岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量PCR内参基因的筛选与验证
低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析
关于 Ｄ Ｄ １ ０ ４基 因 的研 究 相 对 较 少 ，有 研 究 表 明 ， Ｄ Ｄ １ ０ ４基 因及 蛋 白与 免 疫 防 御 密 切 相 关 ，在 Ｌ Ｐ Ｓ
Ａ ｓ ｐ ｉ ｄ ｏ ｃ ｈ ｉ ｒ ｏ ｔ ａ 、刺 参 科 Ｓ ｔ ｉ ｃ ｈ ｏ ｐ ｏ ｄ ｉ ｄ ａ ｅ 、 仿 刺 参 属 Ａ ｐ ｏ ｓ ｔ ｉ ｃ ｈ ｏ ｐ ｕ ｓ 。 目前 ，国内针对盐 度 变化对 刺 参影 响 的研 究 主 要 集 中在 生 长 发育 、生 化 指 标 、能 量 代 谢 、生存 极 限 和 适 应 能 力 等 方 面 Ｊ ，研 究 认 为 ， 刺参 在 其 最适 温 度 （ １ ５ ｃ ｌ Ｃ） 条件 下具 有 一 定 的渗 透压 调节 能力 。 国外 针对海 参渗透 调节 的研究 较为 深入 ｊ ，研 究认 为 ，外 环 境 变 化 引起 海 参 体 腔 液 渗透 压改 变 ，从 而改 变海 参 细 胞 的 离 子 运 输 及
主要试 剂 Ｔ ｒ ｉ ｚ ｏ ｌ 、Ｍ— Ｍ Ｌ Ｖ反 转 录 酶 、Ｒ Ｎ Ａ 酶
抑制 剂 、Ｍ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ（ Ｄ Ｌ ２ ０ ０ ０ ） 、ｄ Ｎ Ｔ Ｐ 、Ｅ ｘ Ｔ ａ ｑ Ｄ Ｎ Ａ聚
较 少 ，主要 集 中于对钠 钾 Ａ Ｔ Ｐ酶基 因的研究
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ －１ ０ —１ ８
和细菌 的刺激下 均 出现表达 上调 ，并且在 刺参个 体 不 同发育 时期 均有表 达 ¨ ｑ 。 近 年来 ，池 塘养 殖刺 参在 中国北方沿 海迅 速发
展 ，成 为许多 地 区的主导产 业 ，但在夏天 雨季 和冬
季 冰冻 灾害情 况下 ，近海 池塘 和围堰养殖 刺参 容易 受 到降 雨影 响而导致 盐度 降低 ，造成刺参 发病 、死 亡 ，给 海参养 殖业造 成极 大 的经 济损失 。刺参疾 病
QPCR检测盐胁迫下钝顶螺旋藻盐相关基因mRNA的表达差异的开题报告
QPCR检测盐胁迫下钝顶螺旋藻盐相关基因mRNA的表达差异的开题报告一、研究背景及意义钝顶螺旋藻（Spirulina platensis）是一种广泛应用于食品、药品和饲料等领域的蓝细菌藻类。
该藻类长期生长于盐碱地区，具有良好的耐盐性，能够适应极端的环境，因此其在应对盐胁迫方面具有独特的基因机制和代谢途径，是盐碱地区生态环境恢复及生物资源开发的理想模式生物。
盐胁迫是影响植物和藻类生长、发育和产量的重要环境因素，具有复杂的生理和分子生物学响应机制。
盐胁迫会引起细胞膜的损伤、离子和营养物质的平衡失调，激活一系列胁迫响应途径，导致大量的基因表达的改变和蛋白质的合成。
因此，对钝顶螺旋藻在盐胁迫下盐相关基因mRNA的表达差异进行研究，既可以深入了解其盐胁迫响应机制，又可为该藻类的适应性与耐受性提供参考依据，为实现藻类生产的高效化、可持续化和经济化提供科学依据。
二、研究内容及方法1. 研究内容本研究旨在利用QPCR技术检测盐胁迫下钝顶螺旋藻盐相关基因mRNA的表达差异，以验证其对盐胁迫的响应机制。
主要包括以下两个方面：（1）构建钝顶螺旋藻盐相关基因表达谱分别在高盐和低盐环境下培养钝顶螺旋藻，收集细胞样品并提取RNA，采用RT-PCR技术构建其盐相关基因表达谱，筛选感应表达量较大的基因作为后续实验的检测标志点。
（2）QPCR技术检测盐胁迫下钝顶螺旋藻盐相关基因mRNA的表达差异利用QPCR技术检测盐胁迫前后钝顶螺旋藻中感应表达量最大的盐相关基因的mRNA表达量，验证盐胁迫对该藻类盐相关基因表达的影响，为后续的基因功能研究提供一定的理论支持。
2. 方法（1）样品处理选取生长良好的钝顶螺旋藻菌液，分别加入不同浓度的NaCl溶液（如200mM、400mM、600mM等），培养48小时后，采用离心收集上清液，用RNAzol方法提取总RNA，并按照超微量RNA检测仪检测RNA的质量和纯度。
（2）cDNA合成按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit的说明书进行反转录反应，将总RNA转化为cDNA，并使用100ng的模板cDNA进行PCR放大。
不同浓度盐胁迫下枸杞实时荧光定量PCR内参基因的筛选
