Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤
Runx2基因对骨肉瘤细胞的生物学的影响及相关体内和体外机制的研究
单位代码：１０１８３学号：**********吉林大学博士学位论文吴丹凯分类号R737.25密级公开Runx2 基因对骨肉瘤细胞的生物学的影响及相关体内和体外机制的研究:Effect of Runx2 on the osteosarcoma celland it’s related mechanism: in vitro and in vivo 吴丹凯指导教师姓名高忠礼职称教授单位吉林大学专业名称外科学论文答辩日期授予学位日期答辩委员会主席论文评阅人未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。
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吉林大学博士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。
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本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。
论文级别：□硕士■博士学科专业：外科学论文题目：Runx2 基因对骨肉瘤细胞的生物学的影响及相关体内和体外机制的研究作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林大学第三医院骨外科 130033作者联系谨借此论文完成之际，向尊敬的导师高忠礼教授表示衷心的感谢，感谢他多年来在我学习、工作、生活中所给予的无限关怀与帮助。
补肾活血汤通过Runx2Osterix促进骨质疏松模型大鼠的骨折愈合
Hu Liuchao, Master candidate, Graduate School of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Corresponding author: Luo Yiwen, MD, Chief physician, Master’s supervisor, Orthopedic Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
通讯作者：罗毅文，博士， 主任中医师，硕士生导师， 现任广州中医药大学附属 骨伤科医院创伤骨科主 任，从事中医药促进创伤 组织修复研究。广州中医 药大学附属骨伤科医院， 广东省广州市 510240
文献标识码:B 稿件接受：2018-10-07
结论：
(1)补肾活血汤能上调大鼠体内 Runx2/Osterix 的表达； (2)逆转慢病毒介导的 Runx2 基因沉默效应； (3)促进骨质形成； (4)有利于骨质疏松性骨折的愈合。
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
·研究原著·
补肾活血汤通过Runx2/Osterix促进骨质疏松模型大鼠的骨折愈合
胡流超1，罗毅文2，程英雄2，பைடு நூலகம்志方2，罗 辉1，沈 玮1 (1广州中医药大学研究生院，广东省广州市
制作一般骨折模型，股骨相同部 位注射 PBS，蒸馏水灌胃
检测 项目
Micro CT 测定骨 显微参数
Runx2基因与骨相关疾病的研究
Runx2基因与骨相关疾病的研究张云芳(综述);王玉明;段勇(审校)【期刊名称】《医学信息》【年(卷),期】2014(000)021【摘要】Runx2 is the key transcription factor of regulating the bone marrow mesenchymal stem cells into osteoblasts dif erentiation and maturation during bone development. Through many pathways involved in the regulation of bone metabolism, Runx2 Can af ect osteoblasts, osteoclast activity and control bone resorption and formation, and have a great relationship with the formation of many bone-related diseases, Thus providing new ideas and therapeutic targets for the early detection and treatment of these diseases.%Runx2是骨发育过程中调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成熟最关键的转录因子,它通过多条途径参与骨代谢的调控,可影响成骨细胞及破骨细胞活动从而控制骨形成与骨吸收,并与很多骨相关疾病的形成有很大关系,Runx2基因多态性的研究为疾病的早发现及治疗提供新的思路及治疗靶点。
【总页数】2页(P651-652)【作者】张云芳(综述);王玉明;段勇(审校)【作者单位】昆明医科大学第一附属医院检验科，云南昆明 650032;昆明医科大学第一附属医院检验科，云南昆明 650032;昆明医科大学第一附属医院检验科，云南昆明 650032【正文语种】中文【相关文献】1.腺相关病毒介导的klotho基因表达对去势大鼠骨Runx2及MMP-13表达的影响 [J], 王艳娇;马厚勋;李宝善;吴平2.骨保护素基因多态性及其血清浓度与人类相关疾病的研究进展 [J], 杜玉英;周晓辉3.Runx2基因参与Wnt/β-catenin信号通路中骨代谢疾病的研究进展 [J], 樊梅; 唐芳; 马武开; 兰维娅; 李宇; 蒋总; 蔡鑫4.骨保护素(OPG)基因多态性与种植体周围组织疾病的相关性研究 [J], 姚舜;刘倩;邓巍5.Runx2及相关骨科疾病研究进展 [J], 张媛;闫玉仙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Runx2基因参与骨代谢相关通路的研究进展
