湖南沙子岭猪SLA-DR基因克隆及生物信息学分析
沙子岭猪的营养与设施化养殖模式
圭墅． 篡
Ｆｌ Ａ ｒ Ｕ Ｒ Ｅ
沙子岭 猪的营养与设施化养殖模式
吴 买生
（ 湘潭市 畜牧 兽医水产局， 湖南 湘潭 ４ １ １ １ ０ ４ ）
摘 要： 该文介绍了沙子岭猪的主要特征特性、 传统养殖方式 营养需要与饲料配制要求、 设施化养殖模式及各类猪
群的饲 养 管理 要点 。
一
内的值班护理和仔 猜ｆ ｌ ｇ ｆ ￣温 ¨ 常 莆 要 。 沙 了 岭 猪 实 行 双 川 析 ，断 奶 时 仔 。
沙 ＿ 『 ． 岭ｊ ｛ ｉ 产 区 属 热 带 季 风 湿 润 气 ｊ 并 体重 ・ 般在 ｌ ０ ｋ ｇ
李 分 明 ， 气 候 温 和 ，光 照 充 足 ，
形成 了而 ｌ ｆ 粗饲、 低 营 养、 产 多 、 母 ７ ２ ％，瘦 ｌ ＾ 】 率４ ２ ％； 沙 子岭 猪 与大 约 克 、 但 由十母猪产后体 力消耗 人， 当仔猪破
Ｉ Ｈ ｆ 、Ｉ 质佳等优 良遗传特性 。多年柬， 长ｆ １ 等 围 外 猪 种 开 展 元 、 三 元 杂 交 ，
传统 饲 养 方 而 ，』 ： 【 ｘ ： 农 ’ 一 般 采 ， 、蔬 菜脚 ｌ 卜 Ｉ 、
样 ，凶生 长周 期 ｋ、饲料利 用率低及 雨 量 充沛 ，土 地 肥 沃 。产 区 主 要 利ｔ 植 水 用 熟 食 饲 养 ， 多 以
体 瘦 肉 率 不 高 等 Ｊ ｉ ｆ ｉ ｌ ｆ ＇ Ｊ ， 足 ， 缺 乏 市 稻、湘莲 、蔬 菜 、红 薯 、南 瓜、油 菜 、
珍 贾遗 传 资 源 。 经 长期 门然 选 择 和 人 ］ ＝ ： ５ ． ７ ３ ％的情 况 下 ， 日增重 ４ ８ ０ ｇ，料 重 体 重 较 少 ，平 均 只 有 ０ ． ８ ２ ｋ ｇ ， 最 少 的 选择 ， 沙 于岭 猪 适 成 “ １ 地 产 区 态 条 件 ， 比４ ． ４ ８ ： ｌ； 体罩 ８ ０ ｋ ｇ屠 宰 ，屠 宰 率 仅 ０ ． ５ ｋ ｇ 。 尽管沙子岭 雌猪扩ｌ ｆ ｒ 性能好 ，
实验用荣昌猪SLA-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析
畜牧兽医学报 2023,54(7):3064-3077A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.07.037开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):实验用荣昌猪S L A -1等位基因鉴定及分子遗传特征分析刘弘毅,罗霆宇,李昌文,于海波,路小野,陈洪岩,夏长友*,高彩霞*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,动物疫病防控全国重点实验室,黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室,国家禽类实验动物资源库,哈尔滨150069)摘 要:旨在明确实验用荣昌猪S L A 遗传背景,深入研究S L A -1分子相关的抗原递呈和免疫应答机制,本研究对27头荣昌猪采集抗凝血,分离外周血淋巴细胞,提取总R N A ,设计特异性引物对S L A -1基因进行R T -P C R 扩增㊁克隆和测序,对获得序列的分子特征进行分析㊂结果显示,荣昌猪中共获得11个S L A -1等位基因,其中,9个为新等位基因,全部获得G e n B a n k 登录号和I S A G S L A 命名委员会官方命名,S L A -1*24:01等位基因在该群体中频率最高㊂S L A -1基因编码区全长1086b p,存在127个核苷酸多态位点,非同义单核苷酸多态性位点数高于同义单核苷酸多态性位点数㊂核苷酸多样度为0.0449,单倍型多样度为1,平均核苷酸差异数为48.782,G+C 含量为64.9%㊂S L A -1基因编码的361个氨基酸中,有75个氨基酸变异位点;第2和第3外显子编码区多态性最高,且第2外显子区域的氨基酸变异程度高于第3外显子区,组成抗原肽结合槽6个口袋的33个关键氨基酸位点中,11个在人与荣昌猪之间高度保守,与β2-微球蛋白结合的19个关键氨基酸位点中,10个保持一致,C D 8分子与MH C 结合的关键氨基酸位点中,只有225(T h r /S e r )和228(T h r /M e t )位点不同㊂同源性和系统进化树分析表明,S L A -1*10:03和S L A -1*18:03分别与人H L A -A *02:01和H L A -A *11:01等位基因的同源性最高,荣昌猪与亚洲野猪㊁巴马小型猪和融水小型猪等亚洲猪种具有较近的亲缘关系㊂本研究成功获得了中国地方猪种荣昌猪S L A -1基因,发现其具有极为丰富的多态性,为揭示荣昌猪的S L A 遗传背景和开展异种移植研究奠定了遗传学基础㊂关键词:荣昌猪;S L A -1等位基因;鉴定;分子特征中图分类号:S 852.4 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)07-3064-14收稿日期:2022-11-17基金项目:国家重点研发计划项目(2021Y F F 0703000);国家自然科学基金(31872313);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022018);兽医生物技术国家重点实验室课题(S K L V B P 202120;S K L V B P 202101)作者简介:刘弘毅(1997-),男,湖南常德人,硕士生,主要从事实验动物免疫遗传学研究,E -m a i l :m 175********@163.c o m*通信作者:夏长友,主要从事实验动物学研究,E -m a i l :x i a c h a n g y o u @c a a s .c n ;高彩霞,主要从事实验动物免疫遗传学研究,E -m a i l :ga o c a i x i a @c a a s .c nI d e n t i f i c a t i o n o f S L A -1A l l e l e s a n d A n a l ys i s o f M o l e c u l a r G e n e t i c C h a r a c t e r i s t i c s i n R o n g c h a n g P i gs L I U H o n g y i ,L U O T i n g y u ,L I C h a n g w e n ,Y U H a i b o ,L U X i a o y e ,C H E N H o n g ya n ,X I A C h a n g yo u *,G A O C a i x i a *(S t a t e K e y L a b o r a t o r y f o r A n i m a l D i s e a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n ,H e i l o n g j i a n g P r o v i n c i a l K e y L a b o r a t o r y o f L a b o r a t o r y A n i m a l a n d C o m p a r a t i v e M e d i c i n e ,N a t i o n a l P o u l t r y L a b o r a t o r yA n i m a l R e s o u r c e C e n t e r ,H a r b i n V e t e r i n a r y R e s e a r c h I n s t i t u t e ,C h i n e s e A c a d e m y o fA gr i c u l t u r a l S c i e n c e s ,H a r b i n 150069,C h i n a )A b s t r a c t :T h e s t u d y a i m e d t o c l a r i f y t h e S L A g e n e t i c b a c k g r o u n d o f e x p e r i m e n t a l R o n g c h a n g p i gs a n d f u r t h e r s t u d y S L A -1m o l e c u l e -r e l a t e d a n t i g e n p r e s e n t a t i o n a n d i mm u n e r e s po n s e m e c h a n i s m.7期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析I n t h i s s t u d y,t h e a n t i c o a g u l a n t b l o o d s w e r e c o l l e c t e d f r o m27R o n g c h a n g p i g s,a n d p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s w e r e i s o l a t e d.T o t a l R N A w e r e e x t r a c t e d a n d S L A-1g e n e s w e r e a m p l i f i e d u s i n g s p e c i f i c p r i m e r s w i t h R T-P C R m e t h o d,c l o n e d a n d s e q u e n c e d.M o l e c u l a r g e n e t i c c h a r a c t e-r i s t i c s o f t h e o b t a i n e d s e q u e n c e s w e r e f u r t h e r a n a l y z e d.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t a t o t a l o f11 S L A-1a l l e l e s w e r e o b t a i n e d i n R o n g c h a n g p i g s,o f w h i c h n i n e w e r e n o v e l a l l e l e s.A l l a l l e l e s o b-t a i n e d G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e r s a n d o f f i c i a l n a m e s w e r e a s s i g n e d b y t h e I S A G S L A N o m e n c l a-t u r e C o mm i t t e e.T h e f r e q u e n c y o f S L A-1*24:01a l l e l e w a s t h e h i g h e s t i n t h i s p o p u l a t i o n.T h e f u l l-l e n g t h o f t h e c o d i n g r e g i o n o f S L A-1g e n e w a s1086b p,w i t h127n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i c s i t e s.T h e n u m b e r o f n o n-s y n o n y m o u s S N P s w a s h i g h e r t h a n t h a t o f s y n o n y m o u s S N P s.T h e n u-c l e o t i d e d i v e r s i t y w a s0.0449,t h e h a p l o t y p e d i v e r