细胞冻存的方法
sf9细胞冻存方法
sf9细胞冻存方法
SF9细胞是一种昆虫表达系统中常用的细胞系。
下面是一种常
见的SF9细胞冻存方法：
1. 在培养皿中培养SF9细胞至高密度（通常为培养皿80-90%
的细胞覆盖度）。
2. 用DPBS（无钙无镁的磷酸盐缓冲液）洗涤细胞一次，以去
除培养基和细胞碎片。
3. 使用酶解液（例如Trypsin-EDTA）将细胞从培养皿中解离。
根据细胞的密度，可以使用适当的溶菌酶/胰酶酶解细胞。
4. 加入同等体积的冻存培养基（通常为细胞培养基中含有20-50%的人血清、10%的二甲基亚砜（DMSO）和1-2%的低浓度抗生素的培养基）。
5. 轻轻混合并将混合液转移到冻存管中。
6. 使用-80℃冰箱或液氮罐冷却细胞冻存过程。
最好将细胞冻
存在气相中且不接触液氮。
7. 冻存细胞超过12小时后，将冻存管从液氮中转移到-150℃
以上的长期液氮储存罐中。
使用这种冻存方法，SF9细胞可以在-70℃至-80℃下保存6个
月至1年以上。
为了确保细胞质量，建议每6个月检查一次细胞的生长和表达能力。
请注意，在冻存细胞前，确保培养细
胞没有被细菌、真菌等污染，以避免污染的细胞冻存在长期储存中。
无血清无dmso细胞冻存液操作方法
无血清无dmso细胞冻存液操作方法无血清无DMSO细胞冻存液操作方法细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，可以用于长期保存细胞，并保持其生物学特性和功能。
传统的细胞冻存方法通常使用含有10%血清和10% DMSO（二甲基亚砜）的细胞冻存液。
然而，血清和DMSO可能对细胞产生不良影响，因此，无血清无DMSO的细胞冻存液逐渐得到广泛应用。
本文将介绍无血清无DMSO细胞冻存液的制备和操作方法。
1. 准备培养基准备适合细胞生长的培养基。
无血清的培养基可以是无血清的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或RPMI （Roswell Park Memorial Institute）培养基等。
根据细胞类型的不同，可以添加不同的补充物，如胰岛素、转铁蛋白、胺基酸等。
2. 收集细胞将细胞培养至对数生长期，使用无血清的PBS（磷酸盐缓冲盐水）或EDTA（乙二胺四乙酸）溶液洗涤细胞，以去除培养基。
3. 细胞计数和离心使用细胞计数仪计数细胞数目，并根据需要的冻存细胞数目进行计算。
然后，将细胞用离心管收集起来。
4. 制备冻存液将无血清的培养基加入到细胞中，使细胞浓度达到所需的浓度。
通常，细胞浓度应在1-2×10^6细胞/mL之间。
将细胞悬液分装到冻存管中。
5. 冻存将冻存管放入-80℃的冰箱中进行快速冷冻。
冷冻速率是细胞存活的关键因素，通常使用-1℃/分钟的速率进行冷冻。
6. 转移到液氮罐中将冻存管从-80℃的冰箱中取出，迅速将其置于液氮罐中进行长期保存。
液氮罐的温度应保持在-196℃。
7. 解冻需要使用冻存细胞时，将冻存管迅速从液氮罐中取出，放在37℃的水浴中解冻。
解冻时间通常为1-2分钟。
8. 培养细胞将解冻后的细胞转移到预先准备好的培养基中，并放入培养箱中继续培养。
注意，解冻后的细胞可能需要适应培养条件，并可能在恢复生长之前经历一段时间的停滞。
无血清无DMSO的细胞冻存液操作方法相比传统方法更加安全和方便。
细胞冻存的方法与步骤
细胞冻存、解冻方法与细胞计数之马矢奏春创作江苏大学从属病院风湿科李晶〖前去主页〗一、细胞冷冻保管1.材料：成长优胜之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保管管(Nalgene5000-0020)、0.4％（w/v）trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保管方法：（1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存.-20℃不成超出1小时,以避免胞内冰晶过大,造成细胞大量去世亡,亦可跳过此步调直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些.（2）程序降温：运用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存.适用于悬浮型细胞与hybridoma之保管.3、步调：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数成长期.（2）配制冷冻保管溶液(运用前配制)：另取一离心管,参加培养基、血清,逐滴参加二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用.（3）离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率.（4）取与细胞悬液等量的冻存液,迟缓逐滴参加细胞悬液,并晃荡试管,制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％）,使细胞浓度为1～5×106cells/ml,混淆平均,分装于已标示完整之冷冻保管管中,1～2ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测.严密封口后,注明细胞名称、代数、日期.然落伍行冻存.4、留心事项：（1）欲冷冻保管之细胞应在成长优胜(logphase)且存活率高之状态,约为80～90％致密度.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保管前一至二日测试是否有抗体之产生.（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力；在-70度可保管数月.（3）留心冷冻呵护剂之品格.DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接采办无菌产品,如Sigma D-2650),以5～10ml小体积分装,4℃避光保管,勿作多次解冻.Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保管.在开启后一年内运用,因长期储存后对细胞会有毒性.本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接参加时释放的热量对细胞的损伤.迟缓逐滴参加细胞悬液是使细胞慢慢适应高渗,可降低细胞受损.DMSO 可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存.（4）冷冻保管之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后去世去.③adherent tumor lines:5～7×106,依细胞种类而异.Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ml.