亲和膜色谱的研究进展

亲和膜色谱的研究进展摘要：亲和膜色谱又称亲和膜分离，其在生物大分子的分离纯化中作为一种综合性的技术出现在80 年代末。

亲和膜色谱主要优点是克服了颗粒状多孔载体扩散传质阻力大的缺点，代之以对流传质，这样就可以在较低的操作压和较高的流速下对目标物进行快速的分离和纯化，从而缩短操作时间、提高纯化效率。

本文介绍了亲和膜色谱的分离过程，评价了亲和膜基质材料活化、改性方法，给出了配基、间隔臂的选择原则，并简单介绍了亲和膜色谱技术的应用。

关键词：亲和膜色谱、分离过程、膜基质、配基、间隔臂、应用Recent Advances in Affinity Membrane Chromatography Affinity membrane chromatography (AMC) was developed as an integrative technology for the purification of biomacromolecules in the end of 1980s. Affinity membrane are achieved by attaching affinity ligands to the inner suface of the through pores in microfiltration membranes. So the main feature of AMC is the elimination of pore diffusion that exists as themain mass-transfer resistancein conventional column chromatography with porous particles. In an AMC, target products included in a crude mixture can bind to the affinity ligands by passing througe the membrane. Thu，sAMC can be operated at a high flow rate with a low pressure drop, resulting in a large throughput for protein purification. This article reviews the fundamental aspects of affinity membrane chromatography, separating process anidts application. Activating and modifying methods of matrix materials are introduced. The principles of selecting ligands and spacer arms are elucidated.The advances in the theoretical aspect study and trends of AMC are also described.Keywords: Affinity membrane chromatography, membrane matrix, ligand, spacer arm, application1 前言近年来，生命科学和生物工程得到了迅速发展，蛋白、酶、多肽、疫苗等生物制品成本的30%〜60%来自于分离过程。

分离过程的成效已成为生物技术发展的一个重要方面。

这些生物大分子一般都具有生物活性，一旦脱离了它们原来的生理环境，或与某些金属或载体相接处，很容易改变其分子构象，并失去其固有的活性。

它们的热稳定性也比较差，有的需在恒温(如体温)才不变性，有的需在低温（如4C）才能保持其活性。

在用生物技术制取的初产品中，其浓度都较低，因此对它们的浓缩、分离、提取是一个难题。

采用传统的方法和手段，如沉淀、结晶、离心、冻干、萃取等都还达不到所要求的纯度，还必须用色谱、膜分离等手段进一步分离纯化。

80年代末出现了将亲和色谱与膜分离技术结合起来的一项新型的分离技术一亲和膜分离技术⑴。

它利用膜作基质。

对其进行改性，在膜的内外表面活化并偶合上配基，再按吸附、清洗、洗脱、再生的步骤对生物产品进行分离。

亲和膜色谱中料掖以对流方式流过膜孔，溶液中的蛋白质能很快地扩散到配基上，例如Y球蛋白与固载在尼龙膜上的蛋白质A结合速度要比与固载在琼脂糖上的蛋白质A结合快200-300倍⑵。

亲和膜色谱与传统的膜分离、亲和色谱相比，不仅具有纯化倍数高、压降小，分析时间短、生物大分子在分离过程中变性几率小，允许较快的加料速度等特点，而且比柱亲和色谱更易实现规模化纯化分离。

因此亲和膜色谱技术从出现到现在发展迅速，已应用于纯化分离多种酶、蛋白质、单克隆抗体等生物分子。

2亲和膜色谱分离过程亲和膜是亲和色谱及膜分离的结合，亲和膜过程所采用的设备与膜分离所用类似，也是在膜组件如中空纤维组件、平板式组件等中进行，而其操作过程又类似于亲和色谱将样品混合物缓慢地通过膜，使其中与亲和配基有特异性相互作用的分子和配基产生偶合，生成相应的配合物，然后再通过改变条件，如洗脱液组成、pH值、离子强度、温度等，使己和配基产生相互作用的配合物分子解离，将其收集起来，再将膜进行洗涤、再生和平衡，以备下次分离用，如图1[3]。

II赫人分子人B!亲和过程示童图操作时除要选择适宜的加料速度和操作温度外，洗脱方式的选择、洗脱液的组成是分离成败的一个重要因素。

正确洗脱会进一步提高分离的纯度。

反之，甚至会使生物大分子变性失活。

洗脱可分为特异性洗脱和非特异性洗脱。

特异性洗脱就是在洗脱液中加人对配基有更强亲和力的物质，将目标蛋白质置换下来。

而改变缓冲溶液中的盐浓度、pH 值、温度等则属于非特性洗脱。

一般非特异性洗脱经济些，但会导致纯度下降。

若所用的吸附特异性低，如使用基团特异性的配基，采用特性洗脱会提高最终产品的纯度[4]。

3 亲和膜的制备3.1 膜材料的选择理想的亲和膜基质具有的特征是高的孔隙率，大的内外表面积，高的化学、生物、机械稳定性，一定的亲水性，低的非特异性吸附，存在可化学反应的基团，高结合容量，耐溶剂冲洗，成本低，重复性好。