不同浓度盐胁迫下枸杞实时荧光定量PCR内参基因的筛选张得芳;于倩;史文君【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2022(53)5【摘要】合适的内参基因是实时荧光定量PCR反应准确与否的重要前提。
选择茄科植物常用的5个内参基因(GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S)为候选基因,以不同浓度NaCl胁迫后的宁夏枸杞(Lycium barbarum)和黑果枸杞(Lycium ruthenicum)幼苗叶片为试验材料进行qRT-PCR反应,通过GeNorm、Normfinder和BestKeeper软件对这些内参基因的稳定性进行分析排序,从而筛选出最适合枸杞试验研究的内参基因。
结果表明:利用GeNorm软件分析荧光定量结果后发现宁夏枸杞和黑果枸杞中都是Actin和GAPDH基因作为内参基因的表达较稳定;NormFinder软件分析结果发现宁夏枸杞中UBI稳定性最好,而在黑果枸杞中Actin基因最稳定;BestKeeper软件分析得出,在宁夏枸杞和黑果枸杞中均为Actin基因的稳定性最好。
综合以上结果,在不同浓度的盐胁迫处理条件下,Actin基因的表达稳定性最好,是最适合用于钠离子胁迫下宁夏枸杞、黑果枸杞qRT-PCR分析研究的内参基因,有利于保证后续试验结果的准确性和可靠性。
【总页数】9页(P581-589)【作者】张得芳;于倩;史文君【作者单位】青海大学农林科学院【正文语种】中文【中图分类】S718;S567.19【相关文献】1.不同浓度Cd2+胁迫下烟草实时荧光定量PCR内参基因的筛选2.不同浓度Cd^2+胁迫下烟草实时荧光定量PCR内参基因的筛选3.实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选4.盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选5.盐胁迫下蚕豆不同组织实时荧光定量PCR内参基因的筛选因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
白茶实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证
白茶实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证陈静;郑知临;林浥;曹红利;陈笛;陈桂信;叶乃兴【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2017(032)011【摘要】利用GeNorm,NormFinder,BestKeeper软件对茶树不同叶位及白茶萎凋过程中7个候选内参基因的表达稳定性进行分析.获得3个稳定性较好的内参基因β-Actin、GAPDH和RUBP,RUBP适合作为白茶萎凋过程叶片荧光定量PCR 的内参基因,β-Actin适合作为白茶不同叶位叶片荧光定量PCR的最佳内参基因.因此,在白茶萎凋过程中,使用GAPDH+ RUBP组合作为内参基因进行荧光定量PCR 检测.【总页数】6页(P1201-1206)【作者】陈静;郑知临;林浥;曹红利;陈笛;陈桂信;叶乃兴【作者单位】福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州350002;宁德职业技术学院生物技术系,福建福安 355000;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S571【相关文献】1.实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选 [J], 张梅; 邢永泽; 甄毓; 米铁柱; 于志刚2.澳洲坚果实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选 [J], 杨倩;杨子平;周娅丽;陈东泉;刘恒3.滇牡丹种子实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证 [J], 潘沫晗;陆添权;田波4.适用于大豆实时荧光定量PCR分析的内参基因的筛选和验证 [J], 曾文韬;柴春月;窦道龙5.山核桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证 [J], 赵艺蕊;黄春颖;王克涛;徐一帆;王建华;邢语琳;陶瞫宸;黄坚钦;李岩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选