（5）冷冻呵护剂浓度为5或10％DMSO,若是不确定细胞之冷冻前提,在做冷冻保管之同时,亦应作一个backup culture,以避免冷冻失落败.（6）冻存可用10%～90%的血清,一般高浓度血清有助于破坏细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时）,清醒存活率在80%～90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存加倍有效.二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶从新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之去世亡.2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞成长或特点表示才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质).3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步调：（1）操纵人员应戴防护面罩及手套,避免冷冻管可能爆裂之伤害.（2）自液氮或干冰容器中掏出冷冻管,检查盖子是否旋紧,因为热胀冷缩过程,此时盖子易松失落落.（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操纵台内.（4）掏出冷冻管,连忙放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保管管外部,移入无菌操纵台内.（5）掏出解冻之细胞悬浮液,渐渐参加有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15),混淆平均,放入CO2培养箱培养.取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试.（6）解冻后是否连忙去除冷冻呵护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要连忙去除冷冻呵护剂.惟若要连忙去除,则将解冻之细胞悬浮液参加含有5-10ml培养基之离心管内,离心1000rpm,5分钟,移去上清液,参加新鲜培养基,混淆平均,放入CO2培养箱培养.（7）若不需连忙去除冷冻保管剂,则在解冻培养后隔日更换培养基.三、细胞计数与存活测试1、道理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数.（2）血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1mm2大正方形,个中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0.1mm.当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml.运用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每ml中之细胞数目.（3）存活测试之步调为dyeexclusion,运用染料会渗入去世细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色.一般运用蓝色之trypan blue染料,假如细胞不随意马虎吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish.计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+去世细胞数）×100%.计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数加倍准确.2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics).白细胞稀释液（4%乙酸溶液）.3、步调：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混淆平均于1.5ml小离心管中.（2）取少许混淆液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽参加,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下不雅察,活细胞不染色,去世细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish).（3）计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混淆),最后乘以104,即为每ml中细胞悬浮液之细胞数.若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞).注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时,最适浓度为5～10×105细胞/ml,此范围外计数误差偏大.高浓度细胞悬液,可掏出部分作稀释或中断稀释后计数.5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液,取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混淆平均于试管中,取少许混淆液参加血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目.活细胞数/方格：55,62,49,59；去世细胞数/方格：5,3,4,6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
1
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
2
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
3
细胞冻存的原理与要求
细胞冻存的原理与要求
一、细胞冻存的原理
细胞冻存是指将细胞悬浮液冷冻，并在低温状态下保存，以保持细胞的活力。
它能够大大延长细胞的存活期，使细胞可以在不同的环境中进行运输，并且可以长期存放，方便进行研究与分析。
细胞冻存可以被用在多种科学研究，比如：细胞培养、细胞分析、细胞转染、细胞移植等。
细胞冻存主要原理是冷冻保护，目的是通过对细胞结构、膜损伤和机械损伤的影响减少到最小，以最大程度地保持细胞存活、活跃状态。
具体来说，细胞冻存的主要原理有两点：
（1）细胞内的渗透性盐分降低：细胞冻存前，应在细胞悬液中加入合适的抗冻剂，如葡萄糖、乳酸、多聚乙二醇等，以降低细胞内部的渗透性盐分，减少细胞膜破裂。
（2）细胞外的渗透性盐分降低：细胞冻存前，应在细胞悬液中加入合适的低温保护基质，如含有大量的糖醇、血清等，以降低细胞外部的渗透性盐分，减少细胞膜的损伤。