Runx2基因参与骨代谢相关通路的研究进展陈伟健;黄永青;晋大祥;谢炜星;温龙飞;李钺;任东成;丁金勇;詹晓欢;许伟鹏【摘要】With the coming of aging era,osteoporosis has become a hot topic.Runx2 gene,as a specific transcription factor of bone differentiation,is involved in a variety of signaling pathways regulating bone differentiation.This paper reviews the involvement of Runx2 gene in transforming growth factor beta(TGF-β)/ bone morphogeneticprotein(BMPs)signaling pathway,Notch signaling pathway,and Wnt signaling pathway.%随着老龄化时代的到来,骨质疏松症成为人们研究的热点,而Runx2基因作为一种成骨分化特异性转录因子,参与多种信号通路调控成骨分化的过程.本文仅就Runx2基因参与转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)通路、Notch 信号通路及Wnt信号通路的研究进展进行综述.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2018(024)004【总页数】4页(P557-560)【关键词】Runx2基因;骨代谢;信号通路【作者】陈伟健;黄永青;晋大祥;谢炜星;温龙飞;李钺;任东成;丁金勇;詹晓欢;许伟鹏【作者单位】广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学第一附属医院,广东广州510405;广州中医药大学第一附属医院,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学第一附属医院,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405;广州中医药大学,广东广州510405【正文语种】中文【中图分类】R3361 Runx2的介绍Runx2称为核心结合因子 a1或多瘤病毒增强子结合蛋白及急性骨髓性白血病因子3，属于 runt 结构域基因家族成员之一。
透明质酸复合BMP-2转染骨髓基质干细胞修复兔桡骨干缺损的生物力学研究
透明质酸复合BMP-2转染骨髓基质干细胞修复兔桡骨干缺损的生物力学研究章军辉;陈永强;汤亭亭;楼觉人;戴尅戎【期刊名称】《医用生物力学》【年(卷),期】2008(23)2【摘要】目的评价携带人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因重组腺病毒(Adv-hBMP-2)转染的骨髓基质干细胞(BMSCs)与透明质酸(HA)复合构建的组织工程化骨对兔桡骨干缺损的修复效果。
方法取兔骨髓行BMSCs培养及Adv-hBMP-2的体外转染,建立兔桡骨干1.5cm的缺损模型。
20只兔(40侧)分4组(n=10):第1组注射Adv-hBMP-2转染细胞+HA组,第2组注射Adv-hBMP-2转染细胞组,第3组单纯注射HA组、第4组空白对照组;通过影像学、组织学检查、生物力学测试和骨组织形态计量分析观察修复效果。
结果(1)第1组,第12周8侧骨缺损中6侧完全愈合;第二组第12周8侧骨缺损中有3侧完全愈合;第3组和第4组,第12周骨缺损均未愈合。
根据骨缺损内新生骨面积行X线疗效评分,各组依次为4.63±0.74、3.38±1.60、1.63±0.74、1.50±0.53,差异有统计学意义(P<0.0001)。
(2)第1、2组,4￣8周时骨缺损内均有多量新生骨痂形成,12周时部分骨髓腔再通;第3、4组,4￣8周时骨缺损处为纤维组织填充,12周时骨缺损未愈合,两骨端硬化。
新生骨小梁面积第1、2组分别为(16.25±3.49)mm2、(10.37±2.02)mm2,差异有统计学意义(P<0.001)。
(3)第1组的最大压缩载荷和弹性模量分别为(211.54±63.58)N 和(113.36±56.47)MPa,第2组分别为(126.74±53.13)N和(98.91±63.36)MPa,差异有统计学意义(P<0.05)。
转录因子Runx2调控前成骨细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的表达
转录因子Runx2调控前成骨细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的表达孙玉娇;宫春梅;郝建忠;孙岩;刘晓影【摘要】背景：细胞外基质磷酸化糖蛋白基因在骨的矿化和吸收、成骨细胞与破骨细胞的平衡中起重要的作用，研究细胞外基质磷酸化糖蛋白的功能及其调控机制可为骨质疏松症的治疗提供新的思路。
<br> 目的：分析转录因子Runx2在小鼠前成骨细胞中对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的调控作用，进而初步研究转录因子Runx2在骨形成发育过程中的作用。
<br> 方法：首先根据Genbank中Runx2的基因序列构建Runx2真核表达载体；然后利用双荧光素酶基因检测报告系统分析Runx2对不同长度的细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子转录活性的影响，以确定Runx2有明显作用的启动子区段，分析3种MAPK信号通路抑制剂调控Runx2对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子转录活性的影响；最后利用定时定量RT-PCR法分析Runx2对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子表达活性的影响。
结果与结论：成功构建Runx2真核表达载体；双荧光素酶基因检测报告系统分析显示Runx2能够上调细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子在前成骨细胞中的转录活性，在(-300-+66)366 bp片段区域内上调效果较为显著，Runx2可通过激活MEK激酶MAPK通路上调细胞外基质磷酸化糖蛋白启动子活性；定时定量RT-PCR法检测再次验证Runx2上调细胞外基质磷酸化糖蛋白基因启动子的表达水平。
