细胞传代培养标准操作规程
细胞生物操作规程(3篇)
第1篇一、引言细胞生物学实验是现代生物学研究的重要手段之一。
为了确保实验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
本规程适用于所有进行细胞生物学实验的人员。
二、实验前准备1. 实验室环境：实验室应保持整洁、安静、通风良好，实验台面清洁，无菌操作区域明确。
2. 实验材料：根据实验需求准备相应的细胞、试剂、仪器等，确保材料质量合格。
3. 实验设备：检查实验设备是否正常，如显微镜、离心机、培养箱、净化工作台等。
4. 实验操作人员：实验操作人员应具备一定的细胞生物学实验技能，熟悉实验操作规程。
三、细胞培养1. 细胞复苏：将冻存的细胞按照细胞冻存和复苏标准操作规程进行复苏。
2. 细胞传代：根据细胞生长状态，定期进行细胞传代。
传代过程中，注意无菌操作，避免污染。
3. 细胞培养条件：保持细胞培养箱温度、湿度、CO2浓度等参数稳定，确保细胞生长良好。
4. 细胞观察：定期观察细胞生长状态，如细胞形态、密度等，必要时进行拍照记录。
四、细胞染色与观察1. 细胞染色：根据实验需求，选择合适的染色方法对细胞进行染色。
2. 显微镜观察：使用显微镜观察染色后的细胞，注意调整光圈、焦距等参数，确保观察效果。
3. 图像采集：使用图像采集系统对细胞进行拍照，记录实验结果。
五、细胞分离与纯化1. 细胞分离：根据实验需求，采用酶消化、离心等方法分离细胞。
2. 细胞纯化：通过流式细胞术、磁珠分离等方法对分离的细胞进行纯化。
六、细胞转染与表达1. 细胞转染：根据实验需求，选择合适的转染方法对细胞进行转染。
2. 转染效率检测：通过荧光素酶报告基因、荧光显微镜等方法检测转染效率。
3. 基因表达分析：通过RT-qPCR、Western blot等方法检测转染细胞的基因表达水平。
七、实验记录与报告1. 实验记录：详细记录实验过程、操作步骤、结果等，确保实验数据的真实性。
2. 实验报告：整理实验结果，撰写实验报告，包括实验目的、方法、结果、讨论等。
八、实验安全与环保1. 生物安全：严格遵守生物安全操作规程，避免生物危害。
单层培养细胞的一般传代步骤
单层培养细胞的一般传代步骤细胞传代是细胞培养中的重要步骤，通过传代可以使细胞继续生长和繁殖，以满足后续实验或应用的需要。
在单层培养细胞中，传代过程相对简单，本文将介绍单层培养细胞的一般传代步骤，以供参考。
1. 培养皿的选择根据细胞的生长特性和要求选择合适的培养皿。
常用的培养皿有培养瓶、培养板等，根据实验需要选择相应的规格和材质。
2. 细胞分离将细胞培养皿中的细胞与上清液（如PBS）吸取下来，用吸管轻轻吹打涤洗细胞，以去除细胞间的黏附物。
然后，加入适量的胰酶或胰蛋白酶溶液，使细胞与培养皿表面分离。
3. 细胞收集将含有胰酶或胰蛋白酶溶液的培养皿轻轻摇晃，使细胞均匀地与溶液接触。
通常情况下，胰酶或胰蛋白酶会降解细胞间的黏附物，使细胞从培养皿上脱落。
当细胞脱落并呈现悬浮状态时，即可收集细胞溶液。
4. 细胞计数使用细胞计数板、倒置显微镜等工具，对细胞溶液中的细胞数目进行计数。
这一步骤可以帮助确定细胞的浓度，以便后续传代的操作。
5. 稀释细胞根据实验需要和细胞的生长特性，将细胞溶液稀释至合适的浓度。
通常情况下，细胞的稀释比例为1：2至1：4，具体比例可根据实验要求进行调整。
6. 接种细胞将稀释后的细胞溶液均匀地加入新的培养皿中。
为了保持细胞的均匀分布，可以轻轻地摇晃培养皿，使细胞溶液均匀涂覆在培养皿的表面上。
7. 培养细胞将接种好的细胞培养皿放入恒温培养箱中，控制好适宜的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质和培养基。
培养时间根据细胞类型和实验要求而定，通常为1-3天。
8. 观察细胞生长每天观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、数量和覆盖率等。
如果细胞生长良好，细胞数量适中，可以继续传代。
如果细胞数量过多或过少，需要相应调整细胞的传代比例。
9. 传代细胞当细胞生长到达合适的程度时，即细胞达到对培养皿表面的覆盖率约80%时，即可进行传代。
传代的步骤与第2至第7步相同，重复进行即可。
10. 结束培养根据实验要求，可以根据需要进行多次传代，直至细胞生长停滞或失去活性为止。
细胞传代培养的关键步骤
细胞传代培养的关键步骤
1. 选择合适的细胞株：根据研究目的选择合适的细胞株。
常见的细胞株有HEK293、CHO等。
2. 孵育细胞：将细胞株接种在含有营养物质和抗生素的培养基中，提供适宜的温度和湿度，促使细胞增殖。
3. 贴壁培养：将细胞株从液体培养基中离心收集，并悬浮在含有培养基的培养瓶中，使其黏附到培养瓶底部。
4. 细胞分离：当细胞生长到合适的密度时，进行细胞分离。
可以使用胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离。
5. 细胞传代：将分离的细胞重新接种到新的培养瓶中，继续进行培养。
6. 培养条件的管理：细胞传代过程中，需要确保培养基的质量，管理适宜的培养条件，包括温度、CO2浓度和培养时间等。
7. 污染检测：定期检测细胞培养物是否受到污染，如细菌、真菌或其他细胞株的污染。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
培养板需要加入培养基的体积以及细胞数量 各种规格细胞培养板需要加入的培养基的体积，可以参考下表。
培养器皿
面积（cm2 ）
96孔板
0.32
48孔板
0.95
24孔板
1.91
12孔板
