- 细胞培养皿：选择具有适当孔径的Transwell孔板或细胞迁移室。
- 上下室培养基准备：在上下室中加入适量的培养基，并保持温度和湿度稳定。
3. 细胞迁移实验操作：- 细胞装载：将预处理好的细胞悬浮液加入上室，根据实验要求调整细胞密度。
- 上下室组装：将上室与下室连接，确保上下室之间的通道畅通。
- 孵育条件设置：放置细胞迁移装置于恒温培养箱内，设置适当的温度和CO2浓度。
- 孵育时间：根据实验目的设定合适的孵育时间，一般为24至48小时。
- 停止迁移：取出细胞迁移装置，将上室内的细胞去除，轻轻用PBS或生理盐水清洗下室。
- 下室细胞固定：用适当的固定液对下室细胞进行固定处理，一般使用甲醛或冰乙酸。
- 细胞染色：使用合适的细胞染色剂，如克里斯汀染料，对下室内的细胞进行染色。
- 细胞观察与计数：使用显微镜观察染色后的下室细胞，并进行细胞计数。
4. 数据分析与结果解读：- 统计分析：根据实验设计和目的，选择合适的统计方法进行数据分析，如t检验、方差分析等。
- 结果展示：以图表形式展示实验结果，如柱状图、折线图等。
- 结果解读：根据实验结果和现有知识，解读细胞迁移能力的差异，讨论实验结果与研究目的之间的关系。
实验注意事项：- 细胞培养条件：细胞在培养过程中要保持正常生长状态，培养基和培养条件应符合细胞要求。
- 细胞悬浮液处理：在加入上室前，细胞悬浮液需要进行预处理，如离心去除培养基，保证细胞悬浮液的纯度。