提示转录因子Runx2可以通过MEK激酶MAPK信号通路对细胞外基质磷酸化糖蛋白基因表达进行调节，为探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白在骨形成发育过程中的意义奠定基础。
%BACKGROUND:Matrix extracel ular phosphoglycoprotein phosphorylated extracel ular matrix glycoprotein (MEPE) gene plays an important role in bone mineralization andabsorption as wel as the balance of osteoblasts and osteoclasts. Studies on the function and regulatory mechanism of MEPE can provide new ideas for the treatment of osteoporosis. OBJECTIVE:To analyze the regulatory effects of transcription factor Runx2 on MEPE promoter in mouse preosteoblasts, thereby preliminarily studying the Runx2 effects in the process of bone formation and development. METHODS:First of al , the Runx2 eukaryotic expression vector was built according to the gene sequence of Runx2 in Genebank;then the dual luciferase reporter assay was employed to analyze the effects of Runx2 on transcription activity of MEPE promoters with different lengths in order to determine the promoter region in which Runx2 has significant effect. Afterwards, the effects of Runx2 on transcipition activity of MEPE gene promoter which induced by three MAPK signaling pathway inhibitors were investigated. Final y, real-time PCR was used to analyze the expression activity of MEPE gene promoter regulated by Runx2. RESULTS AND CONCLUSION:We successful y constructed the Runx2 eukaryotic expression vector. Dual luciferase reporter assay showed that Runx2 could increase the transcription activity of MEPE gene promoter in preosteoblasts, and the fragment area in which Runx2 exhibited the more significant up-regulatory effectiveness was (-300 to+66)366 bp. Runx2 could increase the transcription activity of MEPE gene promoter by activating the MAPK single pathway. The real-time PCR verified that Runx2 increased the expression activity of MEPE gene promoter. These findings indicate that Runx2 can regulate the express ofMEPE gene promoter by the MAPK single pathway, in order to build the basis for exploring the process of bone formation and development.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2015(000)037【总页数】6页(P5905-5910)【关键词】组织构建;骨细胞;细胞外基质磷酸化糖蛋白;Runx2;信号通路;双荧光素酶基因检测;定时定量RT-PCR;组织工程;国家自然科学基金【作者】孙玉娇;宫春梅;郝建忠;孙岩;刘晓影【作者单位】潍坊医学院口腔医学院，山东省潍坊市 261053;潍坊医学院口腔医学院，山东省潍坊市 261053;潍坊医学院附属医院，山东省潍坊市 261031;潍坊医学院，山东省潍坊市 261053;潍坊医学院，山东省潍坊市 261053【正文语种】中文【中图分类】R318文章亮点：1 关于细胞外基质磷酸化糖蛋白的研究国内外主要集中在对骨及牙髓、牙本质形成功能方面研究，本实验从分子信号通路方向研究细胞外基质磷酸化糖蛋白基因在骨细胞中的调控通路，为骨质疏松症的发病机制提供新的依据，不仅具有重要的科学价值，也为骨质疏松的治疗提供新的靶点。
Nature子刊：泛素连接酶WWP2以单泛素的方式促进RUNX2蛋白在成骨分化中的作用