因此，在细胞冻存前，应当正确选择抗冻剂和低温保护基质，以使细胞结构、膜结构损伤和机械损伤减少到最小，从而达到最大程度地保护细胞的存活与活跃。
二、细胞冻存要求。
细胞冻存液使用方法
细胞冻存液使用方法介绍如下：
1.准备工作：
o确保工作区域和操作器具的清洁与无菌。
o准备细胞冻存液，根据制备的配方和方法准备好冻存液。
2.细胞冷冻：
o从培养皿中取出细胞，并尽快将培养基抽去。
o加入适量的细胞冻存液，轻轻悬浮细胞，确保均匀混合。
o将细胞冻存液转移至冻存管中，注意不要产生气泡。
o封闭冻存管，确保密封。
3.冻存过程：
o将冻存管放置在冷冻盒中，并迅速将其放入冰箱冷冻室。
o使用冷冻梯度降温的方法，逐渐降低细胞的温度至-80°C 以下。
4.长期储存：
o将冻存管转移到液氮罐等更低温度的冷冻设备中进行长期储存。
o长期储存时，细胞应该避免暴露在温度变化和湿气中。
5.解冻和复苏：
o从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37°C预热的水浴中进行解冻。
o解冻后，立即将细胞冻存液转移到预先准备好的培养基中。
o轻轻悬浮细胞，将细胞转移到新的培养皿中进行培养。
细胞冻存液使用方法(一)
细胞冻存液使用方法(一)细胞冻存液使用方法1. 什么是细胞冻存液？细胞冻存液是一种特殊的液体，用于保存细胞样本以便日后使用。
通过将细胞冻存在-196摄氏度的液氮中，可以有效地延长细胞的保存时间，并确保细胞活性和生物功能的保持。
2. 细胞冻存液的制备方法2.1 传统细胞冻存液制备方法•准备培养基：选择适合细胞类型的培养基，并添加适当的培养物质。
•收集细胞：利用细胞培养技术收集需要冻存的细胞。
•细胞处理：将细胞经过漂洗、脱离、计数等步骤处理干净。
•添加保护剂：加入适当浓度的冻存保护剂，如甘露醇、DMSO等，以保护细胞在冷冻过程中的完整性。
•制备冻存液：将处理好的细胞和保护剂混合均匀，分装到冻存管中。
•冷冻保存：将装有细胞冻存液的冻存管置于液氮中进行冷冻保存。
2.2 现代细胞冻存液制备方法•使用冷冻保存仪器：现代细胞冻存液制备方法通常使用专门的冷冻保存仪器。
这些仪器通常具有精确的温度控制功能，可确保细胞冷冻过程的标准化和自动化。
•自动化的细胞处理：现代冷冻保存仪器通常包括自动化的细胞处理系统，可以自动完成细胞的漂洗、脱离以及添加保护剂等步骤，减少了操作人员的工作量并提高了冻存效果。
•快速冷冻技术：现代细胞冻存液制备方法中，常采用快速冷冻技术，可以在极短的时间内将细胞迅速冷冻至-196摄氏度，从而避免了由于冷冻过程中形成的冰晶对细胞的损伤。
3. 细胞冻存液使用方法3.1 细胞解冻•准备培养基：在细胞冻存液解冻前，需要准备适合细胞培养的培养基。
•解冻细胞：将细胞冻存液取出，放入37摄氏度的水浴中进行解冻。
•细胞离心：解冻后，将细胞冻存液瓶转移到离心管中，进行快速离心以去除保护剂。
•加入培养基：将离心后的细胞沉淀重新悬浮在适当的培养基中。
•细胞培养：将处理好的细胞进行培养，提供适当的温度、湿度和营养物质。
3.2 细胞活性检测•细胞形态观察：通过显微镜观察细胞的形态变化，检查细胞是否具有正常的形态结构。
•细胞增殖能力：通过细胞计数和增殖实验等方法，评估细胞的增殖能力。
细胞冻存液储存条件
细胞冻存液储存条件
细胞冻存是一种常见的细胞保存方法，通过将细胞冻结并存储在液氮中，可以长期保存细胞，并在需要时进行解冻和使用。
然而，正确的细胞冻存液储存条件对于细胞的存活和质量至关重要。
以下是一些常用的细胞冻存液储存条件：
1. 冻存液配制
冻存液的配制是细胞冻存过程中的关键步骤。
常用的冻存液包括DMSO（二甲基亚砜）和甘油等。
在配制冻存液时，需要注意浓度和pH值的调整，以及容器的消毒和无菌操作。
2. 冻存过程
在细胞冻存过程中，需要注意温度的控制和速度的调整。
一般来说，将细胞缓慢降温至-80℃或更低的温度，然后将细胞存储在液氮中。
在冻存过程中，需要避免细胞受到过度的机械或化学刺激。
3. 储存条件
细胞存储在液氮中时，需要注意液氮的温度和液位。
液氮温度应保持在-196℃左右，液位应维持在液氮罐的安全范围内。
另外，细胞冻存管的选择和标签的使用也很重要，以确保细胞的标识和检索。
细胞冻存液储存条件对于细胞的存活和质量有着重要的影响。
科学的冻存液配制、冻存过程控制和储存条件维护可以有效提高细胞冻存液的保存质量和使用效果。
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一种细胞或干细胞冻存制备方法
一种细胞或干细胞冻存制备方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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一、液氮冷冻保存法
细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
注意：细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起
细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
细胞培养方法,细胞培养管理,细胞培养技术,细胞培养原理,原
代细胞,细胞永生化,生物科技,生物技术支持,细胞冻存,无血清细胞
冻存液。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
通常采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂（渗透型），这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
对于一些原代细胞（皮肤细胞），除渗透型保护剂外，还会适当添加表面型保护剂（海藻糖），以提高细胞存活率。
二、程序冻存步骤（需梯度降温）
1、配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用Procell通用血清型程序冻存液，货号PB180436；
2、制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；
3、细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；
4、加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为
3×106~1×107cells/mL；
5、分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；
6、推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜；
7、如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；
8、从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。