生物大分子与疾病

siRNA的特点

1 长度约在22nt左右2依赖Dicer的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer的产物的特点3、生成需要Argonaute家族蛋白存在。4、是RISC组分5、siRNA合成是由双链的RNA 形成的。6、siRNA一般是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物7、结构上，siRNA是双链RNA8、在Dicer酶的加工过程中，siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。9、在作用位置上，siRNA可作用于mRNA的任何部位，并与mRNA完全互补。10、在作用方式上，siRNA自能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控。11、siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

RNAi在哺乳动物中应用的具体设计策略

1siRNA设计的原则

1在预定沉默的mRNA中找到一段21nt的序列，起始是AA 2、一般在靶mRNA起始密码子下游100-200bp至翻译终止密码子上游100bp的范围内，其中AA(N19)TT是最理想的序列，若靶mRNA 中无此序列，亦可选用NA(N21)或NAR(N17)YNN(R表示嘌呤，Y表示嘧啶）3在19nt的RNA片段中不能含有连续4个T或A的区域4、通过BLAST确定片断的特异性。5、通过一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，已找到最有效的siRNS序列。

高效siRNA的序列结构特征

1、G/C含量低（30%-52%）

2、正义链3’端具较低的稳定性（有利于siRNA与RISC的结合和解链）

3、无反向重复序列（有利于减小siRNA的有效作用浓度，提高siRNA干扰效率）

4、正义链碱基的偏爱性A19（正义链中第19位碱基为A,如下表示同类）

5、A3

6、U10

7、无G/C19(正义链中第19位碱基不为G或C);无G13

siRNA制备方法----化学合成法

1、早期RNAi实验中，dsRNA或siRNA均由化学法所合成。

2、化学合成siRNA纯度高。合成量不受限制，且还可以对siRNA进行标记，方便对其跟踪。

3、但该方法价格昂贵，定期周期长，不适用于siRNA进行标记。方便对其跟踪。

4、但该方法价格昂贵，定期周期长，不适用于siRNA的序列的筛选和长期基因沉寂实验

最适于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素

二、siRNA制备方法-----体外转录

当对于化学合成而言，体外转录合成siRNA较为经济。根据siRNA序列合成相应DNA Oligo 模板，再利用T7RNA聚合酶进行体外转录，分别获得siRNA的正义链和反义链，然后将其退火、纯化即可得到能直接导入细胞的siRNA 2体外转录法最大缺点是siRNA合成量受到限制，不过其价格低，毒性小，稳定性好，效率高。3体外转录得到的siRNAs自要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。（最实用于，筛选siRNA,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA.长期研究

三、siRNA制备方法---------鸡尾酒法

“鸡尾酒”法原理是采用RnaseIII消化长片段dsRNA来获取siRNA,基本步骤如下：

1针对靶基因mRNA（通常选取200-1000bp)在体外转录成长dsDNA;;用大肠杆菌RnaseIII 酶或Dicer酶对dsDNA进行酶解，得到一组siRNA混合物；去除未被消化的dsDNA,剩下siRNA混合物可用来直接转染细胞

利用此方法可以省略较为繁琐siRNA设计与筛选工作，且能够保证靶基因被有效抑制。该方法适合于快速经济地研究某个基因功能缺失表型，但因所使用siRNA为混合物，无

法确定有效的siRNA靶序列，并有可能产生非特异性基因抑制，特别是同源或者密切相关的基因。（最适用于；快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型；不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗）

鸡尾酒疗法，原指“高效抗逆转录病毒治疗”由美籍华裔科学家何大一于1996年提出，是通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病。该疗法的应用可以减少单一用药产生的抗药性，最大限度地抑制病毒的复制，从而延缓病程进展，延长患者生命，提高生活质量。该疗法把蛋白酶抑制剂与多种抗病毒的药物混合使用，从而使艾滋病得到有效的控制。

疾病的分子机制是指一种狭义的概念，是指大分子（蛋白质与核酸）在疾病发生、发展中的作用。这里我们只阐述遗传性疾病中的基因突变机制。同样，把由于基因突变、缺失或表达障碍引起的疾病也称为“基因病”。