s i t y w a s1,t h e a v e r a g e n u c l e o t i d e d i f f e r e n c e n u m b e r w a s48.782,a n d t h e G+C c o n t e n t w a s64.9%.T h e r e w e r e75a m i n o a c i d v a r i a t i o n s i t e s a m o n g361a m i n o a c i d s e n c o d e d b y S L A-1g e n e.T h e c o d i n g r e g i o n o f e x o n2a n d e x o n3h a d t h e h i g h e s t p o l y m o r p h i s m,a n d t h e d e g r e e o f a m i n o a c i d v a r i a t i o n i n e x o n2r e g i o n w a s h i g h e r t h a n t h a t i n e x o n3r e g i o n.A m o n g t h e33k e y a m i n o a c i d s i t e s t h a t m a k e u p t h e s i x p o c k e t s o f t h e p e p-t i d e-b i n d i n g g r o o v e,11o f t h e m w e r e h i g h l y c o n s e r v e d b e t w e e n h u m a n a n d R o n g c h a n g p i g,a n d 10o f t h e19k e y a m i n o a c i d s i t e s w e r e c o n s i s t e n t w i t hβ2-m i c r o g l o b u l i n.O n l y t w o s i t e s,225 (T h r/S e r)a n d228(T h r/M e t),w e r e d i f f e r e n t a m o n g t h e k e y a m i n o a c i d s i t e s t h a t C D8m o l e-c u l e s b i n d t o MH C.T h e a n a l y s i s o f h o m o l o g y a n d p h y l o g e n e t i c t r e e s h o w e d t h a t S L A-1*10:03 a n d S L A-1*18:03h a d t h e h i g h e s t h o m o l o g y w i t h h u m a n H L A-A*02:01a n d H L A-A*11:01a l-l e l e s,r e s p e c t i v e l y.R o n g c h a n g p i g w a s c l o s e l y r e l a t e d t o A s i a n b o a r,B a m a m i n i a t u r e p i g,R o n g-s h u i m i n i a t u r e p i g a n d o t h e r A s i a n p i g b r e e d s.T h e S L A-1a l l e l e s o f C h i n e s e R o n g c h a n g p i g s w e r e s u c c e s s f u l l y i d e n t i f i e d,a n d i t w a s f o u n d t o h a v e h i g h l y r i c h p o l y m o r p h i s m.T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y p r o v i d e d a g e n e t i c f o u n d a t i o n f o r r e v e a l i n g t h e S L A g e n e t i c b a c k g r o u n d o f R o n g c h a n g p i g s a n d c o n d u c t i n g x e n o t r a n s p l a n t a t i o n r e s e a r c h.K e y w o r d s:R o n g c h a n g p i g;S L A-1a l l e l e;i d e n t i f i c a t i o n;m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:X I A C h a n g y o u,E-m a i l:x i a c h a n g y o u@c a a s.c n;G A O C a i x i a,E-m a i l: g a o c a i x i a@c a a s.c n主要组织相容性复合体(m a j o r h i s t o c o m p a t i-b i l i t y c o m p l e x,MH C)是一组编码主要组织相容性抗原的基因群总称,最早在小鼠体内被发现[1-2]㊂MH C作为组织细胞的遗传标记分子,与动物的抗病性㊁抗原识别㊁递呈和免疫调节密切相关[3-5]㊂此外,MH C编码的高度多态的蛋白对器官移植成功与否具有关键作用[6-9]㊂猪MH C又称猪白细胞抗原(s w i n e l e u k o c y t e a n t i g e n,S L A),位于猪第7号染色体并横跨着丝点,是包含猪基因组中许多免疫相关基因的紧密连锁区域[10-11]㊂S L A基因包含高度多态的S L A I类㊁S L A I I类和相对保守的S L A Ⅲ类基因,高度多态的S L A-1基因是经典的S L A I 类基因,目前I P D-MH C(I mm u n o P o l y m o r p h i s m D a t a b a s e-MH C)数据库共收录了89个S L A-1基因(R e l e a s e3.9.0.107/2022b u i l d209)㊂S L A-1基因编码的S L A I类分子通过内源性抗原递呈,将胞内的抗原肽递呈到细胞表面,经C D8+T细胞识别并引起细胞免疫,对于机体的健康以及对疾病的抗病性具有重要作用㊂S L A-1包含8个外显子,第1外显子编码前导多肽链,第2~4外显子分别编码α1~α3胞外域,第5外显子编码跨膜结构域,第6~ 8外显子编码胞内域,其中,第2和第3外显子编码的α1和α2胞外域多态性最高,二者形成的抗原肽结合槽(p e p t i d e-b i n d i n g g r o o v e,P B G)决定了与之结合的T淋巴细胞表位的特异性[12]㊂有研究利用S L A-1分子体外构建S L A I类复合体研究与病毒T细胞表位结合的特异性,发现不同S L A-1分子结合T细胞表位的能力不同[13],这就提示携带不同S L A-1等位基因的猪对疫病的抵抗力不同㊂猪是世界范围内广泛培育的重要经济动物,是5603畜牧兽医学报54卷人们日常生活主要的动物蛋白来源,而且由于猪与人类在基因组㊁血液生理指标㊁解剖学结构和成分等方面高度相似,使其逐渐成为一种重要的实验动物,应用于临床器官移植㊁动物疾病模型构建和病原致病机制研究等领域[14-17]㊂荣昌猪是中国西南地区的本土猪种,由于其肉质好和抗逆性强成为中国主要的优良猪种之一,目前,已在各领域表现出重要的应用价值,如用于建立人类医学动物模型,M I T F-M基因突变形成的白化耳聋荣昌猪可以作为一种人类遗传性神经性听力缺陷的大型哺乳动物模型,在人工耳蜗应用以及研究中国耳聋遗传方面具有十分重要的意义[18-20]㊂同时荣昌猪具有较强的抗病性,已用于建立猪病原感染模型并研究自身免疫机制,为重大疫病防控提供支撑,同时也用于筛选独特的免疫相关分子,为抗病育种奠定基础㊂2019年,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所从重庆市畜牧科学院生物工程研究所引入27头荣昌猪,屏障环境饲养繁育,主要用于培育标准化的实验猪种群,同时开展了疫病净化㊁疾病模型构建及应用研究㊂本研究就该荣昌猪种群S L A-1基因特征进行分析,旨在为标准化实验荣昌猪的培育和推广应用奠定基础,也为异种移植研究提供遗传学参考㊂1材料与方法1.1试验材料通过前腔静脉采集中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存的27头荣昌猪(:6,:21)的抗凝血5m L,置于E D T A抗凝管,用于分离外周血淋巴细胞,27头荣昌猪的编号如表1所示㊂1.2主要试剂猪外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司,S i m p l y总R N A提取试剂盒购自B i o s h a r p公司,D N A胶回收试剂盒购自OM E-G A公司,O n e s t e p P C R试剂盒㊁感受态细胞大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o l i)D H5α和载体p M D18-T v e c t o r均购自宝生物工程(大连)有限公司㊂1.3外周血淋巴细胞的分离和R N A的提取根据猪外周血淋巴细胞分离液说明书,将猪外周血淋巴细胞分离,-80ħ保存㊂根据S i m p l y总R N A提取试剂盒说明书提取外周血淋巴细胞总R N A,利用超微量分光光度计(N a n o P h o t o m e t e r,德国)测量总R N A浓度,-80ħ保存㊂1.4引物设计与合成参考G e n B a n k中大白猪H01单倍型序列(登录号:A J251829),利用P r i m e r P r e m i e r5软件设计引物扩增S L A-1基因,扩增片段约为1537b p㊂S L A1-F:5'-C T C A G C T T C T C C C C A G A C C C C G A-G G C T G A G G A T C-3',S L A1-R:5'-G G A T T C T G G A A G G T T C T C A A T C C T T C C A T T T A T T T C C T C-3'㊂引物由吉林省库美生物科技有限公司合成㊂1.5S L A-1的扩增和测序利用O n e S t e p P C R试剂盒以及合成的引物对目的基因进行扩增㊂R T-P C R反应体系50μL:P r i-m e S c r i p t1S t e p E n z y m e M i x2μL,2ˑ1s t e p B u f f e r 25μL,上㊁下游引物(10p m o l㊃μL-1)各1.5μL,R N A 模板2μL(约300n g㊃μL-1),R N a s e F r e e H2O 18μL㊂P C R反应条件:50ħ反转录30m i n;94ħ预变性2m i n;94ħ变性30s,55ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,35次循环;72ħ延伸8m i n㊂利用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定,由吉林省库美生物科技有限公司直接测序㊂对于杂合子,利用胶回收试剂盒纯化目的片段,与p M D-18T载体在16ħ条件下连接2h,然后转化至大肠杆菌D H5α感受态细胞中,并利用含A m p抗性的L B平板进行筛选㊂鉴定阳性单克隆菌落后,送至吉林省库美生物科技有限公司测序㊂1.6序列比对及分析测序获得的原始序列数据通过C h r o m a s V e r-s i o n2.6.6进行人工编辑,校对电泳峰图与碱基对应关系㊂利用M E G