蛋白印迹——western blot 实验流程及注意事项
Western Blot技术详细操作步骤
Western Blot技术详细步骤蛋白质印记（Western Blot）是一种常用的生物技术，用于检测特定蛋白质在细胞提取物中的存在。
Western Blot基本步骤如下：1. 准备样品和设备：收集细胞或组织样品，然后使用适当的细胞裂解缓冲液将细胞破碎。
前处理样本并测定蛋白质浓度。
准备凝胶电泳设备，包括聚丙烯酰胺凝胶和Tris-glycine SDS运行缓冲液。
2. 凝胶电泳：将处理好的样品与样品缓冲液混合并加热，然后将其加载到凝胶孔中。
接着将预染蛋白质分子量标记也加载至凝胶中。
开始分子量依赖的电泳，使蛋白质在凝胶中分离。
3. 转印：将蛋白质从凝胶转移到结构更加稳定的膜载体，如聚偏氟乙烯 （PVDF）或者硝酸纤维素膜。
使用电转印或半干转印设备进行转移。
4. 封闭：为防止非特异性结合，使用5%无脂奶粉或BSA溶于TBST （Tris-缓冲的盐水加Tween 20）在膜上进行封闭。
一般封闭时间约为1小时，根据实验需求可调整。
5. 第一抗体孵育：将特异性的一抗稀释 （通常为多克隆或单克隆抗体），然后在封闭液中孵育膜。
根据抗体浓度与孵育时间进行相应优化。
6. 清洗：使用TBST清洗膜，以去除未结合的一抗。
通常需要清洗3次，每次5-10分钟不等，避免一抗非特异性结合。
7. 第二抗体孵育：将标记有荧光或酶的二抗稀释后，再次孵育膜。
封闭液中的二抗通常是与一抗长在不同宿主动物中的特异性抗体。
孵育时间需要优化。
8. 清洗：再次清洗膜，以去除未结合的二抗。
重复步骤6的清洗方法。
9. 检测：将膜放入检测设备中，如化学发光仪、荧光扫描仪等。
等待信号产生并记录结果。
测定蛋白质相对表达量的强度并进行定量分析。
10.数据分析：使用图像处理软件进行定量分析，如ImageJ等软件，并进行归一化处理，一般以内参蛋白（如β-actin, GAPDH等）数据为基准。
以上就是蛋白印记的基本操作步骤，具体细节及操作条件可能因实验室环境和试剂不同而有所差异。
western blot 实验原理及操作
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。
而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程：蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织（需磨碎）、特殊细胞（切割下来的肿瘤细胞）等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种，RIPA适用于细胞质中蛋白检测，而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等，非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分，3、样品缓冲液sample buffer备注：1、样品应保持低温，且实验过程应低温操作，此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致，故需要匀浆，打断DNA。
一般不用超声，因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1：1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中，以充分变性蛋白。
配胶：胶的主要成分为丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
4、分离胶的配方：以20ml的8﹪分离胶为例：5、浓缩胶配方：6ml为例备注：1、制胶是避免产生气泡，空气会影响胶的聚合，在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS，每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净，与制胶板压紧，避免漏胶。
5、制胶时，加水应缓慢不要破坏胶面，其作用：可以平衡胶面，赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净，有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
Westernblot实验技术培训课件
5. 抗体浓度过高
4. 杂交前检测一抗、二抗的
工作浓度
Westernblot实验技术
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没有阳性条带或比较弱
原 1. 抗体染因色不充分
2. 靶蛋白含量太低 3. HRP抑制剂 4. 转膜时间不够 5. 曝光时间过短
1. 增加抗体滴度，延长孵育
时间
2. 增加样本上样量
对 3. 所用溶液和容器中避免含
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条带比正常的窄？
“微笑”或“倒微笑” 条带？
➢ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合 均匀，动作轻缓
➢ 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心， 以免把上样带扭曲
➢ 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致 宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度
➢ 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应 赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否 合适
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合3
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备
SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Westernblot实验技术
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蛋白样品的制备
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裂解液
➢ 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 ➢ 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 ➢ 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS)
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Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
快速、特异，信号弱、昂贵 Westernblot信实验号技术强、二抗选择多，非特异性结合30
westernblotting实验操作步骤
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。
以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。
Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。
4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。
western_blot
设立对照样品 为了验证凝胶电泳及转膜正常进行，检测样品应同时与阴性对照和阳性对照同时进 行凝胶电泳和转膜。
膜的选择 常用的转移膜主要有PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride）和硝酸纤维素膜。PVDF 膜与目的蛋白的结合能力高，灵敏度高，不易破碎，同时也适用于再次标记 (Reprobing)（PVDF膜使用前需浸泡在甲醇中仪增加膜的亲水性）。而硝酸纤维素 膜虽不需要浸泡但极易破碎。
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③ 封闭前的注意事项
膜标记好正反面 转膜后有时会分不清膜的正反面。凝胶电泳时使用有色分子量Marker或转膜后可在 膜上稍微剪断一个角（可自由决定剪断方向）。
封闭剂的选择 有时特定的封闭剂达不到预期的封闭效果。另外封闭时间过长会抑制抗原抗体反应及 标记抗体的酶活性，应准备几种封闭剂进行点杂交预研讨实验选择合适的封闭剂。
目的蛋白质量较差
IB RD 增加蛋白电泳量。
抗体量不充分 标记抗体失活
IB RD
有可能目的蛋白对应的抗体亲和性较弱。提高抗体浓度。 抗体活性有可能下降。Dot blot试验确定抗体活性。
使用不含有叠氮化钠的抗体。叠氮化钠阻碍HRP活性。
发光底物劣化
调查底物活性。可以少量调制working solution，暗室内加入少量HRP标识抗体观察是否有蓝光出 现。如果没有蓝光出现，说明底物或HRP标识抗体已经劣化。 注意装有试剂的瓶子不要出现污染。保存的底物试剂与其他试剂混合，也有可能导致底物劣化。
① 电泳前的注意事项
凝胶的选择 如果已知目的蛋白的分子量，选择的分离胶浓度应使蛋白质的迁移位置在中央。如 果是未知分子量的蛋白质样品，使用梯度凝胶。
Western blot实验技术全攻略!附详细操作步骤
随着生物学领域的不断发展，Western blot（蛋白质印迹）实验技术已成为研究蛋白质表达和相互作用的重要手段。
本文将为大家提供一份Western blot实验技术全攻略，附详细操作步骤，希望对大家的科研工作有所帮助。
Western blot实验技术全攻略第一步：制备样品Western blot实验需要使用蛋白质样品，因此首先需要制备样品。
一般来说，可以从细胞、组织或生物液中提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多种，例如细胞裂解、超声波破碎、切片法等。
提取后的样品需要通过蛋白质定量方法确定蛋白质的浓度。
第二步：电泳分离蛋白质将制备好的样品经过蛋白质电泳分离，将蛋白质分离成不同的带状条带。
电泳分离可以采用SDS-PAGE或非变性PAGE方法。
SDS-PAGE适用于大多数蛋白质，这种方法可以将蛋白质分离成不同的分子量带状条带。
非变性PAGE则适用于大分子蛋白质和蛋白质复合物的分离。
第三步：转移蛋白质将分离好的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上。
转移蛋白质可以采用湿式电转移或半干式电转移方法。
湿式电转移适用于小分子蛋白质的转移，而半干式电转移则适用于大分子蛋白质的转移。
第四步：阻断和孵育将转移膜放入含有牛血清白蛋白（BSA）或非脂类干奶粉的TBST中，进行阻断。
然后将膜孵育于含有一定浓度的一抗体的TBST中，以便与目标蛋白结合。
第五步：检测和成像将膜孵育于含有适量的二抗体的TBST中，以便与一抗体结合。
二抗体通常被标记为辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。
在使用HRP的情况下，将膜浸泡在ECL底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
在使用AP的情况下，将膜浸泡在BCIP 和NBT底物中，然后用射线或荧光成像系统观察蛋白质的信号。
下面是Western blot实验的详细操作步骤：1. 蛋白质提取：将待测样品（如细胞、组织等）进行裂解，以获得蛋白质样品。
2. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品进行电泳分离，以分离不同大小的蛋白质。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