1.单基因病（分类）

单基因病是指由单个基因缺陷引起的疾病。目前已发现五六千种单基因病。其中，多数单基因病表现为显性遗传；有的为隐性遗传；还有的呈 X 性连锁遗传（如血友病）。

2.多基因病多基因病是指由多个基因的结构或表达调控的改变引起的疾病。例如，高血压、糖尿病、自身免疫性疾病和恶性肿瘤等都属于多基因病。多基因病的相关基因在致病过程中发挥的作用可能等同，也可能有主有次。另外，也受年龄和环境因素影响，表现出基因的易感性。

3.获得性基因病获得性基因病是指由病原微生物感染引起宿主细胞的基因改变或丧失，但不会遗传。如 HBV 、 HCV 可整合到肝细胞的 DNA 上导致肝癌发生。

基因突变（ gene mutation ）是指基因组 DNA 分子在结构上发生核酸序列或数目的改变。我们讲基因突变存在于整个生物界，同样基因突变也是一把双刃剑：首先，没有基因的突变，就没有进化；另外，基因突变可以导致基因病的发生。

基因的突变存在突变热点（ hot spots of mutation ）或突变区。因为 DNA 分子上的各个部位碱基发生突变的频率不同，某的部位突变频率高的称为突变区，突变频率低的称保守区。如只涉及单个碱基改变者称点突变（point mutation）。

1.基因突变的一般特征

（1）多向性基因突变的多向性是指同一位点（ locus ）上的同一祖先基因可独立发生多次突变，形成等位基因（ multiple gene ）。例如，在染色体的某一个位点存在基因 A ，在一定的条件下基因 A 发生突变形成 A1，再突变形成 A2、 A3、 A4等，并表现出不同的表型，形成复等位基因。人类最典型的例子是 ABO 血型的复等位基因存在。

（2）可逆性基因突变的方向是可逆的，一个显性基因 A 可以突变为隐性基因a ，同样，隐性基因 a 也可以突变为显性基因 A ，恢复原来的状态。前者称为正突变；后者称为回复突变。但是正突变的几率远远大于回复突变。

（3）有害性大部分基因突变，对人体来讲是有害的。遗传性疾病引起是由于包括生殖细胞在内所有细胞的存在同一基因突变造成的。另外，体细胞的基因突变后有三种可能： 1 ）突变细胞死亡、清除； 2 ）突变细胞增殖分化异常导致肿瘤细胞发生；

3 ）中性突变，就是基因突变后对细胞无害（不改变细胞的表型和功能）

（4）稀有性人类的基因在群体中自然突变的概率是非常低的，大约在每代1

万-100万个生殖细胞中出现1次突变（10-6-10-4/生殖细胞/位点/代）。例如， F Ⅷ（AHG）基因突变率为 2.0×10-5， 100万个生殖细胞中有20个细胞的AHG基因发生突变。

（5）重复性重复性是指基因突变总是以一定的频率在某一基因位点上反复发生。例如，白化病基因可以在不同的个体重复出现。另外，有时可表现出种族性，如镰状红细胞贫血病只在黑人中出现。

（6）随机性

对不同的基因来讲，突变发生的几率是相同的，但对具体的个体来讲突变发生是随机的。

2.基因突变的类型

（1）碱基置换突变

碱基置换突变是指一个碱基被另一碱基取代而造成的突变。可分为：转换

（ transition ），碱基置换在嘌呤与嘌呤或嘧啶与嘧啶之间进行；颠换

（ transversion ），为嘌呤与嘧啶之间的置换。

在自然界，转换突变多于颠换突变。由于碱基置换导致核苷酸顺序的改变，也就是密码子发生改变，这样对多肽链中氨基酸的顺序可能会产生影响，这样根据其影响的程度不同，可以把碱基置换突变分为下几种：

1）同义突变（ same-sense or synonymous mutation ）是指单个碱基置换前后的密码子所编码的氨基酸一样。例如，密码子 GCG 的第三位 G 被 A 取代而成 GCA ，使mRNA 的原来密码子 CGC 被改变为 CGU ，但 CGC 和 CGU 都是精氨酸的密码子，所以，翻译成的氨基酸肽链没有任何变化。

