动态动力学拆分高效制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸

第35卷第1期 化学反应工程与工艺 Vol 35, No 1 2019年2月 Chemical Reaction Engineering and Technology Feb. 2019

收稿日期：2018-12-21；修订日期：2019-01-18。 作者简介：汤灵娇（1994—），女，硕士研究生；吴坚平（1973—），男，教授，通讯联系人。E-mail: wjp@zju.edu.cn。

文章编号：1001—7631 ( 2019 ) 01—0055—09 DOI: 10.11730/j.issn.1001-7631.2019.01.0055.09 动态动力学拆分高效制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸 汤灵娇1，詹 晓1，杨立荣1，钱明心2，吴坚平1 1.浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310000; 2.苏州同力生物医药有限公司，江苏 张家港 215600

摘要：利用固定化的南极假丝酵母脂肪酶B（CAL-B）实现外消旋底物1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯[(±)-1]的动态动力学拆分高效制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸[(R)-1-TIC]。考察了不同来源CAL-B制剂的催化效果，以及关键反应条件对底物稳定性和酶催化速率的双重影响。结果表明：商品化脂肪酶制剂QLlip-9提供了最佳的催化效果；反应温度提高至30 ℃、醋酸铵缓冲液的初始pH值提高至8.0时，虽然底物稳定性略微下降，但完全转化所需时间大幅缩短，整体催化效率明显提高；pH值恒定控制策略则加快了反应后期无效底物的消旋化速率，从而进一步提高催化效率。当(±)-1浓度为20 g/L时，QLlip-9浓度降至10 g/L基本不影响催化效果，最佳酶/底物比率（酶与底物的质量比）达到1:2。在上述优化条件下，反应时间缩短至6 h，转化率不低于99%，产物的对映体过量值（enantiomeric excess of product, e.e.p）为96%，生产速率达到0.24 g/(h·g酶)，

为目前文献报道最高水平的8倍。在此基础上，实现了8批次的重复利用，并在300 mL，1 000 mL和20 L体系中实现了逐级规模放大，最终通过浓缩结晶法提取获得e.e.p≥99%的(R)-1-TIC晶体（分离收率不低于80%）。以上研究不仅大幅提高了该反应的整体催化效率，并且降低了酶的使用量。

关键词：(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸 南极假丝酵母脂肪酶B 动态动力学拆分 催化效率 中图分类号：Q814.9 文献标识码：A

四氢异喹啉（THIQ）骨架是曲贝替定[1]、那可丁[2]、喹那普利[3]和吡喹酮[4]等多种药物的重要结构模块。新型THIQ治疗剂由于具备特定抗癌活性[5-7]、抗炎作用[8]和免疫活性[9]，受到越来越多的关注。例如，1-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉[10]是合成帕金森病新型治疗剂的重要中间体。作为一类非天然双环氨基酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸（1-TIC）可用于开发生物活性肽，例如用于先天免疫保护的抗菌肽（AMPs）[11]。另外，1-TIC可替代结构类似的苯丙氨酸，合成法尼基转移酶抑制剂，用于开

发癌症治疗的新手段[12]。 迄今为止，利用化学合成法只能得到消旋化的1-TIC及其衍生物[13-14]，而不能获得其单一手性构型(R)-1-TIC。目前，只能通过生物酶催化方法高效合成(R)-1-TIC，在南极假丝酵母脂肪酶B（CAL-B）的作用下，1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯[(±)-1]水解为(R)-1-TIC的过程经历了从有机相到水相、从动力学拆分（KR）到动态动力学拆分（DKR）的演变。PAÁL等[15]在二异丙基醚有机相中实现了(±)-1

的动力学拆分，反应92 h后以46%的分离收率获得(R)-1-TIC[产物的对映体过量值（e.e.p）为94%]。由于KR转化率最高只有50%，该团队在甲苯/乙腈（4:1）中实现了(±)-1的动态动力学拆分，反应144 h后以80%的分离收率获得(R)-1-TIC（e.e.p为96%）[15]。随后PAÁL等[16]又提出用环境友好的水相代

替有机相，建立了迄今为止效率最高的催化体系：(±)-1在3 ℃下反应24 h后以85%的分离收率获得(R)-1-TIC（e.e.p为98%），与之前相比，时空产率提高12倍。近年来有文献报道了类似底物酯通过56 化学反应工程与工艺 2019年2月 该生物催化方法制备相应产物酸的过程。FORRÓ等[17]利用CAL-B分别在二异丙基醚/乙腈（3:2）的有机溶液和醋酸铵水相体系（pH值为8.5）中实现了(±)-6-羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯和(±)-6-甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯的动态动力学拆分（25 ℃），反应48 h和3 h后分别以87%和91%的收率获得对应(R)构型的产物酸（e.e.p>99%）。

本研究目的是建立动态动力学拆分外消旋酯(±)-1从而制备(R)-1-TIC[(R)-2]的高效酶催化体系，反应式见式（1）。由于PAÁL等的研究结果[16]尚存在许多不足，例如反应时间过长，转化率和时空产率

