食品毒理学实验指导
食品毒理学实验基础课件
• 在急性非致死性毒性试验中，可应该得到急性可观察到有害
作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量(NOAEL)
。
• 在亚急性、亚慢性及慢性毒性试验中，可得到相应的LOAEL和 NOAEL。
• 在致突变、致癌和致畸等特殊毒性试验中，剂量-反应(效 应)研究将为确定受试物是否具有这些特殊毒性提供依据。在致畸
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第二个原则是实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人 潜在危害的必需的和可靠的方法。
• 毒理学试验中，一般要设3个或3个以上剂量组，以观察剂 量-反应(效应)关系，确定受试化学物引起毒效应及其毒性参数
。
• 引起毒效应的最低剂量(LOAEL)与人的暴露剂量接近时，
说明该化学物不安全。当该剂量与人的暴露剂量有很大的 距离(几十倍，几百倍或以上)，才认为具有一定安全性，此距离
NOAEL外，还可获得“观察到有害作用的最小剂量（LOAEL）”
。
•
亚慢性毒性试验一般选择2种动物（大鼠和狗），采用与
预定实际接触相一致的染毒途径（常为经口途径）。
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• 慢性毒性试验
•
除了实验期限超过3个月以外，长期或慢性毒性
试验的进行在其他方面都类似于亚慢性实验。慢性毒
性试验染毒期间对啮齿类一般为6个月至2年的时间
，对非啮齿类通常为1年甚至更长。染毒持续时间
在某种程度上取决于人类实际接触时间。
•
目的是评价化学物的蓄积毒性。
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• 致突变试验
• 致突变作用是化学物引起细胞核遗传物质发生改变的能力 。这种改变是可以通过细胞分裂传递给下一代细胞的。突 变可以发生于两种类型的细胞，产生本质上不同的后果。
食品毒理学实验详细资料整理
级 别
要
求
I 级
Ⅱ级 Ⅲ级
普通动物，应没有传染给人的疾病
清洁动物，除I级标准外，种系清楚，没有该动物特有的疾病 无特定病原体动物(SPF)，除Ⅱ级标准外，动物为剖腹产或子宫 切除产、按纯系要求繁殖，在隔离器内或层流室内饲养，可有不 致病细菌丛，没有致病病原体 无菌动物，在全封闭无菌条件下饲养的纯系动物，动物体外不带 有任何微生物和寄生虫(包括绝大部分病毒)
实验动物的标记方法对啮齿动物常用染色法，可用苦味酸 (黄色)、品红(红色)的酒精饱和溶液在动物被毛上染色。 对啮齿动物还可用剪耳法标记。 对狗等大动物一般用挂牌法。 剪毛、拔毛、剃毛、脱毛（如硫化钠或硫化钡）
5.实验动物被毛去除方法
6.实验动物的麻醉
4.1.2.2 实验动物的处理
2. 实验动物的抓取和固定方法
4.2 食品毒理学试验的设计原则
4.3 毒理学试验结果处理和分析
本章学习目的与要求
掌握实验动物的选择原则和方法； 熟悉实验动物的常规处置、染毒方式、采样和 处死方法； 了解常用实验动物外貌、生活习性、生长发育 和解剖生理特征。
掌握食品毒理学实验设计基本原则；
熟悉毒理学试验结果处理和分析方法。
4.1.2.1 实验动物的选择——选择原则
相容或相匹配原则：设计动物实验时，选用的动物
质量等级要与实验设计、实验条件、实验者技术、
方法、试剂性能相匹配。
可获得性原则：在不影响实验质量的前提下，选择 最易获得、最经济、易饲养管理的动物。 重复性和均一性原则：选用标准化的实验动物。杜 绝使用随意交配而来的杂种动物和未经任何微生物 控制的非标准化动物。
第七章 食品毒理学实验基础.ppt
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一、常用实验动物特征 ➢实验动物特点