2）错义突变（ missense mutation ）是指 DNA 分子中的核苷酸置换导致合成的多肽链中一个氨基酸被另一氨基酸所取代。

例如， mRNA 中密码子 AAA （赖）的第二个核苷酸 A 颠换为 C 时，则该密码子编码的氨基酸由赖氨酸改变为苏氨酸。错义突变的结果是产生异常蛋白质。但是，有些错义突变并不影响蛋白质或酶的生物活性，因而把不表现出明显的表型效应的突变称为中性突变（ neutral mutation ）。

3）无义突变（non-sense mutation）是指单个碱基置换导致终止密码子（UAG 、UAA 、 UGA）提前出现。由于终止密码提前出现导致多肽链合成被提前终止，这样所产生的蛋白质会失去原来的活性和功能。如果无义突变发生在靠近 3' 末端处，表现为渗漏型，所谓渗漏型是指可能具有野生型多肽链的抗原性，但无生物学活性，不能发挥其正常功能。

4）终止密码突变（ termination codon mutation ）是指 DNA 分子中一个终止密码发生突变，成为编码氨基酸的密码子，使多肽合成到该停止的地方停不下来，结果肽链出现异常延长。也称为延长突变（ elongtion mutation ）。

5）抑制基因突变（ suppressor gene mutation ）是指一次基因突变的结果抑制了另一基因突变所产生的后果。例如： Hb Harlem 是β链第 6 位谷氨酸突变成缬氨酸，第 73 位天冬氨酸变成天冬酰胺；如果单纯β6 谷氨酸→缬氨酸，就会造成患者死亡。由于存在β73位突变抑制了β6 突变的有害效应。使患者临床表现变的较轻。

（2）移码突变和整码突变

移码突变（frame-shift mutation）是指 DNA 链上插入或丢失 1 个、 2 个甚至多个（但不包括三个或其倍数）碱基，导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。如果插入或丢失部位的前后氨基酸顺序不变，称为整码突变（codon mutation ）。

二、单基因病的发病机制

单基因疾病中最常见的包括：代谢酶类缺陷疾病，血红蛋白结构异常和数量缺陷疾病，其他蛋白因子缺陷。

（一）代谢酶类缺陷

1.苯丙酮尿症

苯丙酮尿症是由于苯丙氨酸代谢途径中酶缺陷所致，因患儿尿液中排出大量苯丙酮酸等代谢产物而得名。另外，患儿智力出现低下，皮肤、毛发色浅，汗和尿有特殊的鼠嗅味。它最早由 Fouling 于 1934 年发现的， 1953 年 Jervis 证实是由于苯丙氨酸羟化酶缺陷引起，此酶是催化苯丙氨酸转化为酪氨酸的代谢途径的关键酶。

患者的苯丙氨酸羟化酶缺陷的主要原因是基因的错义突变、缺失以及剪接突变造成的。苯丙酮尿症可以分为两型：一是苯丙氨酸羟化酶缺陷导致的 PKU 型（ 99% ），另一种是 BH4 型（ 1% ）鸟苷三磷酸环化水合酶（ GTP-CH ）、6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（6-pts）和二氢生物蝶呤还原酶（DHPR）缺乏也可以造成苯丙酮尿症。苯丙酮尿症属常染色体隐性遗传。其发病率随种族而异，约为l/6000 ～ l/25000 ，我国发病率约为1/16500 。它也是我国法定的新生儿进行普查的病种之一。

2.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ G6PD ）缺陷

是最为常见的人类代谢酶类缺陷疾病，也是红细胞内磷酸戊糖旁路缺陷的遗传性疾病之一。患者绝大多数平时没有什么临床症状，但在一定条件下，例如，服用氧化剂药物（磺胺药、注射维生素 K 、缺氧）、蚕豆口服或感染时，可以发生明显的溶血性贫血。临床上典型的病症包括持续性的新生儿黄疸（ neonatal jaundice ）和溶血性贫血（ hemolytic anemia ）。新生儿黄疸是一种见于男婴的遗传病。