大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选大豆不同发育时期及非生物胁迫下实时荧光定量PCR内参基因筛选摘要：实时荧光定量PCR是一种精确、灵敏和高通量的分子生物学方法，常用于基因表达分析。
然而，在进行实时荧光定量PCR分析时，必须选择合适的内参基因来校正样本间的变异性。
本研究旨在筛选出适用于大豆不同发育时期及非生物胁迫下的内参基因。
引言：大豆是全球重要的粮食和油料作物，对中国农业经济发展具有重要意义。
研究大豆的发育过程以及对非生物胁迫的响应机制，有助于揭示其生长发育性状及抗性的调控网络。
实时荧光定量PCR在大豆研究中广泛应用于基因表达分析，但缺乏对内参基因的筛选与验证。
方法：本研究选取了大豆不同发育时期的五个关键时间点（幼苗期、生长期、花期、结荚期和成熟期），以及受到非生物胁迫（如高温、低温和盐胁迫）的幼苗作为研究对象，通过实时荧光定量PCR技术进行内参基因筛选。
首先，根据前期文献和转录组数据，选取一批候选内参基因；然后，使用实时荧光定量PCR检测这些候选基因在不同发育时期和非生物胁迫下的表达情况；最后，利用一系列统计分析方法（如geNorm和NormFinder）筛选出最稳定的内参基因。
结果：在大豆不同发育时期的筛选结果中，我们发现基因A、B和C的表达稳定性较好，可以作为内参基因在这些发育时期进行基因表达分析；而在非生物胁迫情况下，基因D、E 和F表现出较好的稳定性，适合作为内参基因。
此外，我们还比较了不同发育时期和胁迫下的内参基因的表达水平，发现它们之间存在明显差异，提示不同条件下应选择不同的内参基因。
讨论：本研究通过实时荧光定量PCR技术和统计学方法，筛选出适用于大豆不同发育时期和非生物胁迫下的内参基因。
这对于进一步研究大豆的生长发育过程和非生物胁迫响应机制具有重要意义。
然而，鉴于内参基因的选择可能因物种和实验条件而异，后续研究还需进一步验证和优化。
结论：本研究筛选出了适用于大豆不同发育时期及非生物胁迫下的内参基因，并提示在实时荧光定量PCR分析中应根据具体实验条件选择合适的内参基因。
刺参3个盐度相关microRNA及预测靶基因的表达模式分析
刺参3个盐度相关microRNA及预测靶基因的表达模式分析王研;高思祺;匡倩瑶;刘怡宁;田燚【期刊名称】《大连海洋大学学报》【年(卷),期】2022(37)2【摘要】为研究低盐胁迫对刺参Apostichopus japonicus(16.38 g±1.27 g)体内离子浓度及钠钾ATP酶活力的影响,以及低盐胁迫与miRNA间的调控关系,试验取低盐度(18)胁迫0(对照)、6、24、48 h时的刺参体腔液,测定其钠、氯、钾离子浓度及钠钾ATP酶活力。
结果表明:低盐胁迫后,刺参体腔液中钠离子浓度在6 h时显著升高(P<0.05),随胁迫时间的延长钠离子浓度有所降低,氯离子和钾离子浓度均显著低于对照组(P<0.05)且均在6 h时浓度最低,钠钾ATP酶活力在6 h时低于对照组,在24 h时出现最低值;microRNAs(miRNAs)前体序列和成熟序列分析显示,miR-2011、miR-124和miR-2010均能形成稳定的茎环结构,序列相对保守;通过miRNAs与靶基因间的序列分析,获得3个差异表达的miRNAs(miR-2011、miR-2010和miR-124)及互作的靶基因;miR-2011、miR-2010和miR-124的miRNA表达量在盐度胁迫后均呈现上调,miR-2011和miR-2010的表达量在低盐胁迫48 h时达到最大,分别为对照组(0 h)的80倍和24倍;序列预测分析获得miR-2011的靶基因为PPM1L和PBK,miR-2010的靶基因为PPM1L,miR-124的靶基因为EGF3、IMPA1。
研究表明,刺参miR-124、miR-2011和miR-20103个盐度相关的miRNAs序列相对保守,且在盐度胁迫后均能够被诱导表达,从而参与刺参盐度胁迫的响应过程。
【总页数】9页(P212-220)【作者】王研;高思祺;匡倩瑶;刘怡宁;田燚【作者单位】大连海洋大学水产与生命学院【正文语种】中文【中图分类】S917.4【相关文献】1.风心病合并房颤患者心肌microRNA表达谱分析与靶基因预测2.低盐胁迫对刺参4个盐度调节相关基因表达丰度的影响3.盐度应激下刺参4个转运相关基因的适应表达研究4.盐度应激下刺参4个转运相关基因的适应表达研究5.蒙古冰草苗期抗旱相关microRNA的差异表达分析及靶基因预测因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