A7.0软件对直接测序和克隆测序结果进行比对,根据不同猪个体中S L A-1基因序列差异确定等位基因序列㊂当同一个体克隆测序中至少3个单克隆的序列相同且该序列在不同个体的直接或克隆测序中多次出现,判定为一个等位基因,即一个等位基因的判定必须至少出现在2个不同的个体或来自2个独立的P C R反应㊂利用D n a S P5.10.01软件进行等位基因多态性分析,利用D N A S T A R L a s e r g e n e软件进行同源性分析,以人白细胞抗原(h u m a n l e u k o c y t e a n t i g e n,H L A)频率最高的H L A-A*02:01等位基因(G e n B a n k登录号:F N806801)为参照[21],利用M E G A7.0采用邻接法(N e i g h b o r-J o i n i n g,N-J)构建系统进化树㊂所有序列提交G e n B a n k获得登录号㊂将新等位基因提交国际动物遗传学学会(T h e I n t e r n a t i o n a l S o c i e-t y o f A n i m a l G e n e t i c s,I S A G)S L A命名委员会获得66037期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A -1等位基因鉴定及分子遗传特征分析官方命名㊂S L A 等位基因的命名采用H L A 命名系统,等位基因前两位数字用于指定具有相似D N A序列的等位基因组( 组 是基于系统发育分析和D N A 序列基序的识别);第3和第4位数字用于指定具有不同蛋白质序列的等位基因;第5和第6位数字用于指定因同义核苷酸替换而不同的等位基因;以冒号(:)作为区域分隔符㊂2 结 果2.1 R T -P C R 扩增与克隆R T -P C R 扩增获得1537b p 左右的目的条带(图1),清晰且单一,表明已成功扩增S L A -1基因㊂将27头猪的扩增产物全部进行直接测序,分析测序结果,发现4头猪测序结果为单峰(猪编号为3㊁9㊁13和27),且序列相同,表明是纯合子个体,对其中1头(3号猪)进行了克隆㊂其它23头猪均为套峰,表明为杂合子个体,将具有相同杂合套峰的个体进行分类后,分别对10个个体(猪编号为3㊁5㊁10㊁15㊁16㊁17㊁18㊁19㊁23和24)进行了克隆㊂所有克隆鉴定阳性单克隆菌落并测序(图2)㊂M.D L 2000D N A 分子标记;1.P C R 产物(猪编号2);2.P C R 产物(猪编号3);3.P C R 产物(猪编号5);4.P C R 产物(猪编号10);5.P C R 产物(猪编号14);6.P C R 产物(猪编号15);7.P C R 产物(猪编号17);8.P C R 产物(猪编号18)M.D L 2000D N A m a r k e r ;1.P C R p r o d u c t o f N o .2;2.P C R p r o d u c t o f N o .3;3.P C R p r o d u c t o f N o .5;4.P C Rpr o d u c t o f N o .10;5.P C R p r o d u c t o f N o .14;6.P C R pr o d u c t o f N o .15;7.P C R p r o d u c t o f N o .17;8.P C R pr o d u c t o f N o .18图1 S L A -1基因部分扩增结果F i g .1 P a r t i a l a m pl i f i c a t i o n r e s u l t s o f S L A -12.2 S L A -1等位基因序列分析分析27头荣昌猪S L A -1基因直接测序和克隆测序结果,根据等位基因的判定原则共鉴定出11个等位基因(表1),将其提交G e n B a n k 数据库和I P D -MH C 数据库,分别获得登录号和I S A G S L A 命名委员会的官方命名(表2)㊂与I P D -MH C 数据库中M.D L 2000D N A 分子标记;1~4.编号10的单克隆鉴定部分结果;5~8.编号14的单克隆鉴定结果M.D L 2000D N A m a r k e r ;1-4.P a r t i a l r e s u l t s o f n o .10m o n o c l o n a l i d e n t i f i c a t i o n ;5-8.P a r t i a l r e s u l t s o f n o .14m o n -o c l o n a l i d e n t i f i c a t i o n图2 部分阳性单克隆菌落P C R 扩增结果F i g.2 P a r t i a l r e s u l t s o f m o n o c l o n a l i d e n t i f i c a t i o n 已提交的89个S L A -1等位基因序列相比较,获得2个已知等位基因,S L A -1*11:03和S L A -1*15:03,分别存在于韩国地方猪种和中国融水小型猪㊁皖南花猪中㊂此外,发现9个新等位基因,命名为S L A -1*02:04㊁02:05㊁10:03㊁16:05㊁16:06㊁18:03㊁23:05㊁24:01和25:01㊂27头荣昌猪均至少包含1个S L A -1新等位基因,且10头荣昌猪中至少包含3个S L A -1等位基因,编号10的个体中含有4个不同的S L A -1等位基因,表明S L A -1是双拷贝基因㊂在该群体中,对被鉴定出在S L A -1基因座上具有两个以上等位基因的个体进行等位基因之间的两两组合分析,对在不同基因型个体中出现次数超过3次以上的组合确定为同一条染色体上的双拷贝等位基因,在编号分别为1㊁6㊁10㊁18㊁24㊁25的个体中不仅鉴定出S L A -1*23:05㊁S L A -1*11:03等位基因而且还有其他等位基因存在,因此在该群体中S L A -1*23:05与S L A -1*11:03,S L A -1*02:04与S L A -1*18:03之间存在连锁关系㊂连锁的等位基因S L A -1*23:05和S L A -1*11:03以及S L A -1*02:04和S L A -1*18:03分别用双拷贝等位基因A 和B表示,等位基因S L A -1*02:05㊁S L A -1*10:03㊁S L A -1*15:03㊁S L A -1*16:05㊁S L A -1*16:06㊁S L A -1*24:01㊁S L A -1*25:01分别用等位基因C ㊁D ㊁E ㊁F ㊁G ㊁H ㊁I 表示,该群体在S L A -1基因座上共获得11种基因型(表1)㊂群体的等位基因频率显示,频率最高的是等位基因H (S L A -1*24:01),频率为44.23%,其次是双拷贝等位基因A (S L A -1*23:05,S L A -1*11:03)和等位基因E (S L A -1*15:03),频率分别为19.23%㊁17.31%,H (S L A -1*24:01)是该荣昌猪群体中最流行的等位基因(图3)㊂7603畜 牧 兽 医 学 报54卷表1 荣昌猪S L A -1等位基因T a b l e 1 S L A -1a l l e l e o f R o n g c h a n g p i g荣昌猪编号N o .o f R o n g c h a n g性别S e xS L A -1等位基因A l l e l e s o f S L A -1S L A -1基因型1G e n o t y pe s of S L A -11123:05,11:03,24:01A H215:03,24:01E H324:01HH515:03,24:01E H623:05,11:03,15:03A E723:05,11:03,24:01A H823:05,11:03,24:01A H924:01HH 1023:05,11:03,02:04,18:03A B1115:03,24:01E H 1216:05,24:01F H 1324:01HH 1416:05,24:01F H 1515:03,16:06E G1616:05,24:01F H 1710:03,15:03,24:01-1823:05,11:03,02:05A C 1923:05,11:03,15:03A E2015:03,24:01E H 2116:05,24:01F H2310:03,24:01D H2423:05,11:03,25:01A I2523:05,11:03,16:05A F2615:03,24:01E H 2724:01HH 2010315:03,24:01E H2020323:05,11:03,24:01A H1.A~I 所表示的等位基因见表2;-.基因型无法判断1.T h e a l l e l e s r e p r e s e n t e d b y A t o I a r e m a r k e d i n t a b l e 2;-.G e n o t y pe c a n n o t b e d e t e r m i n e d 表2 荣昌猪S L A -1等位基因提交信息T a b l e 2 S u b m i s s i o n i n f o r m a t i o n f o r S L A -1a l l e l e i n R o n g c h a n g p i g 已鉴定等位基因I d e n t i f i e d a l l e l e等位基因A l l e l e G e n B a n k 登录号G e n B a n k a c c e s s i o n n u m b e rS L A -1*23:05,S L A -1*11:03A O N 859881,O P 249499S L A -1*02:04,S L A -1*18:03BO N 859887,O N 859888S L A -1*02:05C O N 859886S L A -1*10:03DO N 859883S L A -1*15:03E O P 249500S L A -1*16:05F O N 859884S L A -1*16:06G O N 859885S L A -1*24:01HO N 859880S L A -1*25:01IO N 85989086037期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A -1等位基因鉴定及分子遗传特征分析图3 S L A -1等位基因及频率分布F i g .3 T h e d i s t r i b u t i o n o f S L A -1a l l e l e s a n d f r e q u e n c y2.3 S L A -1等位基因多态性与二级结构分析11个S L A -1等位基因编码区(c o d i n g se -qu e n c e s ,C D S )D N A 多态性分析显示(图4),碱基变异(b a s e v a r i a t i o n ,S )主要集中在225~325b p 和500~575b p 两个区域,核苷酸多样度(n u c l e o t i d e d i v e r s i t y,P i )的变化趋势与碱基变异数的分布趋势基本保持一致,而且两者的峰值均处于第2和第3外显子区域内,表示该区域是S L A -1基因的高频变异位点区㊂在C D S 区内,整体的P i 为0.0449,单倍型多样度(h a p l o t y p e d i v e r s i t y,H d )为1,平均核苷酸差异数(a v e r a ge n u m b e r of n u c l e o t i d e d i f f e r e n c e s ,K )为48.782,G+C 含量为64.9%,在所编码的361个氨基酸中,产生了75个氨基酸变异位点(a m i n oa c i d v a r i ab l e s i t e s ,A V );在1~1086b p 的核苷酸位点中,涵盖了127个核苷酸多态位点,其中,包含简约信息位点85个,单一多态位点42个,此外,核苷酸多态位点包含18个同义单核苷酸多态性位点和109个非同义单核苷酸多态性位点㊂第2和第3外显子区域的多态性规律与整个C