G6PD 位于 Xq28 ，基因占有 18.5kb 的区域，由 13 个外显子和 12 个内含子组成，编码的成熟 mRNA 长度 2269bp ，翻译出的肽链约 59Kd 。有活性的蛋白是由 2 个或 4 个相同的亚基组成。目前发现 G6PD 缺陷有 400 多种，其中 56 种变异的酶切位点已经被查出，大多数突变位点涉及氨基酸替代引起酶的活性部分丧失。而且突变位点集中于酶蛋白的羧基端，介于 362-446 号氨基酸之间；相反，临床症状较轻的患者常常是由于突变发生于氨基端，对 G6PD 酶的活性影响较小。如果酶活性完全失去，将不可能正常发育到出生。

G6PD 是一个典型的看家基因，即在绝大部分组织的细胞中都需要，它催化葡萄糖-6- 磷酸分子的脱氢反应，使氧化型的 NAPD ++ 还原为 NAPDH ，是人类磷酸戊糖代谢途径的第一步反应。但在红细胞内，这个过程是唯一的 NAPDH 产生途径。如果 G6PD 缺陷，使红细胞对氧化物的清除能力丧失，产生自由基，在清除自由基时消耗了还原性谷胱甘肽（ GSH ）又不能及时补充；使 GSH 进一步减少。 GSH 减少时，患者 Hb 中的巯基易被氧化，红细胞膜变的极其不稳定，造成溶血症状。所以 G6PD 缺陷病人会对氧化性的药物敏感。 G6PD 缺陷病人药物敏感种类超过 50 种，其中包括常见的阿司匹林、氯喹、奎宁、磺胺嘧啶、氯霉素等。

（二）血红蛋白病

1.血红蛋白分子及其基因

人类 Hb 由 4 条珠蛋白链组成，但珠蛋白肽链有四种类型，分别是α、β、δ和γ肽链。正常成年人 Hb 是由两条α和两条β链，可以写成α2β2 ；每条珠蛋白链

由 140 多个氨基酸链组成，并携带一个血红素（ heme ）基团。 Hb 的功能是携带和运输氧气，把氧气从肺泡运输到组织。

人类的珠蛋白基因分别位于 11p 和 16p 。其中 11p （短臂末端）上分布有类β链基因家族的 5 个功能基因（ε、Gγ、A γδ和β）和1个假基因，约有 25Kb 的区域，编码β、δ、γ肽链。 16p 聚集2个α基因（α1 、α2 ）和δ基因，以及 2 个假基因，约有 60Kb 的区域，编码α肽链。所有的珠蛋白基因结构也都非常近似，均由 3 个外显子组成，中间插有 2 个内含子。

2.Hb 病结构变异的分子机制

Hb 基因的任何变异都可能导致蛋白结构和功能改变，这也是导致 Hb 病的原因。目前已发现的珠蛋白的单核苷酸突变大约有 600 多个类型。在这些突变中，多数不会影响 Hb 的功能和人类健康，但有些突变可以导致 Hb 变异性疾病。从分子水平上分析，Hb 病结构变异产生的机制可能有以下几种：

Hb 病结构变异产生的机制

3.Hb 变异性疾病

是指在血红素结合区域或构象维持的关键氨基酸残基，以及亚单位结合位点发生氨基酸替代的基因突变，导致 Hb 对氧的亲和力改变。

（1）不稳定血红蛋白引起的贫血是由于血红素不能稳定的结合到珠蛋白的血红素口袋，使无血红素的珠蛋白在红细胞内沉积。轻者会使红细胞过早地被网状内皮系统清除，重者直接引起溶血，结果使患者出现程度不同的贫血表现。

发生机制是只要能造成血红素口袋周围的氨基酸替代或缺失的基因突变，都能影响血红素和珠蛋白的结合能力。目前，已经有 100 多种不稳定 Hb 被发现，其中 3/4 发生在珠蛋白β基因。

（2）高铁血红蛋白血症（HbM）临床表现是先天性家族性紫绀出现。其发病机制是由于血红素口袋周围的氨基酸残基被替代，产生多出一个配位键，使血红素中正常二价铁离子过快变成三价铁离子，处于脱氧状态而不能结合氧。