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一、常用实验动物特征
常用实验动物生物学和生理学参数表
参数
小鼠
大鼠
豚鼠
兔
成体体重(kg)
0.035
0.45
0.43
3.7
平均寿命(年)
1.5
3
4~5
8
水消耗(ml/d)
6
35
145
23
二、实验动物的选择和处理
个体差异，应注意实验动物的个体选择。重点是动物的性别、 年龄、体重、生理状态和健康状况。
初次试验的受试物，应该采用两种性别。
动物年龄取决于试验的类型。
– 急性试验----成年动物；
– 慢性试验-----较年幼或初断乳动物，以使实验周期能复盖 成年期。
– 常以动物体重粗略地判断动物的年龄。
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一、常用实验动物特征 ➢实验动物特点
具有较小的个体差异，较强敏感性，较好 的重复性与较一致的反应性。
一些遗传背景不清楚，携带病原微生物不 明确，健康状况及个体差异较大，反应性 不一致，一般不作为实验动物，其所取得 的数据不被科学界所公认。
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血压mmHg(收缩/舒张) 120/75
130/90
77/50
110/80
出生体重(g)
1.5
5~6
75~100
100
断乳时体重(g)
10-12
40-50
250
100-1500
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食品毒理学试验的三个原则
食品毒理学试验的三个原则
在食品毒理学试验中，有三个重要的原则需要遵循，它们分别是随机化原则、对照原则和重复原则。
这些原则保证了试验的严谨性和科学性，从而使得试验结果更具有参考价值。
随机化原则
随机化原则是指在试验中，受试对象应随机分配到不同的组别或处理中，以确保每个组别的样本量、性别、年龄等因素均等，减少试验误差。
这样可以保证每个受试对象都有同等的机会接受不同的处理，从而避免了人为因素和偶然因素的影响。
对照原则
对照原则是指在试验中设立对照组，以评估试验处理对受试对象的影响。
对照组和试验组在除处理因素之外的其他条件上应保持一致，以便更好地观察试验处理对试验结果的影响。
通过设立对照组，可以有效地排除非处理因素的影响，从而更准确地评估处理因素的效果。
重复原则
重复原则是指在试验中应多次重复试验，以增加试验结果的可靠性和稳定性。
重复试验可以减少随机误差和系统误差的影响，提高试验的精度和可靠性。
同时，还可以通过统计方法对试验结果进行进一步的处理和分析，得出更准确的
结论。
总之，随机化原则、对照原则和重复原则是食品毒理学试验中必须遵循的重要原则。
这些原则保证了试验的科学性和严谨性，从而使得试验结果更具有参考价值。
在进行食品毒理学试验时，必须严格遵守这些原则，确保试验结果的准确性和可靠性。
食品毒理学 第五章 外源化学物的一般毒性作用
第五章外源化学物的一般毒性作用一般毒性⏹又称为系统毒性、基础毒性⏹指外来化学物在一定剂量、一定接触时间和接触方式下对试验动物产生的综合毒效应。
⏹根据接触毒物的时间长短分为急性毒性亚慢性毒性慢性毒性⏹根据毒物接触时间长短所进行的观察和评价毒效应的试验分为急性毒性试验亚慢性毒性试验慢性毒性试验第一节急性毒性作用一、急性毒性概述1、急性毒性 (acute toxicity)概念是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的快速剧烈的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。
最主要观察指标 LD。
50概念理解⏹“一次”的含义具有时间性实验动物接触化学物的方式或途径不同，其含义不同。