D S 区变异相似(表3)㊂图4 S L A -1等位基因碱基变异位置分布(A )和核苷酸多样度变化趋势(B )F i g .4 T h e d i s t r i b u t i o n o f b a s e v a r i a t i o n p o s i t i o n s (A )a n d n u c l e o t i d e d i v e r s i t y (B )o f S L A -1a l l e l e s e qu e n c e 由于S L A 提呈不同抗原,因此第2和第3外显子编码的α1和α2结构域构成的P B G 多态性较高,对荣昌猪S L A -1编码蛋白的α1和α2结构域的氨基酸序列变异性进行分析,结果显示,有14个氨基酸位点的W u -K a b a t 指数高于6.0,其中,第74个氨基酸指数最高,达到13.8(图5A )㊂第2外显子区域的氨基酸变异程度高于第3外显子,且变异程度最高的位点位于第2外显子区域㊂此外,由于S L A -1*04:01分子所编码的蛋白结构已经解析[22],共存在33个关键氨基酸组成P B G 的A~F 6个口袋,因此将获得的荣昌猪S L A -1的α1和α2结构域氨基酸序列与S L A -1*04:01进行比对分9603畜牧兽医学报54卷表3S L A-1等位基因序列多态性分析T a b l e3P o l y m o r p h i s m a n a l y s i s o f S L A-1a l l e l e s e q u e n c e s序列信息S e q u e n c e i n f o r m a t i o nS L A-1编码区S L A-1C D S r e g i o n第2和第3外显子E x o n2a n d e x o n3比对序列范围/b p A l i g n e d S e q.r e g i o n 1~108665~610核苷酸数N u m b e r o f n u c l e o t i d e 1086546核苷酸保守性位点数量N u m b e r o f n u c l e o t i d e i n v a r i a b l e s i t e s 959444核苷酸多态位点数量N u m b e r o f n u c l e o t i d e v a r i a b l e s i t e s 127102简约信息位点数量N u m b e r o f n u c l e o t i d e p a r s i m o n y i n f o r m a t i o n s i t e s 8565单一多态位点数量N u m b e r o f n u c l e o t i d e s i n g l e t o n v a r i a b l e s i t e s 4237同义单核苷酸多态性数量N u m b e r o f s y n o n y m o u s S N P(S i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o p h i s m)187非同义单核苷酸多态性数量N u m b e r o f n o s y n o n y m o u s S N P 10995氨基酸数量N u m b e r o f a m i n o a c i d s 361182氨基酸变异位点数量N u m b e r o f a m i n o a c i d s v a r i a b l e s i t e s 7561G+C含量G+C c o n t e n t 0.6490.653平均核苷酸差异数量A v e r a g e n u m b e r o f n u c l e o t i d e d i f f e r e n c e s 48.78239.145单倍型多样性H a p l o t y p e d i v e i t y 1.0001.000核苷酸多样性N u c l e o t i d e d i v e r s i t y0.04490.0717析,结果显示,182个氨基酸位点中,121个位点完全保守,而33个关键氨基酸位点中,11个氨基酸位点完全保守,分别为L e u5(L)㊁T y r7(Y)㊁M e t45(M)㊁T y r59(Y)㊁L e u81(L)㊁T y r84(Y)㊁T y r123(Y)㊁L y s146(K)㊁T y r159(Y)㊁L e u160(L)㊁T y r171(Y),其余22个位点均发生高频率突变(图5B)㊂比对H L A-A*02:01㊁H L A-A*11:01与荣昌猪S L A-1等位基因氨基酸序列,结果显示,在与β2-微球蛋白(β2-m i c r o g l o b u l i n,β2m)结合的19个氨基酸位点中,有10个氨基酸在人H L A-A与荣昌猪S L A-1等位基因中保持一致,分别是T y r7(Y)㊁P h e8(F)㊁V a l25(V)㊁T y r27(Y)㊁P h e33(F)㊁P h e36(F)㊁H i s93 (H)㊁L e u110(L)㊁G l y112(G)和G l n115(Q)㊂另外,比较人和荣昌猪C D8分子与MH C结合的7个关键氨基酸位点(223~229)[23],只有225(T/S)和228(T/M)两个位点存在差异,其它位点高度保守(表4)㊂二级结构分析发现,荣昌猪不同S L A-1等位基因显示出S L A-1基因的典型二级结构,α1和α2区主要为α-螺旋和β-折叠,α1区具有1个α-螺旋和4个β-折叠,α2区具有4个α-螺旋和4个β-折叠(图5B)㊂2.4S L A-1等位基因同源性分析荣昌猪不同S L A-1等位基因的核苷酸相似性为93.6%~99.4%,氨基酸相似性为86.5%~ 98.3%,其中,S L A-1*02:04和S L A-1*02:05同源性最高,核苷酸和氨基酸相似性分别为99.4%和98.3%,二者存在7个核苷酸变异和6个氨基酸变异㊂荣昌猪与I P D-MH C数据库中已提交的69个具有C D S全长序列的S L A-1等位基因相似性分析显示,核苷酸序列和氨基酸序列分别为92.6%~07037期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A -1等位基因鉴定及分子遗传特征分析▼.人白细胞抗原(H L A )与β2-微球蛋白(β2m )结合位点,*.S L A -1*04:01等位基因抗原肽结合槽关键位点▼.A m i n o a c i d p o s i t i o n b i n d i n g h u m a n l e u k o c y t e a n t i g e n (H L A )a n d β2-m i c r o g l o b u l i n (β2m ),*.K e y a m i n o a c i d p o s i t i o n o f P B G l o c a t e d i n S L A -1*04:01a l l e l e 图5 荣昌猪S L A -1等位基因第2和第3外显子区域氨基酸变异性(A )和氨基酸序列比对(B )F i g .5 T h e a m i n o a c i d v a r i a b i l i t y (A )a n d c o m p a r i s o n (B )o f e x o n 2a n d e x o n 3o f S L A -1a l l e l e s i n R o n g c h a n g p i g99.9%和85.9%~99.4%㊂荣昌猪S L A -1等位基因和人群中流行的H L A -A *02:01和H L A -A *11:01等位基因的核苷酸相似性为83.3%~86.8%,氨基酸相似性为70.3%~76.9%,其中,与H L A -A *02:01相似性最高的等位基因是S L A -1*10:03(核苷酸85.0%,氨基酸74.4%),与H L A -A *11:01相似性较高的等位基因是S L A -1*18:03(核苷酸86.8%,氨基酸76.9%)(表5)㊂2.5 S L A -1等位基因系统进化树分析从I P D -MH C 数据库中选取与荣昌猪S L A -1等位基因核苷酸相似性较高(93.3%~99.9%)的31个具有C D S 全长的S L A -1等位基因,与荣昌猪获得的11个S L A -1等位基因序列比对,以人群中H L A -A 频率最高的H L A -A *02:01和H L A -A*11:01等位基因为外群对照,利用邻接法构建系统进化树(图6)㊂结果显示,荣昌猪中9个新等位基因分布在不同聚类分支中,根据系统进化树,I S A GS L A 命名委员会对其进行了命名㊂S L A -1*02:04和S L A -1*02:05聚在02等位基因组分支中,S L A -1*02:05与S L A -1*02:02具有3个核苷酸差异,S L A -1*02:04与S L A -1*02:01具有4个核苷酸差异,与多种猪品种和猪细胞系亲缘关系较近,如:1703畜牧兽医学报54卷表4人和荣昌猪C D8分子与M H C结合的关键氨基酸氨基酸位点比较T a b l e4C o m p a r i s o n o f k e y a m i n o a c i d p o s i t i o n o f h u m a n a n d R o n g c h a n g p i g C D8m o l e c u l e s c o m b i n e w i t h M H C等位基因A l l e l e氨基酸位置A m i n o a c i d p o s i t i o n 223224225226227228229H L A-A*02:01A s p(D)G l n(Q)T h r(T)G l n(Q)A s p(D)T h r(T)G l u(E) H L A-A*11:01ӘӘӘӘӘӘӘS L A-1*02:04ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*02:05ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*10:03ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*11:03ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*15:03ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*16:05ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*16:06ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*18:03ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*23:05ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*24:01ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘS L A-1*25:01ӘӘS e r(S)ӘӘM e t(M)ӘӘ.