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蛋白印迹——Western blot
实验流程及注意事项
各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外，特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上，然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法（如蛋白氨基端序列分析等）鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
实验步骤
1.配制分离胶5ml（配方见图1）；
2.将液体用1ml移液器加入玻璃板（从玻璃板的边缘加入，速度适中，尽量不
要产生气泡）；
3.用去离子水压胶（利用重力作用把胶压平，否则如果有气泡，胶就不平了，
影响电泳效果。
注意上面盖一保鲜膜，防止液体挥发）；
4.大约1小时后（也可以第一天晚上配好分离胶过夜，第二天一早配制堆积胶），
配制堆积胶1ml。
5.倒掉玻璃板上面的水并用滤纸吸干，加入堆积胶，并插入梳子；
6.约1小时后堆积胶凝固，把玻璃板转移到电泳装置并加紧（防止漏液）；
7.将电泳装置内加入电泳缓冲液并观察是否漏液；
8.拔掉梳子，用微量注射器冲洗上样孔，加入和上样缓冲buffer混合变性的蛋
白；①蛋白上样量：20-50μg；②上样缓冲液：加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×；③上样最大体积：根据梳子孔径和玻璃板的距离而定，一般我们用的上样最大体积在30ul左右；④蛋白变性：上样前要将样品于沸水中煮5-10min 使蛋白变性。
可以使用PCR仪进行变性，99℃5分钟，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：a. EP 管容易炸开，样品丢失；b. 容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量；
9.在电泳槽中加入电泳缓冲液；
10.恒压80V 30分钟，100V 2小时左右，溴酚蓝跑到底即可（电泳时间可以根
据自己目的蛋白的具体条件设置，一般4～5 h，电压为40V 较好，也可用60V。
）；
图1 配胶说明液体配制
二、转膜
1. 用marker笔在玻板画线标记目的蛋白的位置；
2. 将玻璃板撬掉剥胶（撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲。
）；除去小玻璃板后，切胶并放于电转缓冲液中。
3. 用带有刻度的直尺量出目的蛋白胶的长宽；
4. 剪PVDF膜，大小与胶的大小一致；
5. 把剪好的PVDF膜激活：①放于甲醇15秒；②放于去离子水2分钟；③放于电转液3分钟；
6.剪滤纸，滤纸长宽比膜各小2mm，并放于电转液中；
7.组装转移“三明治”：①硬质海绵充分在电转液中浸泡，挤出里面的气泡；②转移支架底部为黑色，并将1块硬质海绵放于上面；③放置滤纸，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；④放置凝胶，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑤放置PVDF 膜，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑥放置滤纸，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡；⑦放置硬质海绵，并用玻璃棒来回滚压以去除气泡。
8. 将组装好的“三明治”固定在转移支架中，然后放到转移装置中，黑对黑，白对红，并放好降温装置，加满电转液；
9. 将电转装置放于冰盒中，盖好盖，250mA 1小时。
（1. 实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块硝纤膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。
当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。
如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4 度下12V转膜过夜；2.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件；3. 转膜时电极方向注意是膜正胶负。
）
如果要判断转膜效果，有两种方法：①对转移后的凝胶进行考马斯亮蓝染色或银染；②对转以后的PDVF膜进行丽春红染色。
特别注意：膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教。
液体配制
三、免疫反应
1. 打开电转装置并在膜上剪角标记蛋白面。
将膜移至含有封闭液的平皿中，蛋白面朝下，室温下脱色摇床上摇动封闭1h；
2. 将一抗用奶粉稀释至适当浓度；把平皿中的封闭液用1ml移液器吸出，并加入一抗；室温下脱色摇床上摇动1h，4℃过夜（或37℃孵育1-2h）；第二天在冰箱中取出平皿，室温下脱色摇床上摇动1；回收一抗（可以反复用3次），用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；
3．同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，37℃孵育1～2h 后，用TBST 在室温下脱色摇床上洗3次，每次5min；进行化学发光反应。
液体配制
四、化学发光
1. 设置成像装置，调整好焦距与清晰度；
2. 设置成像装置，调整到WB成像模式；
3. 配制ECL发光剂（看说明书）；
4. 在滴加发光剂于膜上，并设置成像装置成像。
五、对膜进行二次免疫反应
1. 用洗脱液洗脱膜上的抗体，2次，每次10分钟；
2. 用PBS洗膜2次，每次10分钟；
3. 用TBST洗膜3次，每次5分钟；
4. 室温奶粉封闭1-2小时，后面步骤同前。