经口、注射方式染毒：瞬间将化学物输入实验动物体内；经呼吸道或皮肤接触：在一个特定的期间内实验动物持续接触受试化学物的过程⏹毒性中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化学物的质与量不同而异外源性化学物的急性毒性急性食物中毒。
2、急性毒性试验的目的1.测试和求出受试化学物的致死剂量(通常以LD为主要参数)，并对该外源化学物进行急性毒性50分级2.通过观察动物中毒作用表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量－反应关系和对人体产生损害的危险性3.为亚慢性及慢性毒性试验研究以及其他毒理试验提供接触剂量和观察指标选择的依据4.为毒作用机理研究提供线索，了解中毒效应的特征（包括症状的、生理的、生化与组织病理损伤）5.研究化学物急性中毒诊断、预防和急救治疗措施急性毒性试验可以得到的毒性参数：二、急性毒性试验试验设计要点⏹实验动物选择⏹设计各个剂量组动物数及试验动物分组⏹实验环境的确定⏹分剂量组⏹试验动物染毒方法⏹确定试验周期和观察指标(一)试验动物[原则]：①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。
②动物易于获得、价格较低③品系纯化④易于饲养，繁殖生育力较强（数量保障供应）等常用大白鼠、小白鼠1．试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。
食品毒理学
食品毒理学（food toxicology）研究食品中外源化学物的性质，来源与形成，它们的不良作用与可能的有益作用及其机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品的安全性的科学。
食品毒理学的作用就是从毒理学的角度，研究食品中可能含有的外源化学物质对食用者的毒作用机理，检验和评价食品（包括食品添加剂）的安全性或安全范围，从而达到确保人类的健康目的。
第一章绪论第一节食品毒理学概述食品除了含有人体必需的营养物外，也可能含有身体非必需的甚至有害生物或化学物质，后者总称为外源化学物(xenobiotics) 。
外源化学物是在人类生活的外界环境中存在，可能与机体接触并进入机体，在体内呈现一定的生物学作用的一些化学物质，又称为"外源生物活性物质" 。
毒理学的一个基本原则和首要目的就是要对毒性进行定量。
1.学科内容食品毒理学的基本概念和食品外源化学物与机体相互作用的一般规律；食品外源化学物毒理学安全性评价程序和危险度评价的概念和内容；食品中各主要外源化学物（天然物、衍生物、污染物、添加剂）在机体的代谢过程和对机体毒性危害及其机理。
2.学科任务研究食品中学物的分布、形态、及其进入人体的途径与代谢规律，阐明影响中毒发生和发展的各种条件；研究化学物在食物中的安全限量，评定食品的安全性，制定相关卫生标准；研究食品中化学物的急性和慢性毒性，特别应阐明致突变、致畸、致癌和致敏等特殊毒性，提出早期诊断的方法及健康监护措施。
3.研究方法一是微观方法；另一大类方法是宏观方法，亦即研究人的整体以至于人的群体与毒物相互作用的关系，目前主要使用流行病学方法。
4.毒理学实验可采用整体动物、游离的动物脏器、组织、细胞进行。
根据采用的方法不同，可分为体内试验(in vivo test)和体外试验(in vitro test)。
毒理学还利用限定人体试验和流行病学调查直接研究外源化学物对人体和人群健康的影响。
1）体内试验也称为整体动物试验。
食品的测定实验：急性毒性实验
致死量的测定常以半数致死量为标准。半数致死量是指能 够引起试验动物一半死亡的剂量，妈药物致死量对数值， 用符号LD50表示。由于LD50的测定较简便、可靠，而且 稳定，现已成为标志动物急性中毒程度的重要常数。 LD50测定的方法有多种，如Bliss法、改进寇氏法、简化 机率单位法、累积插值法、机率单位-加权直线加归法等 等。以上方法虽各有特点，但都有共同的要求：