与H L A-A*02ʒ01相同的氨基酸Ә.S a m e a m i n o a c i d w i t h H L A-A*02:01表5荣昌猪S L A-1和I P D-M H C数据库中提交的S L A-1以及人H L A-A流行等位基因的相似性比较T a b l e5C o m p a r i s o n o f n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d h o m o l o g y a m o n g S L A-1a l l e l e s o f R o n g c h a n g p i g,S L A-1a l l e l e s s u b m i t t e d i nI P D-M H C d a t a b a s e a n d f r e q u e n t h u m a n H L A-A a l l e l e s%同源性H o m o l o g y荣昌猪S L A-1等位基因S L A-1a l l e l e s o fR o n g c h a n g p i gI P D-MH C数据库S L A-1等位基因S L A-1a l l e l e s o fI P D-MH C d a t a b a s eH L A-A*02:01等位基因H L A-A*02:01a l l e l eH L A-A*11:01等位基因H L A-A*11:01a l l e l e核苷酸相似性N u c l e o t i d e h o m o l o g y 93.6~99.492.6~99.983.3~85.085.1~86.8氨基酸相似性A m i n o a c i d h o m o l o g y86.5~98.385.9~99.770.3~74.472.8~76.9辛克莱小型猪㊁N I H小型猪和小型猪肾细胞系等㊂S L A-1*10:03等位基因与汉福德㊁大花白以及融水小型猪中获得的S L A-1*10:01等位基因聚于同一分支,与S L A-1*10:01具有5个核苷酸差异㊂S L A-1*16:05和S L A-1*16:06遗传距离较近,与S L A-1*16:03聚为一支,属于16等位基因组,特别是S L A-1*16:05与S L A-1*16:03仅有一个核苷酸差异,两个等位基因均与亚洲野猪的亲缘关系较高㊂S L A-1*18:03与S L A-1*18:01聚于同一分支㊂S L A-1*23:05独立聚为一支,表明有特定的肽结合基序,而且与S L A-1*11:10和S L A-1*23:01聚为一大类分支,表明与巴马小型猪亲缘关系较近㊂S L A-1*24:01与亚洲野猪㊁巴马小型猪中获得的S L A-1*19:01聚于一大支,表明荣昌猪和其亲缘关系较近㊂S L A-1*25:01独立分为一支,表明也具有独特的肽结合基序㊂此外,已知的S L A-1*11:03和S L A-1*15:03等位基因在韩国地方猪㊁中国融水小型猪和皖南花猪也存在,表明这些品种猪可能有相同血缘关系的祖先㊂3讨论实验猪在畜牧兽医生产实践中发挥重要作用,被广泛用于研究病原致病机制㊁T细胞表位识别和疫苗评估等,在这些研究中S L A对抗原的识别具有严格的MH C限制性,从而引起个体差异[24-27]㊂因此鉴定S L A基因可减少实验动物遗传背景差异对各项研究结果的影响㊂经典的S L A I类基因S L A-1编码的I类分子主要参与内源性抗原递呈,识别27037期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A -1等位基因鉴定及分子遗传特征分析һ.荣昌猪S L A -1等位基因һ.S L A -1a l l e l e s o f R o n g c h a n g p i g 图6 荣昌猪S L A -1等位基因系统发育树F i g .6 P h y l o g e n e t i c t r e e o f S L A -1a l l e l e f r o m R o n g c h a n g p i g3703畜牧兽医学报54卷抗原并诱导细胞免疫应答㊂S L A-1基因具有高度多态性,目前I P D-MH C数据库共收录了89个S L A-1等位基因(R e l e a s e3.9.0.107/2022b u i l d209),存在于不同的猪品种或猪细胞系㊂荣昌猪是我国优良的地方猪品种,已作为实验动物在动物医学模型㊁药物评价模型和异种器官供体等研究中广泛应用,但目前尚未对荣昌猪的S L A-1基因进行系统鉴定,本研究在荣昌猪S L A-1基因座上共获得11个等位基因,其中,9个为新等位基因,2个为已知等位基因,在现有群体数量有限的情况下S L A-1基因座表现出较高的多态性㊂荣昌猪S L A-1基因也发现了双拷贝现象㊂在之前的研究中,有学者发现S L A-1基因座双拷贝现象在韩国本地猪㊁S N U小型猪㊁N I H小型猪㊁巴克夏猪㊁约克夏猪㊁杜洛克猪㊁长白猪㊁梅山猪和巴马小型猪等众多猪品种中均存在,且部分双拷贝现象在某些S L A单倍型中持续存在[28-31]㊂一般认为,基因多样性或杂合度的增加有利于机体抵御不良环境,但无论是不同S L A基因座的等位基因杂合还是S L A-1基因座双拷贝杂合,在病原体和S L A等位基因之间的关系都是较为复杂的㊂首先,在同一个S L A基因座存在多个等位基因可能会增加其对不同抗原的结合能力,从而提高生存概率;其次,如果在群体中不存在对特定病原敏感的特定等位基因,即便杂合度很高,该种群对于病原的抵抗力依然较弱,而存在特定等位基因的纯合子群体却能够获得高的抵抗力,这可以从杂合子优势假说以及稀有等位基因优势假说得到解释[32-33]㊂S L A-1基因的第2和第3外显子所编码的抗原肽结合槽相较于其它区域具有非常高的多态性,这种现象在不同猪品种中都存在[34-36]㊂本研究对荣昌猪S L A-1等位基因的D N A多态性进行了分析,从核苷酸多态性位点数量占比和非同义核苷酸多态性位点数量的比例发现,第2和第3外显子区域都表现出绝对的优势㊂氨基酸变异位点数量以及氨基酸变异系数和位置与核苷酸多态性具有相似性,同样证明S L A-1基因的高度多态区域集中于第2和第3外显子㊂S L A I类分子主要通过递呈病原的抗原肽给C D8+T淋巴细胞识别[37],继而诱导细胞杀伤效应清除感染性细胞㊂抗原肽是通过结合S L A I类分子P B G中的6个口袋(A~F),然后与β2m形成复合物递呈在细胞表面供T细胞识别[38-39]㊂因此不同等位基因和递呈抗原肽的差异会对P B G的立体结构造成影响,利用已解析的S L A-1*04:01的三维结构,对荣昌猪S L A-1等位基因6个口袋的关键氨基酸进行比对,发现有较高的差异性,提示获得的等位基因可能展现出与S L A-1*04:01不同的三维结构㊂猪已被选定是最佳的异种移植供体,但猪-人异种器官/细胞移植主要障碍是人体对植入外源器官的免疫反应,其中S L A是与同种和异种免疫识别密切相关的一个重要分子标记基因,能被各种人类免疫细胞亚群直接识别[40]㊂因此异种移植成功与否的前提在于猪S L A与人H L A之间的适配性所导致的急性或慢性免疫排斥反应能否得到解决㊂比较荣昌猪S L A-1与β2m结合以及人和荣昌猪C D8分子与MH C结合的关键氨基酸位点,发现氨基酸位点保守性较高㊂将获得的S L A-1等位基因与人群体中频率较高的等位基因进行同源性分析,显示S L A-1*10:03和S L A-1*18:03相似性最高,预示着携带这两个等位基因的猪可能和人之间存在较高的适配性㊂目前,I P D-MH C数据库已收录了世界各类猪种以及猪细胞系的S L A-1等位基因,选取与荣昌猪相似性较高的S L A-1等位基因建立了系统进化树,发现荣昌猪种群中获得的S L A-1*15:03和S L A-1*11:03也分别存在于中国融水小型猪㊁皖南花猪以及韩国本地猪中,这些猪种起初都源自亚洲㊂获得的新S L A-1等位基因少部分与各类猪源细胞系亲缘性较高,大多数均与亚洲猪种亲缘性较高,因此可推测荣昌猪可能和这些猪种存在血缘相同的祖先㊂本研究获得的荣昌猪S L A-1等位基因遗传信息仅针对于饲养于屏障设施中这个小型封闭群,并不能代表全国整个荣昌猪品种的群体遗传信息,但是对标准化实验荣昌猪的培育和推广应用必不可少㊂此外在荣昌猪上获得的S L A-1基因也可用于深入研究病原的抗原递呈机制,筛选猪重要病原的S L A限制性T细胞表位,对开发安全有效的表位肽疫苗意义重大㊂4结论本研究通过对荣昌猪S L A-1基因C D S区域进行P C R扩增测序,成功获得了11个S L A-1等位基因,其中,9个为新发现等位基因,S L A-1*24:01是47037期刘弘毅等:实验用荣昌猪S L A-1等位基因鉴定及分子遗传特征分析该荣昌猪群体中最流行的等位基因㊂S L A-1基因多态性主要集中在第2和第3外显子区域,P B G中的33个关键氨基酸位点有11个位点完全保守;与β2m结合的19个关键氨基酸位点有10个位点在人与荣昌猪之间保持一致,C D8分子与MH C结合的关键氨基酸位点高度保守,只有225(T h r/S e r)和228(T h r/M e t)位点不同㊂同源性以及系统进化树表明,S L A-1*10:03和S L A-1*18:03分别与人H L A-A*02:01和H L A-A*11:01等位基因的同源性最高,荣昌猪与亚洲野猪㊁巴马小型猪和融水小型猪等亚洲猪种具有较近的亲缘关系㊂本研究结果为荣昌猪S L A遗传背景的研究以及抗原递呈过程中S L A与不同抗原肽的相互作用关系奠定基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]马丽颖,岳秉飞.主要组织相容性复合体(MH C)研究进展[J].中国比较医学杂志,2005,15(3):182-185.MA L Y,Y U E B F.A d v a n c e s i n r e s e a r c h o n m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x[J].C h i n e s e J o u r n a l o fC o m p a r a t i v e M e d i c i n e,2005,15(3):182-185.(i nC h i n e s e)[2]刘子展.贵州小型猪S L A经典Ⅰ类和Ⅱ类基因克隆和生物信息学分析及P C R-S S P分型方法的建立[D].合肥:安徽农业大学,2012.L I U Z Z.C l o n i n g a n d b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o fs w i n e l e u k o c y t e a n t i g e n s c l a s s I a n d c l a s s I I g e n e s i nG u i z h o u m i n i p i g s a n d e s t a b l i s h m e n t o f P C R-S S Pt y p i n g m e t h o d[D].H e f e i:A n h u i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,2012.(i n C h i n e s e)[3] Y AMA G U C H I T,D I J K S T R A J M.M a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x(MH C)g e n e s a n d d i s e a s er e s i s t a n c e i n f i s h[J].C e l l s,2019,8(4):378. [4] C A R R I N G T O N M,B O N T R O P R E.E f f e c t s o fMH C c l a s s I o n H I V/S I V d i s e a s e i n p r i m a t e s[J].A I D S,2002,16:S105-S114.[5] R O C K K L,R E I T S E,N E E F J E S J.P r e s e n tY o u r s e l f!B y MH C c l a s s I a n d MH C c l a s s I Im o l e c u l e s[J].T r e n d s I mm u n o l,2016,37(11):724-737.[6] S E E T H A R A M A,T I R I V E E D H I V,M O H A N A K U M A RT.A l l o i mm u n i t y a n d a u t o i mm u n i t y i n c h r o n i cr e j e c t i o n[J].C u r r O p i n O r g a n T r a n s p l a n t,2010,15(4):531-536.