目前发现，有 7 种珠蛋白突变可以导致 HbM ，其中 6 种涉及组氨酸残基被酪氨酸所取代。酪氨酸侧链上的羟基能与二价铁离子形成稳定的配位键，形成三价铁的高铁Hb ，氧亲和力下降，失去携氧功能，产生紫绀。一种是β链 67 位缬氨酸被谷氨酸

取代，谷氨酸的游离羧基可与血红素二价铁离子结合，成为三价铁稳定状态，产生高铁 Hb 。

（3）伴有红细胞增多的异常血红蛋白病（ abnormal hemoglobin syndrome with erythrocytosis ）这是由于 Hb 对氧亲合力升高，使氧离曲线左移，不易释放出氧，造成组织缺氧，缺氧刺激红细胞生成增加，导致代偿性的红细胞增多症。

能引起 Hb 对氧亲合力升高的珠蛋白基因突变有 50 余种，但常见的：①位于α1β2 （或α2β1 ）亚基接触面的氨基残基发生了取代；②β珠蛋白肽链羧基端和2，3-DPG 结合位点发生了氨基酸取代；③血红素口袋四周的氨基酸被取代。这三种基因突变都导致 Hb 构象变化和对氧亲合力升高，氧离曲线左移。

（4）镰状细胞病镰状细胞病是指β珠蛋白链第 6 位缬氨酸被谷氨酸替代，产生 HbS 。纯合子突变患者在相对缺氧时， HbS 可形成高分子的束状结构，并且合并为形成长棒状纤维束，使红细胞膜出现变形成为镰状。镰状细胞容易被脾脏所破坏，使血液的粘滞度加大和加重缺氧。患者可出现腹痛和肌肉疼痛，在后期出现病变组织坏死。杂合子突变时，红细胞寿命可以是正常的，因为 RBC 内 HbS 含量低于 40% ，但在严重低氧时红细胞也会发生镰状化。

4.Hb 表达减少或缺失 - 地中海贫血地中海贫血的发生机制主要是珠蛋白基

因发生缺陷或缺失，使某种珠蛋白肽链的合成受到抑制所引起的一组遗传性贫血。根据受影响的珠蛋白不同，可分为：α和β地中海贫血。同样，如果是杂合子缺陷，称为α+ 和β+ 地中海贫血；如果是纯合子缺陷，称为α0和β0地中海贫血。

β地中海贫血发生的分子机制

（三）其他基因缺陷导致的疾病

上个世纪后期，人们对基因病的研究从表型 - 基因型 - 基因克隆路线转移到疾病- 基因克隆 - 分析的研究策略，其中重要的原因是连锁不平衡为基础的反向遗传学方法提出。尽管以这种方法克隆的基因很可能难以判断其分子机制，但明确提示某一种疾病与此基因的突变密切相关的。比较典型的病例有以下三种：

1.唐氏肌营养不良症（ Duchenne muscular dystrophy, DMD ）DMD 大多发生于男性，在欧洲男性的发病率为 1/3,500，具有典型的 X 染色体连锁的特征，但我们无法从患病的肌肉样本中获得异常表达或突变产物的信息。但从细胞遗传学研究发现部分病例的 Xp21 位点上存在缺失的特征，然后，对这一位点进行基因克隆，发现该基因含有 100 个外显子，可编码一个 3685 个氨基酸的蛋白质，这蛋白质在横纹肌、平滑肌和心肌细胞都有表达，是细胞膜内侧的膜蛋白（肌营养素， dystrophin ）。从蛋白结构和位置判断，肌营养素的功能可能是通过和膜蛋白结合，维持肌细胞的完整性，但真正的作用机理一直不清楚。

