脯氨酸含量的测定方法

植物体内游离脯氨酸含量的测定

一、原理

磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。

二、仪器及试剂

1. 仪器：分光光度计；电子分析天平；离心机；10ml+2ml离心管；恒温水浴锅；

2 .试剂及配制：

冰醋酸；甲苯。

2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol·L －1磷酸(7ml磷酸+13ml蒸馏水)中，37度摇床摇动溶解，贮于4℃冰箱中。

3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100ml。

1mg·ml-1脯氨酸标准母液配制

三、实验步骤

1. 脯氨酸标准曲线的制作

1.1 取6支10ml离心管编号，按下表配制每管含量为0～25μg的脯氨酸标准液。

加入表中试剂后，标准曲线样品和待测样品一起置于沸水浴中加热60min （注意管盖需要压住，不然会爆开挥发液体），取出冷却，各试管再加入2ml 甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

1.2 以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

1.3 标准曲线的绘制

以1～5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品的测定

2.1 脯氨酸的提取

液氮研磨样品材料，称取适当重量样品粉末（0.1-0.2g）于2ml离心管, 然后向各管分别加入1.5ml3％的磺基水杨酸溶液，振荡混匀。（注意：样品一定要精确称量并记录）

离心12000g，10min，上清液1ml移至新10ml离心管中。

2.2 测定

加入1ml冰醋酸及1ml 2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热60min，溶液即呈红色。冷却后加入2ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，

用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。

四、计算结果

从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：

C*稀释倍数*提取液总量（ml）脯氨酸含量（μg·g－1Fw）＝———————————————————

样品鲜重（g）×测定时提取液用量（ml）公式中：C---从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）;稀释倍数（如果见样品中甲苯红色太深，可以吸取一定量的萃取液经甲苯稀释后再测量）;提取液总量

---1.5ml，测定时提取液用量---1.5ml磺基水杨酸提取后吸取了多少，一般吸取1ml。

五、注意事项:

1. 配置的酸性茚三酮溶液仅在24 h内稳定，因此最好现用现配。

2. 测量新样品时，用甲苯冲洗比色杯。

3. 试剂添加次序不能出错。

4. 记得称量样品鲜重