（3）试验周期和观察指标：给药后至少观察7天。观察期间应 逐日记录动物的毒性反应情况和死亡动物的分布。
（4）正式试验前，均须先用少量动物进行预试试验，大 致测出受试药物引起0%和100%死亡率的致死量范围，然 后安排正式试验。正式试验组数不得少于三个剂量组，一 般选用4～5个剂量组，每组动物数为10～20只。
2、正式实验：在预试实验测得Dn和Dm的剂量范围内设4～6个剂量 组，最多10组。最理想的结果是使LD50的上下各有2～3组。组数愈 少，准确性愈差。各剂量组的动物要求相等，至少10只动物（分组时 应注意分层随机均匀化的原则）。本实验要求最大反应率为100%， 最小反应率为0%， 或至少反应率接近100%或0%。组间剂量比值（1： K），常用1：0.8或1：0.75。如实验中出现相邻剂量有重复的100% 和0%反应率时，应将靠边的组弃去不计，使大剂量组只有一个100% 的反应率，小剂量组也只有一个0%的反应率。
LD50的平均可信限= LD50±（LD50高限-
LD50低限）/2
Xm：最大剂量组剂量的对数值
i：相邻两组剂量（d）对数值之差，或相邻
Байду номын сангаас
两组高剂量与低剂量之比的对数。
P：各组动物的死亡率，用小数表示。
ΣP：为各组动物死亡率的总和。
n：每组动物数。
食品毒理中有毒物质的处置过程及检测方法
食品毒理中有毒物质的转运、吸收、转化、排泄机理以及食品毒理学实验的几种检测方法。
食品毒理中有毒物质的处置过程及检测方法机体对化学毒物的处臵有转运、吸收、转化及排泄四个过程。
一、机体对有毒物质转运过程：分为被动转运、主动转运和膜动转运。
被动转运包括简单扩散、滤过和易化扩散三种。
简单扩散是被动运输的基本方式,不需要膜蛋白的帮助,也不消耗ATP,而只靠膜两侧保持一定的浓度差,通过扩散发生的物质运输。
简单扩散的限制因素是物质的脂溶性、分子大小和带电性。
简单扩散的特点是：①沿浓度梯度扩散；②不需要提供能量；③没有膜蛋白的协助。
一般来说, 气体分子、小的不带电的极性分子有毒物质、脂溶性的分子有毒物质等易通过质膜，大的不带电的极性分子和各种带电的极性分子有毒物质都难以通过质膜，进行简单扩散。
滤过是分子借助流体静压货渗透压随体液通过细胞膜的水性通道由细胞膜的一侧到达另一侧。
滤过是环境化学物透过生物膜上的亲水性孔道的过程。
生物膜上有一些亲水性孔道或间隙，它们是由嵌入型脂质双分子层中的蛋白质结构中的某些亲水性氨基酸构成。
当在膜的两侧存在着流体静压或者渗透压差时，水就能携带小分子溶质经亲水性膜孔顺压差透过生物膜。
凡分子直径小于膜孔直径的化学物均可以随同水流透过生物膜。
易化扩散指一些不溶于脂质或脂溶性很小的物质，在膜结构中一些特殊蛋白质分子的“帮助”下，从膜的高浓度一侧向低浓度一侧的移动过程。
易化扩散分为两种类型：1.由载体介导的易化扩散；2.由通道介导的易化扩散。
上述两种物质转运方式，都不需要细胞代谢供能。
不同的离子通道，一般都有其专一的阻断剂。
河豚毒能阻断Na+通道，只影响Na+的转运而不影响K+的转运。
四乙基铵能阻断K+通道，只影响K+的转运而不影响Na+的转运。
主动转运某些物质（如Na+,K+)以细胞膜特异载体蛋白携带下，通过细胞膜本身的某种耗能过程，逆浓度差或逆电位差的跨膜转运称为主动转运。
主动转运的特点是：必须借助于载体、逆浓度差或电位差转运并需要能量。
食品毒理学实验基础
第五章食品毒理学实验基础以科学研究为目的而进行科学饲养繁殖的动物称为实验动物。
实验动物学作为在现代科学带动崛起的一门以生命科学为主体，以医学、生物为核心的综合性独立的新兴学科，正以崭新的面貌，异乎寻常的速度，影响着整个生命科学各领域，成为生命科学研究的奠基学科和重要支撑条件，因而受到世界各国政府和科学家的重视，甚至作为衡量一个国家生物科学水平高低的标志之一。