3.83
6孔板
9.5
3.5cm培养皿 9.6
6cm培养皿 21.3
10cm培养皿 58.1
25cm培养皿 25
75cm培养皿 75
80%），还要综合考虑转染试剂对细胞密度的要求等。 2. 细胞生长的速度，细胞的大小，细胞处理的时间长度（24h，48
h...）。 3. 根据后续相应检测试剂盒的要求（CCK-8,细胞周期，流式，荧光染
色等）。
培养板中细胞数量的控制： ❖1. 按照经验：一个培养瓶100%满后，大概可铺n个6孔板（2n个12孔板...）等,
X
✔
细胞铺板
常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，用适量的完全培养基重悬 细胞。
细胞遗传操作规程(3篇)
第1篇细胞培养操作规程一、细胞房操作规范1. 进入细胞房前的准备：- 穿着无菌实验服，佩戴帽子、口罩。
- 用75%酒精消毒双手，确保进入细胞房前双手无菌。
2. 细胞房内的操作：- 操作前应确保细胞房内环境符合无菌要求，包括空气洁净度、温度和湿度。
- 使用无菌操作工具，如镊子、剪刀、移液器等。
- 操作过程中尽量避免操作区域外露，以防污染。
3. 细胞培养容器的准备：- 使用无菌培养皿、培养瓶等容器。
- 在使用前，将容器在酒精灯火焰上灭菌。
二、常见细胞污染类型及处理1. 细菌污染：- 污染来源：操作不规范、无菌措施不到位等。
- 污染特征：显微镜下可见大小不一的颗粒，形态规则，分布均匀。
- 处理建议：轻度污染可用10～20倍双抗清洗处理；严重污染需更换无菌细胞和培养基。
2. 真菌污染：- 污染来源：空气中真菌孢子、操作者皮肤等。
- 污染特征：显微镜下可见丝状、网状结构。
- 处理建议：立即更换无菌细胞和培养基，对细胞房进行彻底消毒。
3. 病毒污染：- 污染来源：病毒感染细胞、使用污染的试剂等。
- 污染特征：细胞生长异常，出现细胞病变。
- 处理建议：更换无菌细胞和培养基，对细胞房进行彻底消毒。
三、急性髓系细胞白血病细胞培养操作规程1. 培养基及培养条件：- 使用IMDM培养基，加入20%FBS和1%双抗。
- 气相：空气95%，二氧化碳5%。
- 温度：37℃，湿度70%-80%。
2. 细胞复苏：- 将冻存细胞悬液在37℃水浴中解冻，加入培养基，混合均匀。
- 在1000RPM条件下离心5分钟，弃上清液。
- 加入适量培养基重悬细胞。
3. 细胞传代：- 使用胰酶消化细胞，待细胞变圆后加入培养基终止消化。
- 收集细胞，计数，调整细胞浓度。
- 将细胞接种于培养皿或培养瓶中。
4. 细胞冻存：- 收集细胞，计数，调整细胞浓度。
- 加入冻存液，混合均匀。
- 将细胞悬液分装于冻存管中，放入液氮或-80℃冰箱保存。
通过以上操作规程，可以有效地进行细胞培养工作，确保实验的顺利进行。
beas-2b细胞传代步骤
beas-2b细胞传代步骤Beas-2B细胞传代步骤Beas-2B细胞是一种人鳞状肺上皮细胞系，常用于研究呼吸道疾病和肺部疾病相关的生物学过程。
在进行Beas-2B细胞的研究时，常常需要对细胞进行传代，以获取足够的细胞数量进行后续实验。
本文将介绍Beas-2B细胞的传代步骤。
一、细胞培养基的准备1. 准备DMEM/F12培养基，添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(PS)。
2. 将培养基加热至37摄氏度，使其达到体温。
二、细胞的分离1. 用PBS缓冲液洗涤细胞，将细胞从培养瓶中收集到离心管中。
2. 将细胞离心，去除上清液，用PBS缓冲液洗涤细胞。
3. 加入适量的胰蛋白酶(0.25% trypsin)，使其充分覆盖细胞，放置于37摄氏度恒温培养箱中，进行消化。
4. 定时观察细胞的形态变化，当细胞与胰蛋白酶完全分离后，停止消化。
三、细胞的传代1. 将被胰蛋白酶消化的细胞转移至离心管中，加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞，使其均匀分散。
2. 采用细胞计数板或倒置显微镜，计数细胞数目，计算细胞的浓度。
3. 根据需要的细胞数量，计算所需的细胞体积。
4. 将细胞体积和培养基的体积按照比例混合，将混合液加入新的培养瓶中。
5. 放置细胞培养瓶在恒温培养箱中，培养细胞至80%的密度。
四、细胞的观察和记录1. 定期观察细胞的形态变化，记录细胞的生长情况。
2. 注意观察细胞的污染情况，如发现污染应及时更换培养基和培养瓶。
五、细胞的冻存1. 当细胞达到足够数量时，可以进行细胞的冻存以备将来使用。
2. 用PBS缓冲液洗涤细胞，离心去除上清液。
3. 加入适量的冻存液(DMSO和FBS混合液)，使其充分覆盖细胞，轻轻混匀。
4. 将混合液转移到冷冻管中，放置于-80摄氏度冷冻库中保存。
六、细胞的复苏1. 从冷冻库中取出冻存管，迅速将其放置在37摄氏度的水浴中，使其迅速解冻。
2. 将细胞转移到离心管中，加入适量的培养基，轻轻悬浮细胞。
体细胞培养标准
体细胞培养标准
体细胞培养标准操作主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存等步骤。
一、细胞复苏
1.从冻存管中取出细胞，放入37℃水浴中迅速解冻。
2.将解冻后的细胞悬液转移至培养瓶中，用PBS清洗两次，以去除残留的冻存液。
3.加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
4.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，进行细胞培养。
二、细胞传代
1.当细胞融合率达到80%时，用胰酶或胶原酶消化细胞，分散成单个细胞。
