细胞冻存与复苏步骤
实验6_细胞冻存与复苏
『超低温冰箱』
制冷系统
基本采用复叠式制冷的工作原理，选用两台全封闭 压缩机作为高、低温级压缩机使用
外观
卧式，立式
-86℃超低温冰箱使用
使用90～95%能力，以延长机器寿命；设置使用温 度为-76℃
实验6 细胞冻存与复苏
1- 细胞冻存操作步骤
准备 冻存液（完全培养基配制的10%DMSO 溶液）配制 对数生长期细胞的吹打（消化）、收集、离心和计数（或估算）
1000rpm6min，去上清
用冻存液悬浮细胞使密度在～106/ml 左右 分装到冻存管
用记号笔在冻存管上加写标识（细胞株号+日期+操作者） 无菌分装到1.8ml 冻存管，装量0.5～1.0ml/支 冻存
重新悬浮 用5×体积的完全培养基悬浮细胞，铺放培养孔或培养瓶内，镜检
培养与观察 用记号笔加写标识，镜检观察 置CO2 培养箱内，培养18～24h后镜检细胞活性
3- 工作总结与评价
细胞冻存操作中影响细胞活性的因素分析 细胞复苏操作中影响细胞活性的因素分析 超低温冰箱使用与维护要点分析
影响保温的因素：门霜和冰块 使用过程中，温度升高到-60℃时必须关闭箱门
2- 细胞复苏操作步骤
准备 超净工作台消毒灭菌，无菌器材准备 准备37℃水浴 明确冻存细胞所在冻存管的存放位置，确认冻存18~24h以上
融化 在水浴中充分搅拌使在～1min 融化彻底
离心去除冻存液 无菌操作，10×体积的培养基稀释，1000rpm6miБайду номын сангаас，去上清，分 散沉淀
谢谢观赏
细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)
细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。
打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
细胞冻存流程
细胞冻存流程细胞冻存是一种常用的细胞保存方法，通过将细胞在低温条件下冷冻保存，以延长其存活时间和保持其生物学特性。
细胞冻存流程主要包括细胞分离、细胞培养、细胞冻存液制备、细胞冷冻保存和细胞复苏等步骤。
一、细胞分离细胞分离是细胞冻存的第一步，需要将目标细胞从组织样本中分离出来。
常用的方法有机械分离、酶消化和抗体磁珠分离等。
机械分离是通过切割、研磨等手段将组织样本分散成单细胞；酶消化是利用特定的消化酶将组织样本中的细胞间连接物质降解，使细胞分离；抗体磁珠分离是利用特定抗体与目标细胞表面抗原结合，再利用磁珠将目标细胞分离出来。
二、细胞培养细胞分离后，需要将目标细胞进行培养，以保证其在冻存前的正常生长和增殖。
细胞培养需要使用培养基、培养皿和培养箱等设备。
培养基是含有营养物质和生长因子的液体，提供细胞所需的养分；培养皿是用于容纳细胞和培养基的容器；培养箱用于提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
细胞培养的时间和条件因细胞类型而异，通常需要进行数代传代，使细胞数量增加到足够的数量。
三、细胞冻存液制备细胞冻存液是冻存细胞时使用的特殊液体，其成分可以保护细胞免受低温和冷冻过程中的损伤。
常用的细胞冻存液成分包括细胞培养基、血清、DMSO（二甲基亚砜）等。
细胞培养基和血清提供细胞所需的养分和生长因子，起到保护细胞的作用；DMSO则具有良好的渗透性，可以减少细胞在冷冻过程中的结晶和损伤。
四、细胞冷冻保存细胞冷冻保存是细胞冻存的核心步骤，需要将细胞与细胞冻存液混合，然后缓慢冷却至低温条件。
混合细胞和细胞冻存液时需要注意细胞密度和液体体积的比例，以保证细胞在冷冻液中的分布均匀。
冷冻过程需要使用特殊的冷却设备，如冷冻容器、冷冻架和冷冻缓冲液等。
细胞冷冻保存的温度通常在-80℃或液氮温度下进行，以确保细胞的长期保存。
五、细胞复苏细胞复苏是将冻存的细胞从低温条件中恢复到正常生长状态的过程。
细胞复苏需要将冻存管或冷冻盒从低温环境中取出，快速解冻，并将细胞转移到预先准备好的培养皿中。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂
一种细胞冻存与复苏的方法及其制备的细胞制剂一、细胞冻存的重要性。
细胞冻存啊，就像是给细胞们找了个超酷的冬眠方式呢。
在生物研究或者医学应用里，细胞可是超级宝贵的资源呀。
有时候我们不能一下子就把细胞都用完，或者要长期保存细胞的某些特性，这时候冻存就派上大用场啦。
要是不冻存好，细胞可能就会死掉或者变异，那之前的努力可就白费了，多可惜呀。
二、细胞冻存的方法。
1. 冻存液的准备。
冻存液可是细胞冻存的关键“小窝”呢。
一般来说，会包含一些保护细胞的成分，像二甲基亚砜（DMSO），它就像是细胞的小棉袄，能保护细胞不受冻害。
然后还有血清，就像是给细胞补充营养的小餐包。
把这些按照一定的比例混合起来，就成了细胞的“冬眠小屋”啦。
比如说，常见的比例可能是90%的血清加上10%的DMSO，当然不同的细胞可能会有不同的最佳比例哦。
2. 细胞的处理。
在把细胞放进冻存液之前，要先把细胞处理好。
先把细胞从培养皿里轻轻吹下来，就像把小宝贝从摇篮里抱出来一样。
然后要数一数细胞的数量，不能太多也不能太少。
太多的话，细胞们在冻存的时候可能会互相挤着不舒服，太少呢，又觉得有点孤单，而且可能会影响以后复苏的效果。
一般会把细胞的密度调整到一个合适的范围，比如说每毫升100万个细胞左右。
3. 冻存的程序。
细胞和冻存液混合好之后，就要把它们放进冻存管里啦。
然后要把冻存管放在一个特殊的容器里，这个容器要慢慢降温。
就像不能一下子把人从夏天扔到冬天一样，细胞也不能突然降温。
一般是先放在4度的冰箱里待一会儿，让细胞适应一下低温，这个时间可能是30分钟到1个小时。
然后再放到 -20度的冰箱里，这里就更冷啦，细胞得再适应一段时间，大概1 - 2个小时。
最后再放到 -80度的冰箱或者液氮罐里长期保存。
液氮罐就像是细胞的超级大冰柜，能让细胞在极低的温度下一直沉睡，等着被唤醒呢。
三、细胞复苏的方法。
1. 复苏前的准备。
细胞要复苏啦，就像要叫醒沉睡的小宝贝一样。
首先要把培养皿准备好，里面放上合适的培养基，就像是给细胞准备好早餐一样。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。
但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。
因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。
细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。
使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。
液氮温度达-19 6℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。
（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
动物细胞冻存和复苏的原则
动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。
下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面：1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。
一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。
此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。
2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。
其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。
而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。
两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。
3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。
在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。
常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。
4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。
5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。
一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。
此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。
6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。
传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。
此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。
7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。
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细胞冻存与复苏步骤
一、细胞冻存步骤
1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。
确保细胞在保存前是健康和活跃的。
2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供
细胞生长和增殖。
3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减
少冷冻过程中对细胞的伤害。
4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。
常见的冷冻介质包
括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。
5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管
或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。
6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。
二、细胞复苏步骤
1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。
培养基
通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。
2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴
中解冻，避免长时间暴露在室温。
3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。
4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。
6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。
1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。
2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。
通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。
3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。
例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。
4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。
液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。
细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。
在未来，随着技术的不断完善和应用的广泛推广，我们可以更好地利用这项技术来促进科学的发展和社会的进步。