较低；酶/底物比率过高，酶用量较大等。针对这些问题，本研究对该反应进程进行了系统研究，旨在提高其催化效率和时空产率，同时降低酶的使用量。首先，评估不同来源的固定化CAL-B制剂以筛选得到优势催化剂。其次，研究反应条件对于酶催化反应和底物稳定性的影响，通过条件优化，在有效控制化学水解的同时，提高整体催化效率。然后，通过酶/底物比率和重复利用研究，保证催化效果的同时降低了酶的使用量。最后，对该反应进行规模放大和分离纯化研究。

（1）1 实验方法 1.1 酶和试剂 固定化CAL-B制剂：Novozyme 435，QLlip-9，由苏州同力生物医药有限公司提供；Immo 8285，Immo plus，D5544，购于漂莱特有限公司；SZ-PLE-100(CAL-B)-IMMO，购于尚科生物医药（上海）有限公司。 醋酸铵、盐酸、氨水为分析纯级别，均购于沪试；甲醇、乙腈为色谱纯级别，均购于Sigma-Aldrich；甲酸为色谱纯级别，购于Aladdin；二乙胺为色谱纯级别，购于Urchem。 外消旋1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯，由苏州同力生物医药有限公司提供。 1.2 酶催化反应 1.2.1 反应器及相关参数控制 30，300和1 000 mL的反应体系采用的反应器分别是规格为50，500和2 000 mL的三口圆底烧瓶，外置搅拌装置、恒温水浴与pH恒定控制装置：可恒定控制温度、pH值于某一特定值，搅拌转速200 r/min；20 L反应体系采用的反应器是规格为20 L的大型玻璃搅拌罐（含夹套，配置搅拌系统、温度电极和pH电极），外置循环水装置和pH恒定控制装置：可恒定控制温度、pH值于某一特定值，搅拌转速150 r/min。 1.2.2 催化过程及样品处理 称取一定质量(±)-1于醋酸铵缓冲液（pH值为8.0）中搅拌均匀，用氨水调节反应液的初始pH值，配制成底物母液。投入一定质量的酶，在特定温度下进行反应。反应结束，取一定量1 mol/L盐酸调节反应液为强酸性，以终止反应。反应液全部转移至容量瓶，用流动相定容、稀释一定倍数，再经微第35卷第1期 汤灵娇等. 动态动力学拆分高效制备(R)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸 57 孔有机滤膜过滤，最后使用高效液相色谱仪进行分析检测。 1.2.3 pH值的恒定控制 通过pH检测装置与pH调节装置的联动作用实现pH值的恒定控制，其中，调节装置为管路一端连接氨水溶液，另一端通向反应液的精密蠕动泵。首先，在pH检测装置上设定合理的pH值下限（如8.0），并通过探头检测溶液的实际pH值。随着反应进行，当实际pH值低于8.0时，蠕动泵启动，自动向反应液中缓慢滴加氨水，溶液pH值提高；当检测发现pH值提高至8.0时，蠕动泵停止工作。通过上述操作实现pH值的自动恒定控制。 1.3 固定化酶的回收利用 反应结束，通过抽滤将固定化CAL-B颗粒与反应液分开，将分离得到的固定化CAL-B投入新鲜底物溶液，相同条件下进行新批次的反应。 1.4 产物的分离纯化 反应结束，通过抽滤将固定化CAL-B颗粒与反应液分开，反应液于60 ℃下旋蒸浓缩，过程中析出的晶体置于50 ℃烘干，最终得到干燥的(R)-2晶体。 1.5 分析与计算 采用高效液相色谱仪Fuli FL2200对底物和产物进行检测分析。采用的手性分析柱为CHIRALPAK ZWIX(-)（0.40 cm×15 cm×3 μm，购于大赛璐药物手性技术有限公司）。HPLC检测条件为：流动相甲醇:乙腈为6:4（含50 mmol/L甲酸和25 mmol/L二乙胺），流速0.4 mL/min；紫外吸收检测器，检测波长220 nm；柱温30 ℃。 （1）转化率（X）和e.e.p的计算：通过液相检测结果得到（反应前后各物质的峰面积通过标准曲线计算得到对应的浓度，再结合相应溶液体积得到对应物质的量）。

t01100%SX=

S-´

æöç÷ç÷ç÷ç÷èø

（2）

e.e.p=100%RSRSPPPP-´+

（3）

式中：St和S0分别为反应结束时残余底物量和反应开始时的底物量，g；PR和PS分别为R酸和S酸产物量，g。 （2）分离收率（Y）的计算：通过质量称重得到。

t,t

100%mY=

m´ （4）

其中：mt’= ms/241.5×177；mt和mt’分别为产物质量和理论产物质量，g；ms为底物质量，g；241.5为底物分子量；177为产物分子量。 （3）生产速率的计算：与底物/酶比率、反应时间等密切相关，用来衡量单位时间内利用单位质量的酶可获得的产物量。

式中：rproductivity为生产速率，g/(h·g酶)；Cp为产物浓度，g/L；t为反应时间，h；C酶为酶浓度，g酶/L。 Pproductivity

Cr

tC酶´

= （5）