[7] A F Z A L I B,L OM B A R D I G,L E C H L E R R I.P a t h w a y s o f m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e xa l l o r e c o g n i t i o n[J].C u r r O p i n O r g a n T r a n s p l a n t,2008,13(4):438-444.[8] W E I S S R A.X e n o t r a n s p l a n t a t i o n[J].B M J,1998,317(7163):931-934.[9] C O O P E R D K C,G A S T O N R,E C K HO F F D,e t a l.X e n o t r a n s p l a n t a t i o n-t h e c u r r e n t s t a t u s a n d p r o s p e c t s[J].B r M e d B u l l,2018,125(1):5-14.[10] C E L I S-G I R A L D O C T,B OHÓR Q U E Z M D,C AMA R G O M,e t a l.A c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o fS L A-D R B1g e n e t i c d i v e r s i t y i n C o l o m b i a n(c r e o l e sa n d c o mm e r c i a l l i n e)a n d w o r l d w i d e s w i n ep o p u l a t i o n s[J].S c i R e p,2021,11(1):4340. [11]权金强,江新杰,李昌文,等.实验用S P F大白猪和长白猪S L A-1基因特征分析[J].农业生物技术学报,2017,25(5):770-780.Q U A N J Q,J I A N G X J,L I C W,e t a l.C h a r a c t e r i z a t i o n a n a l y s i s o f S L A-1g e n e f r o m S P Fy o r k s h i r e(S u s s c r o f a)a n d l a n d r a c e[J].J o u r n a l o fA g r i c u l t u r a lB i o t e c h n o l o g y,2017,25(5):770-780.(i n C h i n e s e)[12] HAMM E R S E,HO C S,A N D O A,e t a l.I m p o r t a n c e o f t h e m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x(S w i n e l e u k o c y t e a n t i g e n)i n s w i n e h e a l t h a n db i o m e d ic a l r e s e a r c h[J].A n n u R e v A n i m B i o s c i,2020,8:171-198.[13] G A O C X,H E X W,Q U A N J Q,e t a l.S p e c i f i c i t yc h a r a c t e r i z a t i o n o f S L A c l a s s I m o l e c u l e s b i nd i n g t os w i n e-o r i g i n v i r a l c y t o t o x i c T l y m p h o c y t e e p i t o p ep e p t i d e s i n v i t r o[J].F r o n t M i c r o b i o l,2017,8:2524.[14] L U N N E Y J K.A d v a n c e s i n s w i n e b i o m e d i c a l m o d e lg e n o m i c s[J].I n t J B i o l S c i,2007,3(3):179-184.[15] S W I N D L E M M,MA K I N A,H E R R O N A J,e t a l.S w i n e a s m o d e l s i n b i o m e d i c a l r e s e a r c h a n dt o x i c o l o g y t e s t i n g[J].V e t P a t h o l,2012,49(2):344-356.[16] G E I S L E R K,KÜN Z E L J,G R U N D T N E R P,e t a l.T h e p e r f u s e d s w i n e u t e r u s m o d e l:l o n g-t e r m p e r f u s i o n[J].R e p r o d B i o l E n d o c r i n o l,2012,10:110.[17] R AM I R E Z-M E D I N A E,V U O N O E,R A I A,e t a l.D e l e t i o n o f E184L,a p u t a t i v e D I V A t a r g e t f r o m t h ep a n d e m i c s t r a i n o f a f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,p r o d u c e sa r e d u c t i o n i n v i r u l e n c e a n d p r o t e c t i o n a g a i n s t v i r u l e n tc h a l l e n g e[J].J V i r o l,2022,96(1):e0141921.[18] C H E N W,Y I H J,Z HA N G L,e t a l.E s t a b l i s h i n gt h e s t a n d a r d m e t h o d o f c o c h l e a r i m p l a n t i nR o n g c h a n g p i g[J].A c t a O t o-L a r y n g o l,2017,1375703。
沙子岭猪与巴沙猪肉质特性的比较研究
沙子岭猪与巴沙猪肉质特性的比较研究张兴1吴买生2*向拥军1左晓红2戴求仲3陈斌4贺长青4刘伟1张善文1刘传芳2罗强华2渊1湖南省湘潭市家畜育种站，湖南湘潭411104; 2湖南省湘潭市畜牧兽医水产局，湖南湘潭411104;3湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131; 4湖南农业大学，湖南长沙410128)摘要：为比较沙子岭猪与巴沙猪的肉质特性，选择体重34 k g左右的沙子岭猪、巴沙猪24头，按品种（组合）分成2组，每组2个重复，每重复6头猪，公母比例一致，2个处理饲喂相同的基础日粮，试验期104天。
肥育试验结束后每组 随机抽取3头（1公2母）进行屠宰测定和肉质分析。
结果表明：巴沙猪的肉色黄度（bp)、肉色亮度（L24*)分别较沙子 岭猪降低了 17.48% (P〈0.01)和8.64% (P〈0.05);巴沙猪背最长肌中油酸含量较沙子岭猪提高4.82% (P〈0.05)，而微量元素K含量提高7.89% (P〈0.01)、Z n含量降低17.65% (P〈0.05)。
巴沙猪与沙子岭猪在肌肉pH值、L1*、a1*、a24*、b24*、熟肉率、贮存损失、失水率及肌肉中干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、氨基酸、脂肪酸、微量元素含量等多项 指标上无显著差异。
综合分析，湘沙猪配套系父母代巴沙猪与沙子岭猪的肌肉品质相似，不仅保留了亲本沙子岭猪肌肉中风 味氨基酸、必需氨基酸、不饱和脂肪酸含量高等特点，而且提高了油酸和微量元素K的含量。
关键词：沙子岭猪；巴沙猪；肌肉品质；氨基酸；脂肪酸中图分类号：S828.2 文献标识码：B文章编号院1673-4645 (2016 )12-0063-05沙子岭猪是我国华中两头乌猪的主要类群之一，也 是湖南省著名的肉脂兼用型地方品种，是养猪生产中的 珍稀遗传资源，具有抗逆性强、耐粗饲、繁殖力强、肉质优良、肉味鲜嫩等优点[1,2]。
巴克夏猪是英国古老的培 育猪种之一，肉脂兼用性猪品种，迄今已有300余年的 历史和200多年的纯繁记录，属英国皇家畜种精品，现 已培育成优质瘦肉型猪种。
五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因SNP检测及生物信息学分析
五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因SNP检测及生物信息学分析晁哲;李娇伦;秦烨;王峰;郑心力【期刊名称】《养猪》【年(卷),期】2017(0)6【摘要】为研究五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因,获得基因序列并分析基因结构和相关遗传变异,试验采用PCR扩增猪SLA-DQA和SLA-DQB基因组序列,通过DNA测序寻找基因中的SNP位点.结果显示:在猪SLA-DQA基因组中共发现6处突变位点,分别位于该基因的启动子区、第1内含子、第2内含子、第3内含子和第5外显子中;在猪SLA-DQB基因组中共发现4处突变位点,分别位于该基因第1外显子和第5外显子中.本研究成功获得五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因序列信息,为下一步五指山猪SLA-DQA和SLA-DQB基因的功能研究奠定基础.【总页数】4页(P57-60)【作者】晁哲;李娇伦;秦烨;王峰;郑心力【作者单位】海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南海口 571100;海南省家畜家禽工程技术研究中心,海南海口 571100;海南大学热带农林学院,海南海口 570228;海南大学热带农林学院,海南海口 570228;海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南海口 571100;海南省家畜家禽工程技术研究中心,海南海口 571100;海南省农业科学院畜牧兽医研究所,海南海口 571100;海南省家畜家禽工程技术研究中心,海南海口 571100【正文语种】中文【中图分类】S828.8【相关文献】1.海南五指山猪SLA-DQA基因cDNA全长的克隆分析 [J], 郑心力;王峰;魏立民;孙瑞萍;张燕2.海南五指山猪FUT2基因SNP检测及生物信息学分析 [J], 晁哲;孙瑞萍;刘海隆;黄丽丽;郑心力;王峰3.五指山猪FUT1基因SNP检测及生物信息学分析 [J], 晁哲;王峰;黄丽丽;刘海隆;孙瑞萍;郑心力4.海南五指山猪SLA-DQA基因cDNA全长的克隆分析 [J], 郑心力;王峰;魏立民;孙瑞萍;张燕5.五指山猪GH、IGFBP3基因SNPs检测及与生长性状的关联分析 [J], 侯冠彧;曾鸿普;周汉林;王东劲;管松;马月辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪配套系育种及湘沙猪配套系选育工作体会