无患子RT-qPCR内参基因的筛选与验证
无患子RT-qPCR内参基因的筛选与验证徐圆圆;赵国春;郝颖颖;翁学煌;陈仲;贾黎明【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2022(38)10【摘要】无患子根、茎、叶、花和果皮均含有生物活性物质三萜皂苷,为了解三萜皂苷生物合成途径中相关基因的表达水平,需要筛选稳定表达的内参基因。
以无患子根、茎、叶、芽、雄花、雌花和不同发育时期的果皮为材料,根据无患子转录组数据,选择Sm18S,SmACT,SmTBCC,SmEF-1α,SmRPL1,SmRPS26,SmUBC12,SmUBP等8个基因作为候选内参基因。
通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测这些候选内参基因的表达量,并利用geNorm、NormFider和BestKeeper三个软件及RefFinder在线分析工具评价候选内参基因的稳定性。
结果表明,8个候选内参基因的表达量在所有样本间的变化幅度存在差异;geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个软件筛选出的最佳内参基因略有不同;综合分析结果表明SmACT、SmRPL1和SmUBP表达较为稳定,SmEF-1α稳定性最差;以SmACT、SmACT+SmRPL1组合和SmACT+SmRPL1+SmUBP 组合为内参对三萜皂苷生物合成途径中的8个候选基因进行校准所得的表达量基本上保持一致,且相对表达量结果与转录组数据基本保持一致,表明SmACT、SmACT+SmRPL1组合和SmACT+SmRPL1+SmUBP组合可作为无患子三萜皂苷生物合成途径相关基因表达研究的内参基因,同时也可以为无患子及近缘植物的其他生物学过程中的基因表达研究提供参考。
【总页数】10页(P80-89)【作者】徐圆圆;赵国春;郝颖颖;翁学煌;陈仲;贾黎明【作者单位】北京林业大学林学院省部共建森林培育与保护教育部重点实验室;北京林业大学国家能源非粮生物质原料研发中心;北京林业大学无患子产业国家创新联盟;福建源华林业生物科技有限公司;北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.草珊瑚不同光质条件下RT-qPCR内参基因筛选与验证2.草珊瑚不同光质条件下RT-qPCR内参基因筛选与验证3.长茎葡萄蕨藻胁迫条件下RT-qPCR内参基因的筛选与验证4.斑地锦RT-qPCR内参基因的筛选5.干旱胁迫下蒙农杂种冰草RT-qPCR内参基因的筛选因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实时荧光定量pcr分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选
热带骨条藻（S. tropicum）、曼式骨条藻（S. menzelii）、 江河骨条藻（S. potamos）、多恩骨条藻（S. dohrnii）、敏 盐骨条藻（S. subsalsum）、桂氏骨条藻（S. grevillei）和 亚当斯骨条藻（S. Ardens） 。 [2] 随着分子鉴定技术的发 展，研究者逐渐将目光聚焦在了单种骨条藻的研究上。
收稿日期: 2019−03−11；修订日期: 2019−04−23。 基金项目: 国家重点研发计划项目（2017YFC1404402）；鳌山科技创新计划项目（2016ASKJ02）。 作者简介: 张梅（1991—），女，陕西省泾阳县人，从事海洋微藻生理生化分子机制的研究。E-mail：zhangmeiouc@ * 通信作者: 甄毓，男，副教授，主要从事地球生物化学和分子生态学等领域的研究。E-mail：zhenyu@
2 期 张梅等：实时荧光定量 PCR 分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选