2.将消化后的细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量新鲜培养基，将细胞悬液浓度调整至适当水平。
3.将培养瓶放入37℃、5% CO₂的恒温培养箱中，继续进行细胞培养。
三、细胞冻存
1.将细胞沉淀至离心管中，用PBS清洗两次，去除残留的培养基。
2.加入冻存液（10% DMSO +90%胎牛血清），轻轻混匀。
3.将离心管放入-80℃的冰箱中，进行慢速冻存。
4.当细胞悬液完全冻实后，将其转移至液氮中，长期保存。
四、体细胞培养的特点
1.严格的无菌操作：为避免细胞污染，需在无菌环境下进行细胞培养。
2.适宜的培养条件：细胞生长需要适宜的温度（37℃）、湿度（5% CO₂）
和营养环境（培养基）。
3.细胞数量控制：细胞传代前融合率应达到80%，冻存时每管细胞量应达到规定数量。
4.质量控制：监测细胞数量、活率、表面标记、支原体和内毒素等指标，以确保实验结果的准确性和可靠性。
5.应用广泛：体细胞培养技术在生物学、医学、生物工程等领域具有广泛的应用价值，可用于研究细胞生长、分化、信号传导等生物学过程。
传代培养流程
传代培养流程传代培养是一种将细胞分离、生长和扩增的过程，通常用于生物学、医学、药学研究等工作中。
传代培养可适用于许多类型的细胞，包括原代细胞、肿瘤细胞、以及转染后的细胞等。
一、准备工作a. 确定培养基配方：选择合适的培养基配方，根据细胞类型需求添加必要的生长因子和营养物质，如未必要可加入一定浓度的抗生素。
b. 消毒培养器具：所有的器具（离心管、培养皿、细胞培养瓶等）都需要在使用前彻底消毒，并在操作和运用过程中维持消毒状态以杜绝细菌、病毒污染。
c. 收集细胞：取得即将扩增培养的原代或继代细胞，若为老化细胞需要从一组新的、活性高的细胞中取得。
d. 设置细胞密度：在接种之前，我需要对细胞进行计数并要确保它们以适当的密度培养。
这通常意味着将适当的细胞数量计入培养器中，以便在24-48小时内扩增到所需的数量。
二、分离细胞a.用一种含有胎牛血清的培养基精细地分离细胞，即细胞生长基质的血清可以帮助细胞的黏附和扩增，确保细胞在适当的生长条件下茁壮发展。
b. 运用试管、掏子、胶片和其他适当器具，分离细胞，并将其分散在合适的培养基中，以便让它们快速生长和扩增。
c. 若需继续扩增，则重复上述操作，将细胞继续放置在培养基中，直到达到所需细胞密度。
三、培养细胞a. 将皿或瓶放置于恰当的温度下，通常在37°C的培养箱中，以便在最佳的生长条件下扩增细胞。
b. 保护细胞：在培养细胞的过程中保护它们不受污染或其它环境因素的危害，如避免长期的紫外线照射，避免细胞干燥。
c. 注意观察：定期观察培养细胞的生长和健康程度。
在适当的时间间隔内（24-48小时）更换培养基，并将细胞移至新的培养皿中，以便继续扩增。
四、细胞冻存a. 非常重要的是，维护一些质量良好的细胞样本以备不时之需。
因此，在将细胞用于实验之前，要进行细胞冻存以备不时之需，也可以方便将细胞共享给其他研究者。
b. 进行细胞冻存需要选取逐代生长较活跃、状态稳定和细胞恢复能力较好的细胞。
细胞培养标准操作规程
细胞培养标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事细胞培养的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂细胞培养液、血清、胰酶、PBS或Hank`s液
2、规程：
2.1 细胞株的培养
2.1.1 获取所需细胞株（一般细胞株的运送是把细胞放在培养瓶中，干冰保存运输的）
2.1.2 得到所需细胞株后弃掉多余的培养液，放到5%的CO2培养箱中培养
2.1.3 每天至少观察一次，待细胞长满整个培养瓶的80%时传代
2.1.4 倒掉培养液，用1mlPBS 漂洗细胞一次，加入500ul胰酶消化，消化时间视细胞种类、胰酶浓度和消化温度而定，一般3-5min
2.1.5 终止消化，向上一步消化液中加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.1.6 吹打，用吸管轻轻吹打至细胞全部脱落，注意尽量减少气泡产生
2.1.7 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.1.8 将细胞接种到另外的培养瓶中
2.1.9 换液，根据细胞生长情况，间隔一定时间半量换液。
2.2 原代细胞培养
2.2.1 原代细胞的获取无菌条件下取动物组织剪碎
2.2.2 向剪碎的动物组织加入适宜浓度的胰酶，消化，时间因细胞种类和胰酶浓度而定
2.2.3 终止消化，向上一步消化叶重加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.2.4 吹打将终止消化后的组织转入一培养皿中，加入一定量的培养液轻轻吹打数次，静置5-10分钟
2.2.5 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.2.6 将细胞接种到培养瓶或培养板中，放入5%的CO2培养箱中培养。
细胞传代详细步骤
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细胞传代
1、75%乙醇擦手，取移液枪、枪盒、PBS、培养基放入超净台。
2、打开超净台（照明、风机）。
然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取出胰酶，把胰酶和PBS的瓶盖打开或者拧松。
4、取待传代的细胞