收稿日期：2017-10-02基金项目：湖南省农业委员会现代生猪产业技术体系建设项目(2015—2019），湖南省科技厅重点研发计划“优质湘沙猪配套系选育研究”（2016NK2037）作者简介：吴买生（1962-），男，湖南涟源人，研究员，主要从事猪的遗传育种研究工作，E-mail：wms621220@猪配套系育种及湘沙猪配套系选育工作体会吴买生(湖南省湘潭市畜牧兽医水产局,湖南湘潭411104)摘要:本文阐述了有关猪配套系育种的概念、关键技术环节、育种目标的科学制定及专门化品系选育的主要方法;介绍了湘沙猪配套系选育背景、主要育种技术措施及选育工作进展;提出了培育含地方猪种血统的优质猪配套系,有利于建立我国地方猪种繁育利用体系、有利于促进地方猪种市场开发、有利于地方猪种资源的科学保护、有利于利用国外种猪的高性能加快育种进程、有利于提升地方猪种的种质研究水平。
关键词:猪配套系;湘沙猪配套系;育种中图分类号:S828.8+9文献标识码:A文章编号:1673-4645(2017)11-0074-04良种对于生产的贡献率超过40%，生物的种质创新是最重要的原始创新之一。
猪的育种就是利用现有猪种资源，采用先进的育种方法，改进和创新猪的遗传素质，生产出符合市场需求的量多质优的猪肉产品。
众所周知，杂交可以利用基因之间的上位效应和互作效应产生杂种优势，利用杂种优势能提高畜禽生产性能和经济效益。
受玉米双杂交可大幅提高产量的启示，动物育种专家利用配套杂交方式率先在鸡配套系育种方面取得成功。
20世纪60年代以来，美国开始探索品种间杂交培育猪配套系方法，并成功培育出迪卡猪配套系，继美国之后英国培育出了PIC 猪配套系。
目前，欧美已有不少种猪公司培育并出售配套系猪。
我国从20世纪70年代开始进行猪配套系育种工作，近20年来，通过国家审定的猪配套系有12个，通过地方培育和省级验收的猪配套系有4个。
实践已经证明，培育生产配套系猪能获得最佳生产性能和经济效益。
沙子岭猪与巴沙猪育肥性能与胴体品质的比较研究
130猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2016年33卷第10期沙子岭猪与巴沙猪育肥性能与胴体品质的比较研究张 兴1，吴买生2，向拥军1，戴求仲3，陈 斌4，左晓红2，贺长青4， 刘 伟1，罗强华2，张善文1（1. 湘潭市家畜育种站，湖南 湘潭 411104；2.湘潭市畜牧兽医水产局，湖南 湘潭 411104；3.湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131；4.湖南农业大学动物科技学院，长沙 410128）沙子岭猪是我国华中两头乌猪的主要类群之一，也是湖南省著名的肉脂兼用型地方品种，具有抗逆性强、耐粗饲、繁殖力高、肉质优良、肉味鲜香等优点[1-2]。
巴克夏猪是英国引进中国猪、暹罗猪与当地猪杂交育成的肉脂兼用型猪品种，迄今已有300余年的历史和200多年的纯繁记录，属英国皇家畜种精品，现改育为瘦肉型猪种。
巴克夏猪全身被毛黑色，六白特征明显，性成熟较早，繁殖性能稳定，生长较快，肉质优良。
我国利用巴克夏猪培育了哈白猪、吉林黑猪、新疆黑猪等多个品种[3]。
随着人们生活水平提高，高瘦肉率的杜长大洋三元杂交商品猪已越来越满足不了人们对猪肉品质的要求。
2008年以来，我们进行了多批次杂交组合筛选试验，最后确定以沙子岭猪为母本，巴克夏猪为母系父本，大约克猪为终端父本，进行湘沙猪配套系选育，生产优质猪。
本研究通过对湘沙猪配套系父母代巴沙猪与亲本沙子岭猪的肥育性能和胴体品质的比较研究，为湘沙猪配套系父母代巴沙猪培育提供基础数据，同时也为沙子岭猪的种基金项目：湘潭市科技局 “湘沙优质瘦肉猪配套系选育与规模化健康养殖技术研究与示范”（ZD20101001)；湖南省现代生猪产业技术体系建设项目（2010-2014）作者简介：张兴（1987-），男，硕士，主要从事猪的营养与饲养管理工作通讯作者：吴买生（1962-），男，研究员，主要从事猪的遗传育种工作。
E-mail:*********************质创新与优质猪肉生产提供科学依据。
沙子岭猪保种及开发的辉煌之路--访湖南省湘潭市畜牧兽医水产局总畜牧师吴买生
沙子岭猪保种及开发的辉煌之路--访湖南省湘潭市畜牧兽医水
产局总畜牧师吴买生
王亚辉
【期刊名称】《中国猪业》
【年(卷),期】2014(9)9
【摘要】沙子岭猪原产于湘潭城郊沙子岭一带,是湖南分布最广、数量最多的优良地方猪种之一,是华中两头乌猪的主要类群。
2006年,沙子岭猪被列入《国家级畜禽遗传资源保护品种名录》。
据湘潭九华出土、现存国家博物馆的商代青铜猪樽考证,该猪种在湘潭已有四千多年的饲养历史。
沙子岭猪具有产仔多（经产12.5头/胎）、肉质佳、杂交效果好、耐粗饲、抗病力强等优良特性。
【总页数】4页(P22-25)
【作者】王亚辉
【作者单位】
【正文语种】中文
【相关文献】
1.以开发促保种开启产业发展之路-宁乡猪保护区品种保护与综合开发情况汇报[J], ;
2.以开发促保种开启产业发展之路——宁乡猪保护区品种保护与综合开发情况汇报[J], 湖南省宁乡县畜牧兽医水产局
3.非洲猪瘟背景下沙子岭猪保种与对策建议 [J], 吴买生
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湖南地方猪品种资料
湘村黑猪湘村黑猪官网产品质量标准1）肉色评分达标准值3；2）大理石纹评分达标准值3；3）肌内脂肪高达3.79%；4）PH值稳定在6.42左右；5）瘦肉率达到58.76%湘村黑猪肉质感官特性“肉色红亮、肉质柔韧、浓香诱人、滑嫩多汁，原生态自然香醇的口感”湘村黑猪的来源及特征湘村黑猪是以湖南地方品种桃源黑猪为母本、引进品种杜洛克猪为父本经杂交合成和继代选育而培育的新品种，2011年培育至第6世代，遗传性能稳定，品种特征明显，具有母性好、繁殖力较高、瘦肉率适中、肉质好、适应性强等特性，2012年7月通过国家畜禽遗传资源委员会的审定。
是我省第一个通过国家品种审定的具有自主知识产权的畜禽新品种。
湘村黑猪，原名湖南黑猪，是以湖南地方品种桃源黑猪为母木、引进品种杜洛克猪为父木经杂交合成和继代选育而培育的猪新品种。
被毛黑色(允许肢、鼻和尾端有少许杂毛)，体质紧凑结实。
背腰平直，胸宽深，腿臀较丰满。
头大小适中，而微凹，耳中等稍竖立前倾。
四肢粗壮，蹄质结实。
乳头细长，排列匀称，有效乳头12枚以上。
成年公猪体重180-220 kg、体长130-170cm；成年母猪体重160-180 kg、体长125-155 cm。
湘村黑猪的肉质特性有研究结果表明，湘村黑猪表现了较好的肉质特性，肉色、大理石纹、干湿度评分均在3左右浮动，没有出现PSE和DFD肉，指标均为良好。
湘村黑猪肌内脂肪含量在3.49%~4.41%之间，均值为4.2%，能充分保证猪肉的较佳口感和食用品质；其滴水损失1.89%，失水率14.9%，剪切力3.29 kg，说明湘村黑猪肌肉保水力较高、肌肉较鲜嫩。
氨基酸数量、种类和比例是评价猪肉中蛋白质及猪肉品质的重要指标，近年来，风味氨基酸也逐渐受到了关注，猪肉的“鲜美’滋味一定程度上取决于它们含量的高低。
有研究表明：湘村黑猪的风味氨基酸含量均较丰富，为191.24 mg/g，占总氨基酸含量比例高达81.3%。
大量研究表明，肌肉脂肪酸的组成与肉质存在着很大的相关性，猪品种的不同，肌肉脂肪酸的组成也不同。
甘肃合作猪白细胞抗原经典Ⅱ类分子DR基因克隆及生物信息学分析
莫斯科1，2，房永祥1 ，冯海燕1 ，景志忠1* (1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室
甘肃省动物寄生虫病重点实验室，兰州 730046；2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070)
随着同种异体移植的广泛研究，人类器官移
植物来源日趋紧张，猪作为重要的替代模型，是异 种移植物的最佳来源[1]。其中对猪白细胞抗原
(Swine leukocyte antigen，SLA)的研究十分关键，
因为导致猪-人异种器官移植急性细胞性排斥的主 要因素是SLA[2]。SLA Ⅰ类分子是引起急性及慢
M olecular Cloning and Bioinformatics Analysis of Swine leukocyte Antigen ClassⅡ DR Genes in Gansu Hezuo Pigs
MO Si-ke1，2，FANG Yong-xiang1，FENG H ai-yan1，JING Zhi-zhong1* (1.Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province，Key Laboratory of Veterinary Public
性移植排斥反应的关键分子，Ⅱ类分子则主要分 布在免疫细胞上，参与移植后耐受的形成[3]。而 在T 淋巴细胞中，表达SLA-DR 要比D Q 多，在 CD8+ T 淋巴细胞中Ⅱ类抗原还优先表达[4-5]。因 此，SLA-DR 基因对于兽医学及医学都是一个重要 的研究热点。
合作猪又称蕨麻猪[6]，是中国特有的体型较小 的一种地方猪种，主要分布于甘肃甘南藏族自治 州等高海拔、高寒地区。由于其在解剖学、生理学 和疾病发生与免疫机理方面与人相似，在生命科 学领域中具有重要的试验应用价值，在人类的疾 病、药物安全性等方面具有独特的优势，其种群比 较纯，受其它猪种血缘影响较少，为我国提供了独 有的基因库资源，因此合作猪是医学、兽医学研究 的一种理想的动物模型，是一种珍贵的小型猪种 质资源[7]。选取我国特有的高原猪种——合作猪 为研究对象，从异种排斥反应的角度分析它们的 结构特点及其意义，并进行了多态性分析和同源 性比较，进一步探讨和研究猪M H C 基因的多态性 与生物学特性，为合理保护、开发和利用这一珍贵 的种质资源奠定基础。
猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究
猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究赵诗瑜;张帆;周晓龙;汪涵;赵阿勇;杨松柏【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)012【摘要】本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况.根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列(登录号:XM 001927795.6)设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况.结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965 bp,可编码654个氨基酸.生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3 ku,等电点(pI)为5.06,半衰期为30 h,其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白.脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域:HSP70结构域.蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06％、20.49％、8.10％和31.35％.同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人(登录号:NM005347.4)、小鼠(登录号:NM_001163434.1)、大鼠(登录号:NM_013083.2)、山羊(登录号:XM_005687138.3)、牛(登录号:NM_001075148.1)核苷酸序列的同源性分别为93％、91％、90％、95％、95％,氨基酸序列的同源性分别为99％、98％、98％、99％、99％,各个物种之间GRP78基因保守性较高.实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达.本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料.