食品毒理学的很多研究工作需要通过动物实验来进行。
使用实验动物进行科研的优点是花费人力、物力较少，时间短，易发现单因素与结果的关系，能提供大量有价值的可与人类生命活动现象相类比的资料。
在毒理学实验研究中，健康的实验动物是保证工作顺利进行和获得正确可靠的研究结果的重要条件。
食品毒理学研究外源化学物对于机体(特别是人体)的有害作用及其机制。
食品毒理学研究的主要手段是动物实验。
体内试验是以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人(原型)外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。
体外实验主要用于筛选和预测急性毒性和机制研究；人体实验和流行病学调查则可进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。
实际上，食品毒理学作为一门实验科学是以动物实验为中心的，食品毒理学动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究的基本方法。
食品毒理学试验是对化学物安全性评价的主要手段，已为各国际组织或各国的行政部门所颁布的规程或指南列为常规试验，有称为法规毒理学试验(regulatory toxico1ogy test)，这类毒理学试验是以筛查和描述外来化学物的毒性为目的，属于描述毒理学范畴。
第一节食品毒理学实验的原则和局限性一、食品毒理学实验的原则在毒理学的试验中，有三个基本的原则。
第一个原则，化学物在实验动物产生的作用，可以外推于人。
基本假设为：①人是最敏感的动物物种；②人和实验动物的生物学过程包括化学物的代谢，与体重(或体表面积)相关。
这两个假设也是全部实验生物学和医学的前提。
食品毒理学实验讲义.总结
食品毒理学实验讲义.总结实验一毒物损害的形态表现一、实验目的1. 通过本实验，掌握毒物的形态损害作用；2. 学会毒物形态损害的表现及如何记录相关实验现象。
二、实验原理有关重金属铜、锌、铬、镉对鱼类的急性毒性研究国内已有许多报道，鱼类早期发育是整个生活史中对各种污染物最为敏感的阶段，用以作为急性毒性试验具有快速、敏感、经济有效等特点，是生物测试保护天然水体的重要方法。
鲫鱼是我国重要的经济鱼类, 其分布面广而数量大, 个体生长快, 性成熟时间短, 繁殖季节长, 在人工控制饲养条件下可常年繁殖, 选择鲫鱼进行重金属离子毒性实验, 具有一定代表性。
本实验以鲫鱼为研究对象，向其生长环境中加入重金属硫酸铜，观察其形态损伤，希望在形态方面，有利于水体污染的观察。
三、实验试剂、仪器及动物1. 实验动物鲫鱼幼鱼, 购自鱼市场。
实验鱼在水族箱中驯养7 d 以上，暂养期间活动正常，无病，死亡率低于5%；实验前1 d 停止投饵，选择身体健康，反应灵敏，大小基本一致的幼鱼随机分组。
2. 实验试剂CuSO4, 先配制成质量浓度为3000 mg/ L 的母液, 再根据需要稀释成各质量浓度。
3. 实验仪器聚乙烯塑料水族箱，小型鱼类充氧机。
四、实验方法与步骤1. 实验动物的驯养实验鱼在水族箱中驯养7 d 以上，暂养期间活动正常，无病，死亡率低于5%；实验前1 d 停止投饵。
2. 实验动物的分组采用随机实验进行分组，将21只鲫鱼随机分成7组，其中一组为空白对照组，另外六组为实验组。
3. 实验动物的染毒采用静水法生物测试，实验期间不更换实验液，全天充气。
为防止饵料影响，实验期间不喂食。
为确定质量浓度的大致范围, 先作预实验, 估计CuSO4的7个质量浓度值, 在每一个质量浓度的水族箱内放入3 尾鲫鱼, 分别观察24 h、48h、96h, 找出各金属的100% 致死质量浓度和最大耐受质量浓度。
再根据预实验结果设6个质量浓度组及1个对照组, 每一质量浓度放鱼5尾, 在曝露的过程中观察它们的形态损伤。
