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稳定转染细胞株（系）详细构建流程

稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。

对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。

本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。

稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。

在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。

最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。

细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。

细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。

载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。

接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。

细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。

另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。

稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。

如何构建稳定转染的细胞系（株）？

如何构建稳定转染的细胞系（株）？稳定细胞株构建包含哪些关键步骤？A：如下♀一般稳定细胞株的构建包含以下几个部分：表达之类构建细胞转染pool细胞筛选单克隆筛选细胞库建立表达质粒构建A：如下♀将带有内切酶位点的抗体轻重链碱基序列通过聚合酶链反应(PCR) 方法合成，然后与载体连接构建表达质粒，抗体的轻重链可放在不同载体上。

为保证克隆到载体中的靶基因的准确性，在转染宿主细胞前需对表达质粒中的靶基因进行测序。

细胞转染A：如下♀将表达质粒通过四种不同的方法（化学法、物理法、脂质体转染、病毒转染）导入哺乳动物细胞内，最为常用的是电穿孔转染法、脂质体转染法和聚乙烯亚胺介导的转染方法。

转染的成功率取决于细胞的活性、质粒DNA 的纯度、转染试剂及转染方法。

Pool细胞筛选A：如下♀细胞池筛选与评估：转染后的细胞需要在选择性培养基中培养至活率完全恢复，用以产生稳定的细胞池。

选择试剂的使用取决于表达载体携带的选择基因及宿主细胞的类型。

过于CHO K1细胞，通常不含谷氨酰胺的培养基中添加MSX进行筛选；而DG44和DXB11细胞通过不含呈甘氨酸、次黄嘌呤和胸腺嘧啶，并对细胞池增加MTX的选择压力来提高抗体表达水平。

在细胞池筛选阶段，需要对细胞池表达抗体的产量和关键质量进行评估，根据评估结果选择3-4个细胞池进行克隆。

单克隆筛选A：如下♀单克隆筛选与评估：传统的单克隆筛选方法多采用有限稀释法，形成率呈泊松分布。

为保证单克隆的单一性，需要一轮以上的克隆筛选，通常低于1个细胞/孔的方法进行铺板，挑选300个克隆经过24孔板、6孔板、T方瓶的摇瓶逐级扩增，最后挑选出10-20个克隆进行摇瓶规模评估，根据细胞生长和产物质量特性，挑选出4-6克隆进一步在反应器中评估，并建立RCB。

三级细胞库的建立A：如下♀细胞库的建立为满足大规模抗体生产的需要。

根据生物反应器评估结果及细胞株稳定性研究数据，选择生产用工程细胞株及备选细胞株，并建立原始细胞库PCB，然后GMP条件下建立主细胞库和工作细胞库。

人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定张霖;牛瑞芳;王德发;史玉荣;于满【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2004(10)4【摘要】目的:应用前期制备的一株乳腺癌单克隆抗体(M4G3),筛选出高表达其相关抗原的乳腺癌细胞系T47D,并利用此细胞系构建了以λgt11为载体的cDNA文库,为完成此乳腺癌特异抗原基因的克隆与表达奠定基础.方法:在4株乳腺癌细胞中应用M4G3单抗进行免疫组化和Western BlOT检测,以其中一株T47D细胞为材料构建以λgt11为载体的cDNA文库,并进行文库质量鉴定.结果:文库含有9.97×105个重组子,重组效率达到96.7%,插入的cDNA片段平均长度为1.0kb.结论:与M4G3单抗结合的乳腺癌抗原分子量约为48 000 dalton.构建的T47D细胞cDNA文库完整,具有较好的质量,为进一步筛选奠定了基础.【总页数】5页(P483-487)【作者】张霖;牛瑞芳;王德发;史玉荣;于满【作者单位】天津医科大学肿瘤医院中心实验室,天津,300060;天津医科大学肿瘤医院中心实验室,天津,300060;天津医科大学肿瘤医院中心实验室,天津,300060;天津医科大学肿瘤医院中心实验室,天津,300060;天津医科大学肿瘤医院中心实验室,天津,300060【正文语种】中文【中图分类】R737.9【相关文献】1.人乳腺癌细胞cDNA噬菌体表达文库构建及鉴定 [J], 蔡建中;罗荣城2.牙鲆酵母双杂交cDNA文库的构建及文库质量鉴定 [J], 杨长庚;刘姗姗;孙冰;陈松林3.人肺癌细胞A549λ噬菌体cDNA文库的构建与鉴定 [J], 张红英;郭嘉雯;员月明;徐志勇;邓长生;王琪4.冬瓜均一化酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定 [J], 陈凤;闫晋强;李梅兰;江彪5.人肺癌细胞A549λ噬菌体cDNA文库的构建与鉴定 [J], 张红英;郭嘉雯;员月明;徐志勇;邓长生;王琪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