多数 DMD 病例是由于 DMD 基因的缺失（ 65% ）引起的，所以推测这种大型基因容易受到染色体重排的影响而失活。

2.囊性纤维化（ Cystic fibrosis ）

囊性纤维化是欧美地区最常见的隐性致死性遗传病（ 1/2000 的新生儿）。在基因克隆之前，已经知道在上皮细胞内， cAMP 介导氯离子转运，但 cAMP 的正常依赖于蛋白激酶（ PKA ）。这基因的克隆是通过连锁分析后，决定其基因位于 7 号染色体 7p13 位点上。这一基因区域有 250kb ，转录一个 6.5kb 的 mRNA 。最后，确定这基因位点是由于 70% 的患者的 7p13 基因 7 号外显子含有 3 个碱基的缺失，造成蛋白质△

F508 缺失。在转染野生型的全长基因可以使氯离子通道恢复正常。基因被命名为 CFTR （ cystic fibrosis transmembrane conductance regulator ），是一个 PKA 活化的离子通道。

3.亨廷顿氏病（ Huntington's disease，HD）亨廷顿氏病是一种进行性的基底神经节和皮层退变性疾病，患者表现舞蹈病、运动协调障碍，痴呆和不同的心理障碍，属常染色体显性遗传。

通过连锁分析 HD 证明基因位于 4p16.3 （近端粒区），是一个全长 210kb 的大基因，含有 67 个外显子，称为 IT15 。其编码的蛋白产物 MW348000 。从克隆到的 HD 基因中发现谷氨酰胺密码子的重复次数增加，而且是一种为数不多的动态突变

（ dynamic mutation ）方式。编码谷氨酰胺的不稳定密码子位于 5` 端。除 HD 基因突变的方式独特外，另外一个注意点是虽然此病的基因被克隆并加以证实，但其基因的功能，它所编码的蛋白质的结构和功能却仍然未知。

疾病发生的基本机制（mechanism）是指参与很多疾病的共同机制。下面从神经机制、体液机制、细胞机制和分子机制四方面叙述。

（一）神经机制

神经机制参与了大多数疾病的发病，有些因素直接损害神经系统，如流行性乙型脑炎病毒。另一些致病因子可通过神经反射引起相应器官组织的功能代谢变化，或者抑制神经递质的合成、释放和分解，促进致病因子与神经递质的结合，减弱或阻断正常递质的作用。最常见者为早期精神紧张、焦虑、烦恼导致大脑皮质功能紊乱，皮质与皮质下

功能失调，导致内脏器官功能障碍。

（二）体液机制

疾病中的体液机制主要是指致病因素引起体液的质和量的变化，体液调节的障碍最后造成内环境紊乱，以致发生疾病。体液调节紊乱常由各种体液因子（humoroalfactor）数量或活性变化引起，它包括各种全身性作用的体液性因子（如组胺、去甲肾上腺素、前列腺素、激活的补体、活化的凝血与纤溶物质等）和局部作用的体液因子（如内皮素、某些神经肽等）以及细胞因子（cytokines），如白介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNFα）等。体液因子常通过以下三种方式作用于靶细胞：①内分泌（endocrine）：体内一些特殊的分泌细胞分泌的各种化学介质，如激素，通过血液循环输送到身体的各个部分，被远距离靶细胞上的受体识别并发挥作用；②旁分泌（paracrine）：由某些细胞分泌的信息分子由于很快被吸收破坏，故只能对邻近的靶细胞起作用，采用这种方式的有神经递质（如神经原之间的突触传递）及一些生长因子等；③自分泌（autocrine）：细胞能对它们自身分泌的信息分子起反应，即分泌细胞和靶细胞为同一细胞，许多生长因

子能以这种方式起作用。

在很多疾病中存在体液调节紊乱，这主要是通过内分泌激素起作用的，而内分泌腺的功能活动是受神经机制调节的。疾病发生发展中体液机制与神经机制常常同时发生，

共同参与，故常称其为神经体液机制。

（三）细胞机制

致病因素作用于机体后可以直接或间接作用于组织、细胞，造成某些细胞功能代谢障碍，从而引起细胞的自稳调节紊乱。致病因素引起的细胞损伤除直接的破坏（如外伤、肝炎病毒侵入肝细胞等）外，有时可表现为细胞膜功能障碍和细胞器功能障碍。细胞膜功能障碍中目前对膜上的各种离子泵如钠泵即Na+-K+ATP酶、钙泵即