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食品毒理学实验指导西南大学食品科学学院实验一 血细胞的计数【目的要求】学习红细胞、白细胞计数的方法。
【基本原理】血液中血细胞数的计算是使用血细胞计数板。
而且要用适当的溶液将血液稀释后，放入计数板的计数室内，在显微镜下计算一定容积血液稀释液中的血细胞个数，再将所得结果换算为1mm3血液中的血细胞个数。
【动物与器材】血细胞计数板、玻璃毛细吸管、1ml和5ml吸管、表面皿、显微镜、刺血针、酒精棉球、红细胞稀释液、白细胞稀释液。
【方法与步骤】1．血细胞计数板的结构血细胞计数板为一块特制的长方形厚载玻片，在中部1／3面积处有4条槽。
内侧2条槽之间还有1条横槽相通，因此在中部构成2块长方形平台。
此平台比整个载玻片的平面低0.1 mm。
平台中部各刻有1个含9个大方格的方格网，为计数室。
每1个大方格边长1 mm，面积为1mm2，体积为0.1 mm3。
四角的每1个大方格又被分为16个中方格，适用于白细胞、血小板和培养细胞的计数。
中央的大方格则由双线划分为25个中方格，每个中方格面积为0.04mm2，体积为0.004mm3，每个中方格又分成16个小方格，适用于红细胞、微生物细胞的计数。
2．采血管采血管为一细长、均匀的毛细玻璃管，其上有2个刻度，前端刻度指示的容量为10mm3，后端的为20mm3，尾端与1个带孔的橡皮吸球相连。
3．采血及稀释（1）用1 mL吸管准确吸取0.38mL白细胞稀释液，放入1支干净的小试管内，加塞备用。
用5mL吸管准确吸取3.98mL红细胞稀释液，放入另1支干净的中试管内，加塞备用。
（2）用消毒干棉球醮75％乙醇消毒左手无名指或耳垂边缘（或兔的耳缘静脉采血部位），待酒精挥发后用采血针刺入皮肤约2～3mm深，让血液自然流出。
采血时必须待皮肤上的消毒酒精挥发后才能穿刺，否则流出的血液不能成滴，无法吸取。
用消毒干棉球拭去第1滴血液，待流出第2滴血成大滴时，用采血管吸血至20mm3刻度处。
吸血时应注意，不可过度挤压组织以图加速血液流出；吸血时应尽量利用毛细管现象使血液自动进入吸管内。
操作要快，以防止血液凝固。
若血柱超出规定刻度1～2mm ，可用干棉球轻触管口（此时须执管于水平位置），吸去多余部分，使血液面恰至规定刻度处。
拭去附着于吸管尖端外部的血液。
若血液面超过规定刻度2mm 以上或吸入气泡，则应重新吸取血液。
将血液吹入盛有白细胞稀释液的中试管底部，轻轻摇振试管1～2min ，以摇匀稀释的血液。
（3）趁出血处尚有血液流出，及时用另一支采血管依同样方法吸血至20mm 3刻度处，并将血液吹入盛有红细胞稀释液的中试管底部。
轻轻摇振试管1～2min ，以摇匀稀释的血液，但不可用力过猛，以免发生泡沫。
4．充液2类血细胞计数分2次充液，方法如下。
（1）取干净的计数板平放于实验桌上，将盖玻片置入计数板正中央。
计数板和盖玻片在使用前必须用软绸或擦镜纸擦净，并在低倍镜下检查计数室是否干净，其刻度是否清晰。
用小滴管吸取稀释血液，并将管尖轻轻斜置于盖玻片边缘，让稀释血液缓慢流出，借毛细管现象而自动流入计数室内。
一般应一次充液使计数室内充满稀释血液，若经几次充液，易形成气泡，应洗净计数板和盖玻片，干燥后重新充液。
（2）稀释的血液充入计数室后，静置2～3min ，待细胞不再浮动后，于低倍镜下计数。
5．计数为防止重复计数和漏数，计数时应遵循一定的顺序进行，即“从左到右，自上而下”；对正好压在格线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图1-2）。
如计数白细胞时发现各大方格的白细胞数相差8个以上，计数红细胞时发现各中方格的红细胞数最多与最少相差20个以上时，则表示血细胞分布不均匀，必须将稀释的血液摇匀后再重新充入计数室计数。
数因为： 0。