稳定转染细胞株（系）详细构建流程

稳定转染细胞株（系）详细构建流程细胞的稳定转染稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，使外源基因成为细胞基因组的一部分而得以复制。

对细胞进行稳定转染最终可筛选得到稳定细胞株，稳定细胞株在重组蛋白/抗体生产、基因编辑、功能研究等方面起着重要的作用。

本文主要介绍了细胞稳定转染的原理、如何进行稳转株筛选得到高表达的细胞株，同时还介绍了细胞稳转的影响因素及稳定转染的应用。

稳定转染实验流程从实验流程的角度看，稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的：先对哺乳动物细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选最终得到稳定细胞系。

在建立稳定转染细胞系时，我们需要使用选择标记来区分瞬时转染和稳定转染，通常质粒中带有选择标记，选择标记会与目的基因共表达，由此可以筛选出阳性克隆（外源基因已稳定整合至细胞的基因组上），同时剔除未稳定整合的细胞。

最终通过有限稀释得到稳定转染的单克隆细胞株。

细胞复苏细胞复苏是将保存在液氮冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程，将哺乳动物细胞进行复苏用于后续的细胞转染。

细胞复苏的关键是快融，防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。

载体构建及细胞转染将目的基因构建至载体（载体需带有抗性），随后将构建好的质粒线性化。

接着进行细胞转染，用于转染细胞的方式有多种，包括病毒转染、脂质体转染、电转、基因枪法等，在瞬时转染与稳定转染实验流程一文中介绍了脂质体转染细胞的详细实验操作流程。

细胞池筛选转染结束后即可得到细胞池，想要得到稳定转染的单克隆细胞株需要对细胞池进行筛选：先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再用有限稀释法挑取单克隆株。

另外如果想要得到高表达的稳定细胞株，需要对细胞池进行压力筛选（GS筛选系统或DHFR筛选系统），最终得到表达能力高的稳转细胞株。

稳定转染实验影响因素外源基因整合几率：外源基因整合几率决定了稳转株筛选的简易程度；拷贝数：一般情况下低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰；结合位点：不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而使稳转株筛选后出现丢失的现象；整合位点转录活跃度：整合位点转录活跃度决定了稳转株中外源基因片段的表达质量；稳定转染的应用待解决的问题解决方案外源基因要整合到细胞染色体上基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞基因组存在差异，会对实验结果造成干扰单克隆稳转株筛选外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源基因片段很快丢失需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞一些蛋白稳定性很强，瞬时RNA干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的成本，也很大程度上方便实验研究在某些细胞中长期研究基因的功能通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导效率的细胞高效表达外源片段获得外源片段的高效表达避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选有助于筛选出拷贝数适量的细胞得到过表达的目的基因或干扰拷贝数应用场景瞬时转染表达和稳定转染表达最显著的区别就是在时间上。

耐药细胞株构建

耐药细胞株构建实验
实验目的：采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对药物产生耐药性实验材料：
试剂：培养基（GIBCO），血清（CIBCO）
仪器：超净工作台、CO2培养箱、生物倒置显微镜{晶莱生物}
实验内容与方法：
1.体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导细胞的耐药性
2.MTT法测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数
实验信息：
1．生长状况良好的亲本细胞株，并提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。