Ca2+-Mg2+ATP酶等最为重视，当这些泵功能失调时造成细胞内Na+、Ca2+大量积聚、细胞水肿，甚至死亡，这是导致有关器官功能障碍的重要机制。细胞器的功能障碍，例如：线粒体功能障碍主要表现为氧化还原电位下降，辅酶Ⅱ不能再生，各种酶系统受抑制，特别是丙酮酸脱氢酶系统催化过程发生障碍，阻碍丙酮酸脱氢、脱羧生成乙酰辅酶A，抑制葡萄糖、脂肪及酮体进入三羧酸循环，此时因能量不足，造成严重的细胞功能障碍。此外，ATP生成减少使依赖cAMP（第二信使）的激素不能发挥其调节作

用，最终导致细胞死亡。

（四）分子机制

各种病因引起疾病，都会以各种形式表现出分子水平上大分子多聚体与小分子的异常，反之，分子水平的异常变化又会在不同程度上影响正常生命活动。近年来从分子水平研究疾病的发生机制出现分子病理学（molecularpathology）或分子医学（molecularmedicine）。广义的分子病理学研究所有疾病的分子机制，狭义的分子病理学主要研究生物大分子（主要是核酸与蛋白质）在疾病中的作用。所谓分子病（moleculardisease）是指由于DNA遗传变异引起的一类以蛋白质异常为特征的疾

病。它主要分成以下几类：

1.酶缺陷所致的疾病主要是指DNA遗传变异引起的酶蛋白异常所致的疾病。如Ⅰ型糖原沉积病，它是由于编码6-磷酸-葡萄糖脱氢酶的基因发生突变，致该酶缺乏，使6-磷酸-葡萄糖无法酶解为葡萄糖，反而经可逆反应转化为糖原，并沉积于肝。

2.血浆蛋白和细胞蛋白缺陷所致的疾病如镰刀细胞性贫血，它是由于血红蛋白的珠蛋白分子中在β-肽链氨基端第六位的谷氨酸被缬氨酸异常取代，以致血红蛋白的稳定性破坏，表现为血氧分压降低的情况下容易形成棒状晶体，使红细胞扭曲呈镰状，故容

易破坏，发生溶血。

3.受体病由于受体基因突变使受体缺失、减少或结构异常而致的疾病称为受体病。它又可分为遗传性受体病（如家族性高胆固醇血症等）和自身免疫性受体病（如重症肌

无力等）两种。

4.膜转运障碍所致的疾病这是一类由于基因突变引起的特异性载体蛋白缺陷而造成膜转运障碍的疾病。目前了解最多的是肾小管上皮细胞转运障碍，表现为肾小管重吸收功能失调，例如，胱氨酸尿症，此患者的肾小管上皮细胞对胱氨酸、精氨酸、鸟氨酸与赖氨酸转运的载体蛋白发生遗传性缺陷而发生转运障碍，氨基酸能被肾小管重吸收，

随尿排出，形成胱氨酸尿症。

某些疾病（如糖尿病、高血压等）相关基因（disease-associatedgene）或易感基因（susceptibilitygene）也已找到，因此出现了基因病（genedisease）的新概念。基因病主要是指基因本身突变、缺失或其表达调控障碍引起的疾病，如果由一个致病基因引起的基因病称为单基因病（mono-genediseaseorsinglegenedisorder），如多囊肾，主要是由于常染色体16p13.3处存在有缺陷的等位基因PKDI所引起的显性遗传。如由于多个基因共同控制其表型性状的疾病称多基因病（polygenicdisease或multigenedisease）。此时多个基因的作用可以相加、协同或相互抑制。由于这些基因的作用也受环境因素的影响，因此多基因病也称多因子疾病（multifactorialdisease）。高血压、冠心病、糖尿病等均属此类疾病。

第五章肿瘤

恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病，已成为当今世界上许多国家重点研究的课题之一。随着现代生物医学和高新技术的迅猛发展，肿瘤的基础研究和临床诊治均取得了显著进步，