6．计算（1）白细胞数 将四角的4个大方格内数得的白细胞总数乘以50，即得每立方毫米血液内的白细胞总数，也可将对角两个大方格内数得的白细胞总数乘以100。
即得每立方毫米血内的白细胞总稀释液0.38mL 加入血液20mm 3（1mL ＝1000mm 3，故20mm3＝0.02mL,），使血液稀释20倍，换算成未稀释血时应乘以2在计数时仅统计四角的4个大方格内的白细胞，其容积为lmm ×1mm ×0.1mm ×4＝0.4mm3，换算成每立方毫米时应乘以2.5。
这样，把四角4个大方格内数得的白细胞总数乘以50（即20×2.5＝50），即得每立方毫米血内的白细胞总数。
（2）红细胞数 将中央大方格中的四角和中央的中方格共5个中方格内数得的红细胞总数乘以10000，即得每立方毫米血内红细胞的总数。
因为：稀释液3.98mL ，加入血20mm 3（即0.02mL ），使血液稀释200倍，换算成未稀释血时应乘以200。
在计数时仅统计0.02 mm 3内的红细胞（1个中方格的容积为0.2mm ×0.2mm ×0.1mm ＝0.004mm3，5个中方格的容积为0.004mm3×5＝0.02mm 3），换算成每立方毫米时应乘以50。
这样把5个中方格内数得的红细胞总数乘以10 000（即200×50＝10000），即得每立方毫米血内的红细胞总数。
（3）按目前临床上血细胞计数采用的通用单位，将以上所获每毫升血液中所含各血细胞数量换算为各血细胞在每升血液中的数量。
7．清洗血细胞计数板盖玻片及计数板用过之后，必须立即用水冲洗，但不可用硬物刷洗。
计数板晾干或吹风机吹干后，应镜检计数室是否干净，如不干净必须重复洗至干净为止。
注：人体红细胞的正常参考值：男性：4.5 ~ 5.5 × 1012 / L女性：3.8 ~ 4.6 × 1012 / L新生儿：6.0 × 1012 / L 以上白细胞计数成人 4~10×109/L新生儿 15~20×109/L血细胞稀释液配制法1．白细胞稀释液冰醋酸（破坏红细胞） 1.5ml1%龙胆紫（染白细胞核，便于计数）1ml蒸馏水加至 100ml2．红细胞稀释液NaCl（维持渗透压） 0.5gNa2SO4（使溶液比重增加，红细胞均匀分布不易下沉） 2.5gHgCl2（固定红细胞并防腐） 0.25g蒸馏水加至100ml草酸盐抗凝剂：其配制方法如下：草酸铵1.2g、草酸钾0.8g、40%甲醛溶液（防止霉菌生长）1ml、加蒸馏水至100ml。
将抗凝剂溶液0.1ml吸入毛细管中，待溶液水分自然蒸发或稍加温烘干后使用。
实验二 急性毒性试验常用染毒方法及半数致死浓度的测定【目的要求】1． 掌握动物保定和灌胃染毒的方法2． 掌握半数致死浓度（LD50）霍恩氏法测定方法和结果评定。
【基本原理】霍恩氏法利用剂量对数与死亡率的转换数呈直线关系设计的方法，又称平均移动法或剂量递增法。
【动物与器材】实验动物：雌雄相同数量的健康成年小鼠材料：灌胃器材1套，注射器，苦味酸酒精饱和液，亚硝酸钠，动物称【方法与步骤】1 常用实验动物的保定方法（1）小白鼠的保定小白鼠性情较温顺，挣扎力小，比较容易抓取和保定。
抓取时，用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部放在格板或铁笼上。
趁着小鼠试图挣脱的瞬间，迅速用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌；放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠，然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠，完成抓取保定。
注意，抓小鼠尾巴应抓住尾巴中部或根部，不能仅捏住小鼠尾巴的尾端，因为这时小鼠的重量全部集中到尾端，如果小鼠挣扎，有可能弄破尾端。
在进行解剖、手术、心脏采血、尾静脉注射时，可将小鼠用线绳捆绑在木板上，或固定在尾静脉注射架及粗试管中。