2．诱导剂
服务周期：6个月
结果提交：提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）、耐药细胞株、亲本细胞株。

耐药细胞株构建实验

耐药细胞株构建实验
实验目的：采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导肿瘤细胞对药物产生耐药性
实验材料：
试剂：培养基（GIBCO），血清（CIBCO）
仪器：超净工作台、CO 2培养箱、生物倒置显微镜
实验内容与方法：
1.体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击方法诱导细胞的耐药性
2.MTT法测定药物对亲本细胞和耐药细胞的IC50，计算耐药指数
实验信息：
1．生长状况良好的亲本细胞株，并提供细胞特性，培养条件及相关注意事项。

2．诱导剂
服务周期：6个月
结果提交：提交实验报告书（耐药指数、实验试剂与设备、实验过程、结果分析、原始数据、细胞图片等）、耐药细胞株、亲本细胞株[晶莱生物]。

单克隆细胞株的构建与筛选

单克隆细胞株的构建与筛选
首先是构建单克隆细胞株的过程。

构建单克隆细胞株通常涉及
以下步骤：
1. 抗原免疫，首先需要选择合适的抗原，然后将其注射到实验
动物体内，激发免疫反应。

2. 细胞融合，从免疫动物中收集B细胞，然后与骨髓瘤细胞或其他恶性细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。

3. 筛选杂交瘤细胞，通过培养基中添加特定抗生素或其他筛选
方法，筛选出成功融合的杂交瘤细胞。

4. 克隆化，将筛选得到的杂交瘤细胞进行稀释，使其在培养皿
上形成单个克隆，然后进行单克隆的扩增培养。

其次是单克隆细胞株的筛选过程。

在单克隆细胞株构建完成后，需要对其进行筛选以获得所需的单克隆细胞株。

1. 抗原特异性筛选，通过ELISA、免疫组化等方法对单克隆细
胞株进行抗原特异性筛选，筛选出对目标抗原具有高亲和力的细胞株。

2. 亲和纯化，利用蛋白A/G、蛋白L等亲和层析柱对单克隆抗
体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体。

3. 功能性筛选，对单克隆细胞株的功能进行检测，如中和活性、细胞毒性等，筛选出具有良好功能的细胞株。

总的来说，构建单克隆细胞株是一个复杂的过程，需要仔细的
实验操作和严格的筛选步骤。

通过以上步骤，可以获得对特定抗原
具有高亲和力和良好功能的单克隆细胞株，为后续的科研和生产提
供了重要的实验材料。

稳定细胞株（系）构建实验要求

稳定细胞株（系）构建实验要求稳定细胞系（stable cell line），是指质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，就成了稳定表达的cell line。

以下实验，构建稳定细胞株而不是瞬时转染更能满足实验要求：1)，外源片段在分裂细胞中长期(>2周)稳定表达。

虽然普通转染实验一般只能保证2-4天的转染和表达效率，但腺病毒载体在多数分裂细胞中可以维持2-4周内的高转染效率和表达周期。

而非分裂细胞，可以使用腺相关病毒载体转导外源基因，因为腺相关病毒载体在许多非分裂细胞中可以保持长达1年的高效表达。

2)，需要构建使用诱导表达系统，这主要是由于：a)，过表达基因或者干扰目的基因引起细胞毒性或者抑制细胞生长等不利因素; b)，目的基因的过表达或者干扰需要时空特异性。