5、用尖吸管弃去旧的培养基，吸量管加入PBS 4ml左右，然后将PBS瓶收起来。
6、用尖吸管洗一下细胞，然后将PBS弃掉；
7、用吸量管吸取1ml胰酶加入。
弃掉吸量管。
8、将细胞放入37度孵箱。
将胰酶和PBS瓶放入4度。
9、取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后，取1-2ml培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
10、吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
将培养基收至4度保存。
弃掉吸量管。
11、细胞悬液加入新的培养皿中。
镜下观察，摇匀，放入37度孵育。
收超净台。
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细胞传代培养（消化法）标准操作规程
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时
也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各
种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分
瓶。
二、材料和试剂
1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS)
2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌
离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃ 水槽回温。
3. 新鲜培养基
4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
1. 传代前准备
（1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放
入37℃水浴锅内预热。
（2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污
染。
（4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
（5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微
镜的台面，再在镜下观察细胞。
（8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
2. 胰蛋白酶消化
（1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液
（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
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（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间
不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培
养液。
3. 吹打分散细胞
（1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8
分钟。
（4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹
打细胞制成细胞悬液。
4. 分装稀释细胞
（1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过
小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好
标记。
（2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
（3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继
续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。
5. 悬浮型细胞的传代
（1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
（2）吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新
的培养瓶中，以正常培养条件培养。
注意事项：
1.严格的无菌操作。
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多
因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接
变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
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附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％
酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH
值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养
时细胞容易脱壁。