（2）大白鼠的抓取保定抓取大鼠前最好戴上防护手套，右手轻轻抓住大鼠尾巴的中部并提起，迅速放在笼盖上或其它粗糙面上，左手顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行，以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤，其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤，完成抓取保定。
（3）豚鼠的抓取豚鼠性情温顺，胆小易惊，一般不易伤人。
捉拿时，实验人员可先用手轻轻扣、按住豚鼠背部，顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环其颈部，用另一只手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取保定。
抓取豚鼠需讲究稳、准、柔、快，不可过分用力抓捏豚鼠的腰腹部，否则容易造成肝破裂、脾淤血而引起死亡。
如果在动物实验操作过程中，豚鼠挣扎剧烈，实验人员遇到这种情况，可以用纱布将豚鼠头部蒙住，把豚鼠置于实验台上，实验人员稍为用力扣、按住豚鼠，然后进行操作。
（4）兔的抓取保定家兔驯服不咬人，但四肢的爪尖锐，挣扎时容易抓伤人。
抓取保定方法是用右手把两耳拿在手心并抓住颈后部皮肤，提起家兔，然后用左手托住臀部。
另一种方法是使用家兔保定栏，打开保定栏的前盖，抓取家兔放进栏内，右手抓住家兔耳朵将头部拉过栏的开孔，迅速关上栏门。
假如家兔挣扎，可用手在它的背上轻轻扶摸，使它安静下来，因为家兔挣扎很容易损伤脊柱。
需要进行手术时，可将家兔固定在兔实验台上，四肢固定，门齿用细绳栓住，固定在实验台的铁柱上。
2 实验动物的选择和性别鉴定（1）外观：健康动物的外观为体形丰满，发育正常，被毛浓密有光泽且紧贴身体。
眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲良好。
（2）性别鉴定：小鼠的性别主要依据肛门与生殖器之间距离区分，间距大者为雄性，小者为雌性。
3 小鼠灌胃染毒法测定亚硝酸钠半数致死浓度（LD50）（1）实验剂量选择本实验在亚硝酸钠的标准LD50 175mg/kg上下取值，实验取了464，215，100，46.4mg/kg四个剂量。
（2）实验动物的性别鉴定、编号和称重每组对本实验组的4只小鼠分别进行性别鉴定、编号和称重。
称重感应量需在0.1g以下；编号采用染色法，常用苦味酸饱和液为染料。
一般从头部开始编号，头部为1号，按顺时针方向向右前肢为2号，右肋为3号，右后肢为4号，尾部为5号，左后肢为6号，左肋为7号，左前肢为8号，背部为9号，不染色为10号。
（3）亚硝酸钠溶液的配制根据每只小鼠的重量和每组的实验剂量计算出每只小鼠的染毒量，根据灌胃的适量范围用蒸馏水配成0.2~1.0ml的溶液，进行灌胃。
（4）灌胃染毒将灌胃针与注射器连接后，吸取一定量受试物亚硝酸钠溶液。
左手抓住小鼠头和背部皮肤，使鼠呈直力状，右手持注射器，沿小鼠咽喉壁左边经食道将灌胃针插入胃内（深度为3~4cm），注入受试物亚硝酸钠溶液。
（5）观察灌胃后24h的小鼠死亡情况，记录后，根据霍氏LD50表查得亚硝酸盐的LD50值。
4 结果与讨论小鼠灌胃后24h，观察每组的死亡情况如下表。
实验组采用小鼠数量灌胃量（mg/kg）存活量死亡量1 4只46.4 只只2 4只100 只只3 4只215 只只4 4只464 只只实验三 实验动物生物材料的采集及解剖【目的要求】1．掌握几种给药方式2．掌握实验动物的采血方法3．掌握小鼠内脏解剖操作【动物与器材】实验动物：成年小鼠实验器材：解剖剪刀、镊子、解剖板、2ml注射器、玻璃毛细管、酒精棉球等【方法与步骤】1．几种给药方法：鼠尾静脉注射给药，皮下注射给药，腹腔注射给药2．采血方法（1）鼠尾采血：将动物固定，把鼠尾浸入45~50℃温水中数分钟，使尾静脉充血。