碱性蛋白酶产生菌培养分离和酶活力测定
蛋白酶活力测定方法-大肠杆菌生长曲线的测定
实验材料
• 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管； 721分光光度计
• 2.实验试剂 (1) 缓冲液：pH 7.5-8.0的 50 mM Tris-Cl缓冲液。 (2) 2%酪蛋白溶液 (3) 三氯醋酸溶液（ TCA ）：10％ TCA (4) 酪氨酸标准溶液：1000μg/mL；100μg/mL (5) 碱性蛋白酶溶液：发酵液上清夜
➢将被测溶液推入光路，显示器显示为被测样 品的吸光值。
在600 nm波长下，用未接种的LB液体培养 基作空白对照，分别对培养了0、4、8、12、 16和20 h的大肠杆菌培养液，进行光电比浊 测定。对于高浓度的大肠杆菌培养液,要用未 接种的LB培养基进行稀释，使其吸光值不超 过1。
比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润 洗。比色皿的毛面用吸水纸擦干，而光面只 能用吸水纸吸干，以免光面被划破。
➢取出档光体，按100%T/OA键调100%透射 比。
2.样品测定
➢将参比溶液以及被测溶液倒入比色皿中。
➢打开样品室盖，将参比溶液放在样品架的第 一个槽位中，将被测溶液依次放入其它槽位。
➢将参比溶液推入光路，按100%T/OA键调满 度。
➢按 MODE ， 将 测 试 方 式 调 至 吸 光 度 方 式 （A）。此时,显示器显示“0.000”。
• 福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定， 容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的 混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
• 利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白 酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表 示酶活力。
2. 紫外分光光度计法
• 蛋白质、酪氨酸等氨基酸在200～320nm范围内 有光吸收，最大吸收波长在280nm处，故选此波 长作为测定波长。
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物技术班级： 1班姓名：学号：摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。
当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。
作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。
微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。
本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力第一章前言1.1研究的目的与意义蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。
有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。
与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况1.2.1 微生物蛋白酶的分类由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。
当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的
在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变 性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作 中特别注意以下几点：
(1) 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开 始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量 高的材料。
(2) 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫 酸铵在水中溶解度很大（20℃，每升可溶760克）， 并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的 盐。
管号 pNP含量 (mol)
01 2 34567 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
0.5mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
H2O (mL)
0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Na2CO3-NaHCO3 (mL)
酶活力定义为：在37℃下，以2 mmol/L pNPP为底 物，在pH10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L Mg2+的 测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定 为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所 具有的酶活力单位数。
蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂（FolinPhenol reagent）显色法
509.3
4.注意事项
（1）在加硫酸铵时，需事先将硫酸铵粉末研细。加 入过程需缓慢并及时搅拌溶解。搅拌要缓慢，尽 量防止泡沫的形成，以免酶蛋白在溶液中表面变 性。
（2）测活时可以将待测定的试管置于试管架放入水 浴锅中预热及反应。
（3）紫外分光光度测定需用石英杯。 （4）稀释倍数 （5）移液器的使用
(3) 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至0.35饱 和度（100 mL加入20.9 g）。缓慢加入，不断搅 拌溶解，置冰箱静置1 h。
碱性蛋白酶产生菌的筛选
文章编号:1001-3717(2006)01-0070-03碱性蛋白酶产生菌的筛选3李树文,陆秀华,尚海利(莱阳农学院生命科学院,山东青岛266109)摘要:本试验从5份土壤中共筛选出产碱性蛋白酶菌株9株,即SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10、SHL-8、SHL-11、SHL-12、SHL-18、SHL-20,其中SHL-4、SHL-6、SHL-7、SHL-10产酶效果较好;采用正交试验设计,初步地确定了菌株SHL-4产酶培养基组分,即蛋白胨0.5%、牛肉膏1.5%。
关键词:碱性蛋白酶;筛选;菌株中图分类号:Q939.97文献标识码:AScerrning R ning of Alkaline Protease Producing StrainsL I Shu2wen,L U Xiu2hua,SHAN G Hai2li(Life Science College,L AC,Qingdao266109,China)Abstract:Nine st rains producing alkaline p rotease were screened out f rom five soil samples,namely SHL-4、6、7、10、8、11、12、18、20,SHL-4、6、7、10of which wit h high protease activity.Through an or2 t hogonal test,t he p roducing protease cult ure medium of t he SHL-4st rain was confirmed preliminarily, namely0.5%of pepto ne,1.5%of beef ext ract.K ey w ords:alkaline protease;screening;st rain 碱性蛋白酶是指在碱性的条件下具有活性,能够水解蛋白质肽键的酶类。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
碱性蛋白酶技术参数
蛋白酶可以分为很多种，其中一种就是碱性蛋白酶，由于具有较强的分解能力，因此被广泛应用于食品、酿造、洗涤、丝绸等行业。
有关企业在选择这个产品的时候需要对其技术参数信息做好详尽的了解。
碱性蛋白酶也就是碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，相关的技术参数如下：
【别名】地衣芽胞杆菌蛋白酶，2709碱性蛋白酶，地衣杆菌蛋白酶
【酶活定义】在40℃，PH10.5条件下，每分钟水解酪素产生1ug酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位，以u表示。
【产品规格】5-160万u/g，可根据客户要求生产不同规格的产品。
【应用条件】最适PH值：9-12 最适温度：40℃--55℃
【产品用途】
1、皮革脱毛原料皮→水洗→脱脂→碱膨胀→拔毛→剖层→脱碱→酶脱毛→水洗→浸酸→鞣制。
酶脱毛具有简化物产工序，缩短周期，提高成品质量，增加
得革率，降低生产成本，改变劳动成本与环境卫生，变污水为肥等优点。
2、食品加工应用于食品行业动植物蛋白质的水解，生成多肽或氨基酸，形成具有独特风味的蛋白质水解液，被广泛使用在调味液和保健品行业当中。
3、日化行业将蛋白酶加入洗衣粉、洗涤剂等洗涤用品中，能大幅度提高洗涤去污能力，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢, 也可作医用试剂清洗生化仪器等，具有独特的洗涤效果。
以上就是对于碱性蛋白酶相关的产品信息介绍了，由于每个厂家生产的碱性蛋白酶型号不同，技术方面的信息可能总结的不全面，建议大家找到产品厂家做详细的了解。
富集培养基
摘要关键词碱性蛋白酶酶活测定菌筛选1 引言2 文献综述2.1 碱性蛋白酶概述2.1.1概述2.1.2碱性蛋白酶的性质2.2 产碱性蛋白酶菌的概述2.3微生物碱性蛋白酶应用与研究现状2.3.1国外研究2.3.2国内研究2.4 酶活测定原理2.5 本文研究内容3 材料与方法3.1 材料3.2 实验方法1、引言碱性蛋白酶(Alkaline Protease ) 是一类适宜于在碱性条件下水解蛋白质肽键的酶类,是一类非常重要的工业用酶,广泛存在于动、植物及微生物生物体中,在猪的胰脏中最早被发现。
1945年瑞士Dr Jaag等人在地衣芽孢杆菌(B acillus li cheniform is) 中发现了碱性蛋白酶。
有数据显示, 全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元, 在所有的工业用酶制剂中75% 是蛋白水解酶,而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类, 大约占全世界每年总销售量的60% 左右。