肿瘤流行病学定义、研究对象和研究范畴、研究的基本方法、分析常用指标；

恶性肿瘤的流行特征：时间趋势、多发肿瘤的流行状况、恶性肿瘤的地理分布、恶性肿瘤的人群分布

肿瘤预防策略：国外癌症防治的经验、中国癌症防治的成绩与不足、我国对重点肿瘤防治的对策、病因学预防；

第二节肿瘤的病因及发病机制

各种致癌因素：化学致癌、物理致癌、致瘤病毒、遗传因素；

肿瘤发病的多阶段

肿瘤的遗传易感性因素：高外显度的遗传综合征与肿瘤易感性、基因一环境相互作用与肿瘤易感性、遗传易感性因素鉴定在肿瘤防治中的应用

第五节肿瘤转移

一、肿瘤转移的基本过程

二、肿瘤转移的细胞和分子机制

肿瘤的侵袭和转移是许多恶性肿瘤治疗失败和患者死亡的主要原因。

癌细胞侵袭是指癌细胞离开其原发灶而侵犯了邻近组织，并在该处继续生长繁殖的过程。

肿瘤细胞侵袭破坏细胞外基质并迁移进入脉管系统是转移发生过程中的重要环节，肿瘤细胞的侵袭、迁移能力可反映其恶性程度。

（划痕实验是测定细胞迁移能力的一种经典研究方法。）

（Transwell小室体外侵袭实验是一种测定细胞侵袭能力的方法。TransweIl小室底部是布满8μm直径小孔的PET膜，可供单个细胞迁移通过。侵袭实验则在PET膜上面铺了一层Matrigel，模仿细胞外基质，只有具有侵袭能力的细胞才能通过，细胞消化了基质才能从低营养的培养液进入高营养的培养液里，最后检测穿过基质胶的细胞数量就可以了解细胞的侵袭能力。）

miRNA的特征

长度一般为19-25nt,内源性、非编码、小分子单链RNA 一般来源于染色体非编码蛋白区一段能通过靶基因mRNA侧翼区域特异性配对结合，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，广泛地负调控靶基因的表达广泛存在于果蝇、软体动物、鱼类以及人等真核生物中。目前，人类已经发现1500余种miRNA.部分miRNA基因以基因簇形式存在于基因组中，它们多以顺反子的形式转录出前体转录本，再由Dicer切割前体的双链部分而生成；相当一部分miRNA位于基因内含子区域；植物的miRNA前体比动物的长约3倍。miRAN在物种间具有高度保守性、时序性和组织特异性。

miRNA的产生和功能

在细胞核内转录成前体转录本被RNaseIII核酸酶Drosha加工成约70-90nt的发夹状per-miRNA Z转运到细胞质被DICER加工成成熟的miRNA 双链miRNA分子被解链，单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体miRNS(RISC) 通过与靶基因的3‘UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或翻译抑制

microRNA与肿瘤的研究

肿瘤发生；microRNA能作为肿瘤抑制剂或致癌因子行使功能，特定microRNA的敲除或过表达可用于研究miRNA在癌症发生和发展过程中的作用；（近年来发现50%以上的miRNA基因定位于肿瘤相关的染色体坐位或其脆性位点，直接或间接导致了肿瘤的发生。

肿瘤诊断；正常组织和肿瘤组织中miRNA表达明显改变，这些特点使microRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用靶标

慢性淋巴细胞白血病（CLL)和miR-16-1存在缺失或下调

癌旁组织相比，肿瘤组织miR-122表达是下降的

肿瘤治疗；由于大多数致癌基因能够引发癌症，因而可以设计一些人造microRNA阻碍其表达，从而达到抑癌基因形成的目的

体外实验表明，let-7对多种人类肺癌组织有明显抑制作用，移植到小鼠肺癌模型中，let-7作为鼻内药物能减少小鼠肺癌模型的肿瘤形成。

miRNA的作用是多种多样的，它既可以通过关闭一些关键基因来改变细胞的命运，也可能与其靶基因产物相互作用，形成调节环与其他调节通路交织作用形成网络调控机制。

大多数miRNA并非独立作用，而是参与到复杂的基因调控网络；