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Cyt b）、转录延伸因子（elongation factor 1 alpha, EF1α）、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine phosphoribosyltransferase, HPRT）、泛素结合酶（ubiquitin C, UBC）、 甘 油 醛 磷 酸 脱 氢 酶 （ glyceraldehyde-3-phosphate, GAPDH）、β-肌动蛋白（actin beta, β-actin）、β-微 管蛋白（tubulin beta, β-tubulin）、18S 核糖体 RNA（18S rRNA）和 25S 核糖体 RNA（25S rRNA）等。一个理想 的内参基因应该在任何细胞类型或实验条件下均能 稳定表达，但是迄今为止，并没有发现任何一个内参 基因在所有实验条件下的表达都是稳定的。所研究 的物种类型、组织结构、生长发育阶段以及实验条件 都会对内参基因的表达产生影响[8– ， 10] 因此，需要对不 同实验体系中内参基因的稳定性进行评价与鉴定，以 便筛选出合适的内参基因。
食品过敏原牡蛎成分PCR检测方法的初步研究
食品过敏原牡蛎成分PCR检测方法的初步研究张懿翔;曲勤凤;余顺吉;胡雪莲;熊薇;葛宇【摘要】目的:建立基于PCR技术的过敏原牡蛎成分快速检测方法,结合溶解曲线及特异的Tm值与Ct值,用于不同产品的牡蛎成分检测.方法:根据NCBI上的牡蛎线粒体序列,通过DNA Star等软件设计引物,分别采用普通PCR和SYBR Green I 实时荧光PCR的方法建立食品过敏原牡蛎成分的检测方法,对十种牡蛎阳性样品和二十余种阴性样品进行实验,并且对几种牡蛎相关食品进行检测.结果:研究建立的检测方法可以检测出含牡蛎成分0.1％的样品,其中荧光PCR的灵敏度达到0.01ng/μL,特征峰的Tm温度为80.08℃,能够检测出牡蛎相关食品中的牡蛎成分.结论:该方法是一种操作安全方便、成本较低、特异、灵敏的实时荧光PCR方法,对于收集到的食品相关产品以及保健品中牡蛎粉的检出率为100％,该方法可广泛应用于食品中牡蛎成分的快速鉴定.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2019(040)002【总页数】6页(P251-256)【关键词】食品过敏原;牡蛎成分;PCR;定性检测【作者】张懿翔;曲勤凤;余顺吉;胡雪莲;熊薇;葛宇【作者单位】上海市质量监督检验技术研究院,上海200233;上海市质量监督检验技术研究院,上海200233;上海市质量监督检验技术研究院,上海200233;上海市质量监督检验技术研究院,上海200233;上海市质量监督检验技术研究院,上海200233;上海市质量监督检验技术研究院,上海200233【正文语种】中文【中图分类】TS254.7食品过敏原是指能对特定人群产生免疫反应或者过敏反应的蛋白质和其他相关物质。
食品过敏属于机体对外源物质产生的一种变态反应[1]。
据统计,全球约有1%的成人和2.5%的儿童患有食物过敏症,每年因此造成150人以上的死亡以及超过2万人次的急救处理[2]。
在发达国家约有6%的儿童和3%～4%的成年人被这种免疫介导性疾病所困扰[3-4]。
胡椒实时荧光定量PCR内参基因的筛选
胡椒实时荧光定量PCR内参基因的筛选胡丽松;范睿;伍宝朵;吴刚;谭乐和;郝朝运【摘要】In order to identify the suitable internal control gene for the gene expression analysis in black pepper,the expression of 9 housekeeping genes,including Polyubiquitin 1,Polyubiquitin 2,Polyubiquitin 3,GAPDH1,GAPDH 2,Histone 3-1,Histone 3-2,Cyclophilin and Actin were assessed by using real time quantitative PCR in 8 different tissues.On the basis of Ct value comparison,the stability of housekeeping gene expression was analyzed by using geNorm,NormFinder and BestKeeper.The results of comprehensive ranking by three methods indicated that the most stable three reference genes were Histone 3-1,Polyubiquitin 1 and GAPDH 2.The value of pairwise variation Vn/n+1 suggested that Histone 3-1 and Polyubiquitin 1 had to be used together for normalization,which would make the expression of target genes more reliable in black pepper.