碱性蛋白酶作为工业催化剂已广泛应用于制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业, 尤其是作为无磷洗衣粉的添加剂应用广泛。
但洗涤剂用碱性蛋白酶要求其在广泛的pH和温度范围内保持较高的酶活力和稳定性, 同时还必须与含有多种氧化剂、鳌合剂和表面活性剂的洗衣粉相融合。
而目前, 在工业应用中的很多碱性蛋白酶存在弊端, 例如在表面活性剂、氧化剂、热稳定性、酸碱稳定性方面及培养基成本较高等。
因此, 寻找一种能分泌具有良好酶学特性并适用大规模工业生产的碱性蛋白酶高产菌种, 具有重要的理论意义和应用价值。
而且由于微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速, 具有动植物蛋白酶所具有的全部特性, 同时易于实现工业化大批量生产，产生可观经济效益。
并且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力, 有较大耐热性, 有一定的酯酶活力。
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定
碱性磷酸酶的提取分离和比活力的测定碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化酸性环境下的磷酸酯水解反应，在多种生理过程中发挥重要作用。
其提取分离和比活力的测定具有重要的科学研究价值和应用前景。
一、碱性磷酸酶的提取分离1、组织样品制备将待提取的组织放入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），用高速离心离心3-5分钟，去除上清液并加入1mL磷酸盐缓冲液，在实验台上加入玻璃珠或石英砂，放入冰箱冷冻器中。
2、细胞裂解将组织经过粉碎的样品加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4），放入研钵中，加入冰冷甲醇，研磨5-10分钟。
将打磨液离心分离，上清液用分液漏斗收集，加入等量的0.1mol/L四乙基铵溶液，静置20分钟，收集上清液并加入2.5%聚乙烯醇。
3、沉淀和提取将沉淀后的样品中加入氯仿等有机溶剂，轻微摇动，分离出沉淀，将上清液倒入烧瓶中，并用氯仿洗涤，收集洗涤液后将其合并，加入甲醇进行沉淀，离心分离，去除上清液，加入2-3倍体积的丙酮，静置反复冲洗多次。
将沉淀中加入适量的溶解液，摇混均匀，转移至离心管中，并用离心机转速2800r/min/5 min。
二、碱性磷酸酶的比活力测定1、酶活性试验体系将提取分离后的活性酶样品用注射器加入已配制好的酶活性试验体系中，包括10mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）、1 mM EDTA缓冲液、2 mM酚酞液、0.1M NaCl等，总体积为2ml。
2、样品处理制备所需要的各种试剂和标准品，并制备好标准品不同浓度的稀释液。
将稀释后的酶样品取1ml，加入酶活性试验体系中，并在无酶样品控制下，以相同的温度下逐渐加入不同的底物溶液，如α-萘酚磷酸钠。
注意不要影响反应溶液 pH 值和终点的颜色产生，以免误诊。
3、反应终止在反应末期，可以加入固定量的0.1N NaOH终止反应，并使用p-酚酸作为对照品和标准品进行比较或质控，并测定比活力。
综上所述，选择合适的方法提取分离和测定碱性磷酸酶的比活力对于进一步探究其在生理过程中的作用机制以及相关疾病的诊断和治疗等方面具有重要的意义。
测蛋白酶酶活力
预处理取一定量活蚯蚓,水洗数次,尽最大可能使其内脏中的污物排出,大约需1 h。
然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分,称重,加2.5倍体积, pH7.0的0.01 mol·L Tris-HCl于匀浆器内匀浆5 min 后于4℃冰箱中静置4 h,用低温冷冻离心机于4℃条件下10000 r·min-1离心20 min,弃去沉淀,取上清液。
1.配制干酪素称取干酪素1g加入0.1mol/L氢氧化钠10ml在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸)，然后用0.05mol/L pH7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制定容至100ml即成。
配制酪蛋白溶液定容时，若泡沫过多，则可加1-2滴酒精消泡。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存。
否则极易繁殖细菌，引起变质，有效使用期三天。
2.标准酪氨酸溶液准确称取在烘箱中恒温至恒重的L-酪氨酸0.1g，逐步加入1mol/L盐酸（约50-60ml）,加热至溶解后，用去离子水定容至100ml，即为1mg/ml的酪氨酸溶液。
放入冰箱中保存。
使用时吸取1mg/ml的酪氨酸溶液10ml，用去离子水定容到100ml,即为100ug/ml的L-酪氨酸标准溶液。
该溶液贮存于冰箱内保存或及时使用。
以上各种缓冲液均需要用pH计较正。
3.标准曲线的绘制配制不同浓度的酪氨酸标准溶液(0、10、20、30、40、50、60、70、80ug/ml)，用分光光度计(275nm,石英比色皿)分别测定其吸光度(以不含酪氨酸的管为空白)。
以吸光度A275nm为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
4.将匀浆液离心（10000rpm,5min）,取上清液作为待测酶液5.测定步骤先将1%的酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴中，预热5min。