【总页数】10页(P3317-3326)【作者】赵诗瑜;张帆;周晓龙;汪涵;赵阿勇;杨松柏【作者单位】浙江农林大学动物科技学院,临安311300;浙江农林大学动物科技学院,临安311300;浙江农林大学动物科技学院,临安311300;浙江农林大学动物科技学院,临安311300;浙江农林大学动物科技学院,临安311300;浙江农林大学动物科技学院,临安311300【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建 [J],吴正常;戴超辉;殷学梅;孙寿永;包文斌;吴圣龙2.猪DNM2基因克隆、序列分析与组织表达谱研究 [J], 裴悦;周晓龙;杨松柏;赵阿勇3.沙子岭猪ASB17基因克隆、生物信息学分析及组织差异表达研究 [J], 董莲花;冉茂良;翁波;李智;彭馥芝;陈斌4.猪Nrf2基因克隆、生物信息学分析及启动子区转录活性分析 [J], 刘宗立;陈涛;杨丹丹;崔景香;李川皓;曾勇庆;陈伟5.金华猪PPARGC1A基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究 [J], 刘玉芳; 郭思武; 张清阳; 张鑫; 杨俊琦; 白莹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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HEREDITAS (Beijing)2007年12月, 29(12): 1491―1496 ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2007−05−16; 修回日期: 2007−08−18基金项目: 国家自然科学基金资助项目(编号：39770233)[Supported by Grants from the National Natural Science Foundation of China(No. 3977 0233)]作者简介: 唐医亚(1981−), 女, 湖南永州人, 硕士研究生, 专业方向：细胞移植与基因治疗。
E-mail: tyy_001@ 通讯作者: 王维(1961−), 男, 湖南人, 教授, 研究方向：胰岛细胞移植。
E-mail: wawe01cn@DOI: 10.1360/yc-007-1491湖南沙子岭猪SLA −DR 基因克隆及生物信息学分析唐医亚1, 邢晓为1, 薛立群2, 黄生强2, 王维11. 中南大学湘雅三医院细胞移植与基因治疗中心, 长沙 410013;2. 湖南农业大学动物科学技术学院, 长沙 410128摘要: 为了克隆湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 基因, 分析SLA 基因特性和抗原多态性, 评价湖南沙子岭猪在异种移植中的应用前景奠定基础。
应用RT-PCR 分别扩增湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 基因, 鉴定后克隆到PUCm-T 载体并进行测序, 用NCBI 中的BLAST 和ExPASY 中相关软件进行生物信息学分析。
得到的湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 基因特异性基因片段, 大小分别为1 177 bp 和909 bp 。
生物信息学分析发现, 所扩增的SLA-DRA 和SLA-DRB 基因片段均包含完整的开放阅读框, 分别编码252和266个氨基酸残基。
将湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 基因在GenBank 登录, 登录号分别为EF143987和EF143988。
同源性分析发现, 湖南沙子岭猪SLA-DRA 和SLA-DRB 与人类相应的DRA 、DRB 相比, 核苷酸序列同源性分别为83% 和83 %, 编码氨基酸同源性分别为83% 和79%。
与GenBank 登录的其他猪种相比, SLA-DRA 基因同源性最高可达100 %, 而SLA-DRB 基因具有多态性。
关键词: 猪白细胞抗原; 沙子岭猪; 基因克隆; 异种移植Cloning and bioinformatics analysis of SLA −DR genes in Hunan Shaziling pigsTANG Yi-Ya 1, XING Xiao-Wei 1, XUE Li-Qun 2, HUANG Sheng-Qiang 2, WANG Wei 11. Cell Transplantation & Gene Therapy Center , The third Xiangya Hospital of Central South University , Changsha 410013, China ;2. Department of Animal Science and Technology , Hunan Agricultural University , Changsha 410128, ChinaAbstract : In order to clone class II DRA and DRB genes of swine leukocyte antigen (SLA ) in Hunan Shaziling pigs, toanalyze their characteristics and polymorphism and to provide immunological basic parameters for xenotransplantation from pigs to humans. SLA-DRA and SLA-DRB genes in two Shaziling pigs with the absence of porcine endogenous retrovi-rus (PERV) env-c were amplified by RT-PCR, cloned into PUCm-T vectors, sequenced and analyzed through BLAST in NCBI and related software in ExPASY . The obtained SLA-DRA and SLA-DRB genes of Shaziling pigs were 1 177 and 909 nucleotides in length with their accession numbers in Genbank as EF143987 and EF143988. Bioinformatics analyses have shown that they both contain opening reading frame (ORF) and encode 252 and 266 amino acids respectively. Comparing the ORF and protein sequences of the Shaziling SLA-DRA and SLA-DRB genes with their counterpart sequences of human, the homologies of nucleotide sequences were 83% and 83%, and the homologies of amino acid sequences 83 % and 79% respectively. Further comparison with SLA sequences published in GenBank indicated that SLA-DRB gene found in Shaziling pigs has polymorphism while the homology of SLA-DRA gene is up to 100 % .Keywords: swine leukocyte antigen (SLA ); Shaziling pig; gene cloning; xenotransplantation1492 HEREDITAS(Beijing) 2007第29卷生物安全性和免疫排斥是猪→人异种胰岛移植主要存在的问题, 也是筛选供体猪的前提条件。
生物安全性方面, 整合在猪基因组中的内源性逆转录病毒(PERV)能够在接受了猪胰岛细胞移植的SCID 鼠体内引起感染[1], 因而倍受关注。
近年来研究表明, PERV在不同猪种的负载不平衡, 各猪种携带的PERV亚型和拷贝数不同[2]。
湖南沙子岭猪是湖南省著名的地方优良猪种, 具有独特的种质性状。
然而, 这种猪是否可作为异种胰岛供体呢? 在前期研究中, 我们对其猪内源性逆转录病毒负载情况进行了研究, 发现所有被检的个体93.5% (29/31)表现为囊膜蛋白基因env-C基因缺失, 表明湖南沙子岭猪在异种移植生物安全性方面具有一定优势[3]。
但是, 沙子岭猪的SLA遗传背景尚不清楚。
猪的主要组织相容性复合物, 又称白细胞抗原, 即SLA (swine leukocyte antigen, SLA), 编码移植抗原, 控制参与免疫应答调控和免疫识别及抗原提呈, 特别是在胰岛这类以急性细胞性排斥反应为主的异种移植中发挥着重要作用。
SLA分子多态性, 随着猪种产地或品种差异, 具有地域特征性。
目前, 国内只对广西巴马猪、贵州香猪、云南小耳猪、海南五指山猪及版纳猪等的SLA基因进行了研究[4], 尚未见对湖南沙子岭猪的相关报道。
本研究拟将PERV env-C亚型缺失的沙子岭猪为研究对象, 克隆SLA-DRA、DRB基因[5], 了解SLA基因特性和抗原多态性, 明确其在免疫排斥反应机制的作用, 评价沙子岭猪作为候选猪种, 在异种移植中的应用前景。
1材料和方法1.1材料1.1.1 主要试剂总RNA 抽提试剂盒购自美国Gentra公司, RevertAid TM First strand cDNA Synthesis kit购自Fermentas 公司; 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; Easy-A high-fedelity PCR cloning enzyme购自Stratagene 公司; PUCm-T载体购自瑞星生物公司; 1 400 bp Marker购自晶美生物工程公司。
1.1.2 实验动物湖南沙子岭猪来自湖南省湘潭市畜牧种猪站和湘潭市云湖桥镇七里铺村沙子岭猪保种基地。
1.2方法1.2.1 湖南沙子岭猪SLA-DRA和SLA-DRB的基因克隆根据GenBank 数据库(登录号M93028, AB205 163), 采用Primer 5软件设计以下两对引物。
DRA : F : 5′-GGCATCTAAGGAGAAAATGAC-3′; R : 5′-C- CACTCAAAGTTTATTGTATTCAG-3′; DRB : F : 5′- TTGTCCTCTCCTGTTCTCCAG-3′; R : 5′-TAGG- ACGCAGAGCATAGCAGG-3′。
随机挑选两个前期研究中缺失PERV env-C亚型的沙子岭猪个体, 取耳样组织按RNA抽提试剂盒(Gentra公司)说明书方法提取总RNA。
逆转录反应在20 μL体系中进行。
测定每一样品总RNA 的浓度, 定量为1 μg RNA 作为模板, 0.5 μg/μL Oligo (dT) -18 为引物, DEPC 处理水加至l2 μL, 按RevertAid TM First strand cDNA Synthesis kit 说明书依次加入5 ×缓冲液4 μL, 逆转录酶抑制剂1 μL, 10 mmol/L dNTP混合物2 μL, 200 U/μL 逆转录酶1 μL, 逆转录合成cDNA 第一链。
以cDNA 08 μL 为模板分别进行PCR 扩增, 10 μL 反应总体积中包含下列物质: 10× PCR 缓冲液1 μL, 20 mmol/L MgC12 0.8 μL, 2.5 mmol/L dNTP混合物1 μL, 50 pmol/μL上、下游引物各0.1 μL, Easy-A 高保真酶0.2 μL, 加双蒸水至l0 μL。