亲和膜基质材料按来源大致可为天然聚合物和合成聚合物，目前研究较多的是纤维素膜、尼龙膜、聚矾膜，聚乙烯中空膜，另外一些可用做亲和膜基质材料的还原聚羟乙基甲基丙烯酸酯( PHEMA)[5-7]、壳多糖[8]甘油基甲基丙烯酸酯与乙二醇二甲基丙烯酸酯共聚物[9]、聚乙烯醇[10]、聚醚脲烷类聚合物Biomer(poly(ether-urethane-urea))[11]、无机膜如玻璃中空纤维膜[12]等。

3.2 配基的选择配基是指底物、产物、抑制剂、辅酶、变构效应物或其它任何能特异地和可逆地与欲纯化的蛋白质或大分子物质发生相互作用的分子[13]。

亲和膜分离的机制就是利用配基与目标分子的特异性相互作用，因此，如果能找到合适的配基，原则上就能对目标物质进行分离了。

配基按其来源可分为两大类天然配基和人工合成的配基，按其特异性又可分为生物特异性配基和基团特异性配基。

生物特异性配基是指利用自然界中特异性相互作用生物物质对之一做配基，如酶一底物、酶一抑制剂、激素五补接受体、抗体一抗原等。

基团特异性配基是指对具有某一类基团或结构的生物大分子均有特异性作用的配基，如氨基酸、蛋白质A、活性染料、金属鳌合离子等天然配基对于一定的生物分子具有内在的生物特异性吸附作用，而合成的配基则经常是通过变换及优化偶合和洗脱条件来实现其特异性作用。

虽然从性能上说，天然配基要优于合成配基，但天然配基的制取和提纯较困难，价格昂贵，而且它们对使用条件的要求也比较苛刻。

因而，实际中用得更多的是量大而又相对便宜的配基，如生物活性染料，由于它可与多种脱氢酶、己糖激酶、碱性磷酸酯酶、羧肽酶、白蛋白等结合，成为目前应用最广的配基。

近年来，以鳌合金属离子为配基的固载化金属亲和色谱 (IMAC )得到发展。

IMAC 的作用机理是：路易斯酸即鳌合的过渡金属离子如Zn( n )、Cu(H )、Ni( n) 作为电子对供给者能和组氨酸、胱氨酸、色氨酸等电子接受体作用[14]。

因此，IMAC 多用于从氨基酸混合物中分离出组氨酸以及考察蛋白质中的组氨酸残基。

相比其它基团特异性配基，IMAC在配基稳定性、容量、活性蛋白质的回收及成本上都比较优越[12]。

3.3 间隔臂的选择配基可以直接固定在基质材料上，但有时候空间效应会影响到配基与生物大分子的作用，这时就要考虑引入间隔臂分子，以提高配基的使用效率。

最普遍的方法就是将通式为NH2(CH2)n R的co-氨烷基化合物与基质偶连，然后在间隔臂上接上配基。

一般认为，为了获得最佳偶合作用，配基与膜之间必须插人至少一个亚甲基的桥。

但如果生物大分子的表观相对分子质量低或与固定配基的亲和性高，则间隔臂长度不如在大蛋白或低亲和系统中要求严格。

最近又有提出采用亲水性更强的间隔臂代替疏水间隔臂，能极大地降低非生物特异性吸附作用[13]。

3.4 亲和膜的制备、活化及偶合亲和膜的制备主要分为3 步：成膜，功能化，活化，按它们进行的先后顺序不同可分为以下几种途径[11](1)膜材料f功能化的膜材料f功能化的膜f活化的膜(2)膜材料f膜f功能化的膜f活化的膜(3)膜材料f功能化的膜材料f活化的膜材料f活化的膜功能化即通过引人适当的基团, 使膜材料或膜改性。

而活化则是使引人的基团活性增强，能与配基作用。

具体采用哪一种途径更好，因材料而异，一般认为，活化在成膜后进行更好一些。

成膜方法和一般的制膜方法一样，主要是采用溶胶一凝胶转化法，也可采用静电纺丝法制得膜。

功能化的方法可以通过一般的化学反应，也可以通过辐射接技引人所需基团，或者在膜表面覆盖一层带基团的涂层。

引入的基团(象经基、酞胺基团)多为亲电性的，使膜更易于与配基或间隔臂上的亲和基团反应。

膜的活化是指用一些双官能团试剂与膜作用。

常用活化法有溴化氰法、环氧法、羰基二咪法等[15]。

活化时应注意，通常活化和配基的偶合同时进行，而配基多为脆弱的生物分子，因此活化时间不能太长；此外配基的泄漏导致产品污染也应予以考虑，尤其是当亲和膜用于分离医药制品时。

理想的活化和偶合应该满足：（1）条件温和，快速、高效并且无副作用地形成稳定的共价键；（2）偶合完成后剩余的活性基团可用简单的方法封闭；（3）所用试剂无毒、便宜，易于工业放大使用[16]。

4 亲和膜色谱的应用蛋白质亲和分离中常用的作用体系有抗原-单克隆抗体，激素- 受体蛋白，核酸-核酸结合蛋白，酶-底物/产物/抑制剂/辅酶，免疫球蛋白-蛋白A/蛋白G,蛋白质-肝素/活性染料/过渡金属离子/肽段等。