%为筛选胡椒不同组织间稳定表达的最佳内参基因,以胡椒栽培种‘热引1号’的主根、主蔓、花序和不同发育时期果实共8个组织为材料,采用实时荧光定量PCR技术,分析Polyubiquitin 1、Polyubiquitin2、Polyubiquitin3、GAPDH 1、GAPDH 2、Histone 3-1、Histone 3-2、Cyclophilin、Actin等共9个不同持家基因的表达差异情况.基于各个基因的Ct值,利用geNorm、NormFinder和BestKeeper分析候选持家基因表达的稳定性.结果表明,在不同的组织中,9个持家基因的表达量存在差异.3个软件分析出的结果有所不同,综合分析结果显示,Histone 3-1表达最为稳定,其次为Polyubiquitin1、GAPDH-2.内参基因标准化因子的配对差异分析(Vn/n+1)表明,Histone 3-1和Polyubiquitin 1是分析胡椒基因表达模式的最佳内参基因组合.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2017(038)010【总页数】6页(P1901-1906)【关键词】胡椒;实时荧光定量PCR;内参基因【作者】胡丽松;范睿;伍宝朵;吴刚;谭乐和;郝朝运【作者单位】中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533;中国热带农业科学院香料饮料研究所,海南万宁571533【正文语种】中文【中图分类】Q949.732.3实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR，qPCR）是一种新的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中添加特定荧光基团，对整个PCR反应过程中的产物变化进行实时监测[1-2]。
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到设置的不同盐度梯度, 每个平行组随机放入 3 个体, 未发现死亡个体, 胁迫一周后取样。暂养及 胁迫期间连续充氧, 每天投喂饵料, 吸底及换水 一次。 1.3 RNA 提取及 cDNA 合成
关键词: 岩牡蛎; 实时定量 PCR; 内参基因; 低盐胁迫
中图分类号: 10058737(2019)04065707
近岸海洋系统是全球最重要的生态系统之一, 具有极高的经济价值和生态价值[1], 拥有众多水
产养殖品种。盐度的季节性波动以及潮汐波动是 该地区的一个重要特征[2]。同时由于近十年来, 全
1. 中国海洋大学, 海水养殖教育部重点实验室, 山东 青岛 266003; 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071
摘要: 实时荧光定量 PCR 已广泛用于基因表达的分析, 合适的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。本研究 选用正常生理状态下岩牡蛎(Crassostrea nippona)的鳃、外套膜、闭壳肌和内脏团 4 种组织以及盐度 10、20 和 30 暂养 1 周后的鳃组织为材料, 对已报道的常见内参基因(EF1A、GAPDH、RO21、TUB 和 TUA)的稳定性通过 3 种 方法(geNorm、NormFinder 和 BestKeeper)进行分析和筛选, 发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下, GAPDH 和 RO21 可以作为合适内参基因, 而在不同组织中, 需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果。本 研究是首次利用 q-PCR 对岩牡蛎进行内参基因的筛选和验证, 为今后该物种低盐胁迫相关的基因表达和功能基因 的研究提供重要依据。
中国水产科学 2019 年 7 月, 26(4): 657663 Journal of Fishery Sciences of China
DOI: 10.3724/SP.J.1118.2019.18402
研究论文
岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量 PCR 内参基因的筛选与验证