3)，希望控制目的基因过表达或者干扰的拷贝数，以避免引入人为因素影响实验结果的精确性。

构建稳定株可以帮助筛选拷贝数适量的细胞进行实验研究。

4)，部分细胞种类，病毒载体亦无法达到高转导效率，通过构建稳定株，达到外源片段的高效表达。

5)，长期在少数几类细胞中研究几个基因的功能，通过构建稳定株，可以大大降低频繁转染或者病毒包装的成本，也极大方便实验研究。

6)，部分蛋白稳定性极强，瞬时RNA干扰因为作用周期短，只能抑制目的基因的表达，但无法去除已经表达的目的蛋白，所以需要通过构建稳定株实现更好的基因干扰效果。

7)，需要往动物体内注射表达有外源片段的细胞。

需要构建稳定细胞株，以防止注射入动物体内后，很快外源片段表达丢失。

8)，细胞个体差异(同一类细胞，不同个体细胞基因组存在差异)对实验结果有干扰，需要构建单克隆细胞株去除干扰。

9)，需要将外源片段插入基因组中，比如基因敲除，基因插入突变筛选等修饰基因组的实验。

应用：研究发现了一种在这些癌症干细胞上表达的蛋白，同时制备了能与该蛋白特异结合的抗体。

当抗体注射入此前已注射癌症干细胞的小鼠后，抑制了癌症细胞向其他器官转移。

体内耐药细胞株构建实验的具体方法及步骤

体内耐药细胞株的建立实验的具体方法及步骤
细胞与低剂量的药物长期接触，引起细胞本身药物化学过程的改变，细胞膜上出现P gp糖蛋白，使细胞逐渐对药物耐受，随着药物浓度的递增，其耐受程度逐渐加强。

一、材料准备
1. 动物选择：根据欲建立的耐药细胞株，选择合适的动物。

在实验期间，一般选择同性别动物进行实验，动物体重的选择以雌性约17~21 g，雄性约18~22 g 为宜。

2. 瘤株的选择：常见的瘤株均可，应依据研究目的、方向确定实验用瘤株，考虑到传代方便，且容易观察或检测，多选择腹水性肿瘤。

二、实验步骤
1. 所试药物的毒性测定
（1）把小鼠随机分成5~8组，每组10~20只小鼠，每只动物每天给予定量的药物，每天1次，连续给药5天，然后观察30天。

（2）记录30天内动物的死亡数。

药物的剂量应能使动物的死亡率从0~100%。

（3）计算LD10及95%的可信限，耐药株建立的最初剂量约为1/6LD10。

2. 瘤细胞生长测定
（1）用传代第7天的腹水癌细胞给每只动物接种15×106个细胞，7天后处死动物，开腹，收集全部腹水，腹腔用含150 IU的肝素生理盐水冲洗3次。

（2）合并腹水及冲洗液进行瘤细胞计数，腹水5 500 g 离心5 min，测定瘤细胞压缩体积。

（3）统计不同剂量用药组及对照组的瘤细胞压缩体积，可以测出药物对肿瘤细胞生长的
影响。

（4）药物剂量一般在LD10时，能完全抑制敏感株肿瘤细胞的生长。

耐药胞株构建

稳定/耐药细胞株构建一、服务介绍稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。

稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。

本公司可提供普通脂质体转染后单克隆法筛选,以及病毒感染后筛选稳定株和耐药株二、技术原理稳定表达细胞株（稳转细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。

稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。

用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。

在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。

常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）三、操作流程1、载体构建：将外源基因构建到合适的载体上，如需病毒转染，则包装病毒。

2、筛选浓度测定：以14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度。

3、细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定4、细胞转染：用构建好的载体（或包装好的病毒）转染目的细胞。

5、抗生素筛选。

6、鉴定筛选结果四、客户提供1.外源基因及相关基础数据；2.生长状态良好的靶细胞系,特殊细胞需提供培养基3.与该技术相关其它信息五、实验结果提供形式1、构建完成的稳定/耐药细胞株以及对照细胞株2、稳转/耐药细胞株标准实验报告及相关的外源基因表达分析结果3、实验流程及报告电子版本一份六、实验服务周期约5-8周左右，具体时间根据细胞生长,药物诱导情况而定。

七、质量承诺及舜百优势a.稳定：舜百生物保证20代以内稳定转染细胞稳定表达。

b.迅速：一般控制在1.5个月以内完成构建。

c.经济：价格实惠，性价比高。

d.质量保证：对外源基因进行严格鉴定。