按下列程序操作试管A(空白) 试管B（酶试样）↓↓加酶液2.00ml （以0.05mol/L pH7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制）↓（40±0.2）℃，2min ↓（40±0.2）℃，2min加0.4M三氯乙酸4.00ml（摇匀）加1%酪蛋白2.00ml（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min ↓（40±0.2）℃，10min加1%酪蛋白2.00ml（摇匀）加0.4M三氯乙酸4.00ml（摇匀）↓↓静置10min，离心或过滤静置10min，离心或过滤↓↓于275nm波长，用石英比色皿，测其吸光度于275nm波长，用石英比色皿，测其吸光度6.酶活的计算方法酶活力单位的定义：1ml酶液在40℃,pH 7的条件下，每分钟水解酪素产生1ug酪氨酸所需的酶量定义为一个活力单位。
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碱性蛋白酶产生菌培养分离和酶活力测定
作者：段毓佳鲁良石达毛爽
来源：《农家科技下旬刊》2018年第05期
摘要：筛选出4种可以产生碱性蛋白酶的菌株，分别编号1，2，3，4，通过菌株的生长情况，菌落的特征等这4种菌株进行分离，进步的纯化，制备酶活力测定的标准曲线。
4种菌株在25℃条件下，酶活力有大有小，最大的为168um/min左右，最小酶活力在21um/min左右。
关键词：碱性蛋白酶；培养；分离；酶活力
碱性蛋白酶是指PH在9-11的碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶类，由于其活性中心含Ser，故属于丝氨酸蛋白酶。
有数据显示，全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元，在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。
碱性蛋白酶在食品，洗涤、丝绸、饲料、医药、环保以及制革等行业中，有着广泛的用途，因此具有很强工业与经济价值。
由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快捷，具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性，有一定的酯酶活力。
因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。
一、实验
1.菌株及其培养基。
菌株的获得：从邢台学院餐厅附近的垃圾池旁收集土壤。
牛肉膏蛋白胨斜面培养基：牛肉膏 3g，蛋白胨10g，NaCl5g，1000ml水，PH值7.4-7.6；酪蛋白培养基：酪蛋白
2.5g，酵母膏5g，琼脂10g，500ml水，PH 值9.0；
种子培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏2.5g，NaCl2.5g，500ml水，PH 值9.0；发酵培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏25g， K2HPO4 5g，MnSO4 20g，500ml水，PH 值9.0。
2.仪器。
三角瓶，高压灭菌锅，培养皿，试管，酒精灯，烧杯，电炉，滤纸，漏斗，玻璃棒，生化恒温培养箱，震荡培养箱，电子天平，722型可见分光光度计。
3.方法
（1）菌株的培养。
将少量取样的土壤加入无菌水进行稀释，混匀，静置，之后再进行取少量上层清液分别稀释100倍，用滴管吸取少量的稀释液在酪蛋白培养上滴加一滴，然后用玻璃环在培养基上涂布，25℃恒温培养48h。
挑取产生透明圈的菌株在酪蛋白培养中进一步纯化，同时进行平板划线25℃培养，和接种到斜面培养基保存。
根据平板划线菌株生长的情
况，选取适宜的菌株进行振荡培养。
分别挑取平板划线培养基上的菌，接种到种子培养基上进行震荡培养48h。
（2）菌株的分离。
将经纯化分离得到的菌株，点种于酪蛋白培养基中，进行初步酶活力测定，根据点种菌株的情况，分别记录4种菌株的情况。
（3）菌株产生酶的活力测定。
将分离得到的适宜菌株接种到100ml左右种子培养基中，28℃振荡培养24h，以5%的接种量接种到发酵培养基28℃振荡培养48h，发酵液3000r每分钟，离心15min，取上清液，采用Folin-酚法测定蛋白酶活力。
（4）标准曲线的制定。
取6支试管，标号按照下面的配比操作，加入5ml碳酸钠溶液及0.5mlFolin-酚试剂，迅速混匀，于40摄氏度恒温水浴中显色20min，取出后用流水冷却，在分光光度计上以1号管为对照测定各管的吸光度（A680），以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
二、结果和分析
1.菌株的筛选。
经酪蛋白培养基培养后，在培养基上产生明显透明圈的只有4种菌株，将其编号为1，2，3，4号，据测量发现菌株2和3的D/d值比较大，同时也比较接近，而菌株1和4的D/d值比较小，菌株的比值最大。
2.菌株分类。
菌体特征：表面褶皱，扁平而大白色；表面光滑，小也有突起淡黄色；表面相对光滑，高耸而大黄色；菌落边缘褶皱，高耸而大白色
3.菌株酶活力的测定。
由多组数据点0.165，0.213，0.464，0.406，0.772等得出标准曲线的方程式：y=-0.036+0.0147x、25度下各菌株酶活力测定结果如下。
三、结论与讨论
从富含蛋白质的土壤中分离出来的4种菌株都具有产生碱性蛋白酶的能力，并对它们各自的菌落特征进行记录。
经测定25度下各菌株酶活力，得知酶活力的强弱。
通过实验可以获得酶活力比较高的菌株，但是还是不能满足工业等生产的实际应用。
参考文献：
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通讯作者：唐蕊（教授）。