宫建文1, 李琪1, 2, 于红1
球变暖导致海洋环境急剧变化, 冰川加速消融, 雨季降水增多导致沿岸带海水盐度显著降低[3]。
生活于该地区的海洋生物对于该地区不同盐度的 适应机制以及适应能力有所不同[1]。对于鱼类, 甲
壳类等渗透调节者(osmoregulator)而言, 可以通
过活跃的离子转运机制维持细胞外液(ECF)的渗 透压在一个稳定的范围[4-5], 而对于牡蛎等无脊
椎动物而言, 它们缺乏渗透压调节能力, 其渗透
压只能与外界环境渗透压保持一致, 又被称为渗 透压随变者(osmoconformer)[6]。低盐会影响牡蛎 的正常生理代谢包括摄食[7]、免疫活性[8]及生长[9], 甚至导致大规模死亡[10]。
岩牡蛎自然分布于日本、韩国和中国沿海, 附着生活在低潮线至水深 20 m 处的岩礁上[11]。与
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中国水产科学
第 26 卷
(TUB)已被广泛应用于长牡蛎的研究中[17]。然而, 目前国内外关于岩牡蛎的研究仅仅局限在生物学, 形态学等基础层面[11], 关于岩牡蛎低盐胁迫应答 相关分子机制的研究几乎空白。而内参基因的筛 选验证更是挖掘相关功能基因等研究的首要基础 工作。
本研究评估了 5 个内参基因在正常生理状况 下的 4 个组织和低盐胁迫下的鳃中的稳定性, 确 定了合适的参考基因, 并通过 qRT-PCR 方法使岩 牡蛎靶基因的表达正常化。这是首次针对岩牡蛎 进行的内参基因筛选工作, 这些内参基因将为进 一步研究与低盐胁迫相关的功能基因的表达模式 提供有效信息, 并将有助于研究该物种低盐胁迫 应答相关分子机制。
收稿日期: 2018-12-06; 修订日期: 2019-01-17. 基金项目: 山东省科技发展计划项目(2016ZDJS06A06); 青岛市产业培育计划项目(17-3-3-64-nsh). 作者简介: 宫建文(1993–), 女, 硕士研究生, 主要从事贝类遗传育种研究. E-mail: gongjianwen520@ 通信作者: 李琪, 教授, 博士生导师, 主要从事贝类遗传育种研究. E-mail: qili66@
1 材料与方法
1.1 实验材料 岩牡蛎亲本选自日本佐渡岛, 于中国山东乳
山海域进行子代的养殖, 实验所用个体为 2016 年 采集的一龄岩牡蛎。运回实验室后, 立即取其外 套膜、鳃、闭壳肌和内脏团置于液氮中, 后转移 至‒80℃低温冰箱保存。 1.2 实验方法
实验共设置 3 个盐度梯度, 即盐度 10、20 和 30(对照), 每个梯度设 3 个平行组, 各盐度处理组 均由自然砂滤海水和曝气 24 h 自来水(低盐组)配 制而成。实验所用岩牡蛎先于 70 L 塑料桶中暂养 一周, 暂养海水盐度为 30。暂养结束后直接放置
生活在潮间带的主要养殖种类长牡蛎(Crassostrea gigas)相比, 对盐度变化更加敏感[12]。牡蛎抵抗外 界盐度变化主要采取两种策略, 在可耐受的范围 内通过游离氨基酸等渗透调节因子将自身渗透压 维持与周围海水水平一致, 超过耐受范围后会通 过闭壳活动断绝与周围海水的交换来抵抗低盐环 境, 与之相关的还会触发相关免疫反应, 热休克 蛋白等抗凋亡因子的表达升高[11-13]。
实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)是一种常用的检测基因表达的方法, 其 灵敏度高、灵活性强、重复性好, 已被广泛应用 于分子医学、生物科学、微生物学以及诊断学等 领域[22]。然而, 由于 RNA 的质量和完整性和引物 的特异性等差异会影响实验的准确性, 选择在不 同组织及不同处理下具有相对高且稳定表达的 合适的参考基因能够减少样本间的系统误差[16]。 内参基因如肌动蛋白 β-actin (ACT), 延长因子 elongation factor-1α (EF1Α), 微管蛋白 β-tubulin
本研究选用正常生理状态下岩牡蛎crassostreanippona的鳃外套膜闭壳肌和内脏团4种组织以及盐度1020和30暂养1周后的鳃组织为材料对已报道的常见内参基因ef1agapdhro21tub和tua的稳定性通过3种方法genormnormfinder和bestkeeper进行分析和筛选发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下gapdh和ro21可以作为合适内参基因而在不同组织中需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果