Nature子刊：泛素连接酶WWP2以单泛素的方式促进RUNX2蛋白在成骨分化中的作用文章的题目是The E3 ubiquitin ligase WWP2 facilitates RUNX2 protein transactivation in a mono-ubiquitination manner during osteogenic differentiationE3，作者是复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系暨代谢分子医学教育部重点实验室甘肖箐课题组的师生，在这篇文章中作者发现泛素连接酶 WWP2 以单泛素的方式促进RUNX2 蛋白在成骨分化过程中的转染。
研究背景：造血源性破骨细胞可以控制骨吸收，骨骼间充质成骨细胞促进骨矿物质沉积，这两个过程的不平衡会导致骨质疏松症。
而间充质干细胞成骨分化促进NEDD 4家族E3泛素蛋白家族成员的WWP 2表达及核内积聚，在骨髓间充质干细胞和成骨细胞中敲除WWP 2基因导致成骨功能下降，矿物质沉积减少和成骨标记基因的下调。
RUNX2（core binding factor alphal 1）是Runt家族转录因子的成员之一，它们含有共同的DNA结合runt结构域，能与核心结合因子β（core binding factor betaCbfb) 形成异二聚体。
RUNX2在软骨形成、骨代谢相关疾病方面至关重要，它能诱导骨骼间充质细胞的分化，并使间充质细胞向成骨细胞方向分化，抑制脂肪细胞和软骨细胞分化。
具有颅骨锁骨发育不全综合征的患者RUNX22发生突变，其表现为身材矮小、锁骨发育不全、多生牙和囱门不能闭合。
实验发现敲出小鼠的RUNX2基因，小鼠软骨形成分化完全中断，说明其在软骨发育中的重要作用。
免疫共沉淀结果显示WWP 2与RUNX 2相互作用，WWP 2通过可以促进runx 2的单泛素化，进而促进成骨分化。
研究结果：作者为了证明Hect结构域促进WWP 2在胞质积累，首先利用体外培养的C3H10T1/2细胞分化模型，检测出WWP 2在成骨前后细胞中的表达及亚细胞定位，发现成骨后细胞中WWP 2的表达有所增加。
Runx2及其在骨组织工程中的应用
（ ＭＡ Ｐ Ｋ） ／ Ｎ胞外信号调节激酶 （ Ｅ Ｒ Ｋ） 激酶 （ ＭＥ Ｋ） ／ Ｅ Ｒ Ｋ 信号转 导通路 ， Ｅ Ｒ Ｋ１ 可 上调骨钙素及 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２表达 ， 并促 使Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ 蛋 白磷酸化 ， 促进成骨作用 ； 成纤维 细胞 生长
Ｒ ｕ ｎ ｘ ２在成骨分化信 号转导 通路 中起核 心作 用 ， 其 他成骨作用因子可 与 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２相互 作用促 进成 骨分化 。 成骨分化调 节过 程 中有 多种 活性 因子 直接 参 与成 骨分 化， 如骨形 态发 生蛋 白（ Ｂ ＭＰ ） 一 ２ 、 Ｂ ＭＰ ＿ ４ 、 Ｂ ＭＰ － ７ 、 转 化生 长 因子 （ Ｔ Ｇ Ｆ ） 一 Ｊ ３ １ 、 Ｔ Ｇ Ｆ － Ｊ ３ ２ 、 胰 岛素样生长 因子 （ Ｉ Ｇ Ｆ ） １ 等。 这些上游因子与 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２相互 作用 ， 通过 不同 的信 号转导 通路使 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ 基 因表达上调 ， 或使 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ 蛋 白磷酸化 ， 调 节其活性和功能 ， 从 而进一 步调节 Ｂ ＭＳ Ｃ成 骨分化 。细
组 织材 料 是 骨 组 织 工 程 研 究 的 重 要 课 题 。转 录 因 子 Ｒ ｕ ｎ ｘ ２在成骨分 化 中起 着重要 作用 。 为骨组 织工 程研 究 开辟 了新 的突破方 向。 １ 结构 特点与分型 、
胞早期增殖过程 中起作用 ， Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ ［ １ 型则在后期 成骨 阶段 对成骨细胞成熟 发挥 重要作 用 ； Ｒ ｕ ｎ ｘ ２ Ｉ 型还可在 未分 化 的骨髓 问充质干细胞（ Ｂ ＭＳ ｃ ） 、 前 成骨细胞和前软骨 细胞 中表达 。
Ｄ ０Ｉ ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｉ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ３ — ７ ０ ８ ３ ． ２ ０ １ ４ ． ０ １ ． ０ １ ６
Runx2在骨形成中的作用及调控
Runx2在骨形成中的作用及调控
Runx2在骨形成中的作用及调控
李娜，代晓霞
【摘要】摘要：正常情况下，骨形成和骨吸收处于动态平衡。
Runx2(runt-related transcription factor 2)是骨发育过程中重要的转录因子，对成骨细胞的分化、软骨细胞成熟、破骨细胞的分化及细胞外基质的分泌都有重要的调控作用。
因此，研究Runx2基因的表达调控、传导通路十分必要，对治疗骨代谢疾病具有重要意义。
本文将从Runx2的结构功能和表达调控对成骨细胞的影响进行阐述。
【期刊名称】国外医学（医学地理分册）
【年(卷),期】2018(039)004
【总页数】4
【关键词】Runx2；成骨细胞；软骨细胞；表达调控
【文献来源】https:///doc/802946699.html,/academic-journal-cn_foreign-medical-sciences-section-medgeography_thesis/0201247089386.html
◇综述与介评◇
修回日期：2018-06-26
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.8167121049)
骨形成是从骨髓间质干细胞(Bone marrow mesenchymal cells，MSCs)向成骨细胞和软骨细胞增殖分化以及细胞外基质的成熟和矿化的复杂生长发育过程，是在多种分子的调节下完成，Runx2就是其中的一个关键调节因子，在特定细胞的特定时期Runx2的表达水平有所不同。
在一些细胞中以G2/M达到最大值，在成骨细胞中，Runx2表达水平在G1期最高而在S期和M期最低，能。
miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化
miR-137靶向作用RUNX2调控MC3T3-E1细胞成骨分化高翔;荆凯鹏;黄瑞;闫守泉;牛艳茹;李鹏;罗远明;楚佳奇【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2016(022)011【摘要】目的探讨miR-137对RUNX2的靶向作用及其对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响.方法通过软件预测miR-137与成骨标志基因RUNX2的结合位点.检测MC3T3-E1细胞诱导成骨分化过程中miR-137的表达变化.转染miR-137 mimics或miR-137 inhibitor后,再诱导MC3T3-E1细胞成骨分化,检测成骨分化标志物(RUNX2、ALP、OPN、OCN及OSX)表达变化.结果经软件预测,miR-137与靶基因RUNX2有结合位点.MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,miR-137表达下调.转染miR-137mimics的MC3T3-E1细胞成骨标志基因表达受到抑制,而转染miR-137 inhibitor组成骨标志基因呈不同程度表达上调.结论 miR-137通过靶向作用RUNX2基因调控MC3T3-E1细胞成骨分化.【总页数】6页(P1440-1445)【作者】高翔;荆凯鹏;黄瑞;闫守泉;牛艳茹;李鹏;罗远明;楚佳奇【作者单位】广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院微创骨科研究室,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院干细胞研发与细胞治疗中心,广东湛江524001;广东医科大学附属医院微创骨科研究室,广东湛江524001【正文语种】中文【中图分类】Q28【相关文献】1.构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体 [J], 秦晗;龚永庆;徐宏志2.miR-137通过靶向EGFR调控宫颈癌细胞增殖和凋亡的作用机制研究 [J], 彭荫伟3.miR-203靶向RUNX2对牙周膜干细胞成骨分化能力的调控作用 [J], 冯保静;赵西博;郝志红;袁清敏;王献刚4.构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体 [J], 秦晗;龚永庆;徐宏志;5.miR-338-3p通过靶向RUNX2负调控人骨髓间充质干细胞成骨分化且促进骨质疏松 [J], 刘国樑;秦明照因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤段志斌;仇志强;彭鲲;徐泽敏;成科;陈翔;矢庆明【摘要】背景:研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞,Runx2 能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟,从而促进骨愈合.目的:探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作用.方法:①分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,用Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞,同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组),并设置未用慢病毒转染的空白对照组;转染48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计算转染效率,并用嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株;②将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断建立骨性关节炎模型,并随机分为生理盐水组、单纯骨髓间充质干细胞组、Runx2 转染骨髓间充质干细胞组;分别于小鼠膝关节腔内注射0.1 mL 生理盐水、0.1 mL含1×107个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水、0.1 mL含1×107个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水.结果与结论:①骨髓间充质干细胞表面标志抗原CD90、CD105高表达,慢病毒转染效率(88.57±3.07)%,经4 mg/L嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞;②Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整,无明显退化,关节面平整;其他2组软骨退变,关节面不平;③Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞多,软骨层厚;其他2组软骨细胞减少,软骨层变薄,且Runx2转染骨髓间充质干细胞组Mankin’s评分低于其他2组;④Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率大于其他2组,Ⅹ型胶原蛋白阳性率小于其他2组;⑤Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白蛋白及mRNA表达高于其他2组;⑥结果说明,Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞能够促进骨性关节炎关节损伤修复,从而为骨性关节炎的临床治疗提供新的方向.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2018(022)029【总页数】7页(P4607-4613)【关键词】Runx2;慢病毒;骨髓间充质干细胞;骨形成蛋白2;碱性磷酸酶;骨钙素;骨桥蛋白;骨性关节炎;干细胞【作者】段志斌;仇志强;彭鲲;徐泽敏;成科;陈翔;矢庆明【作者单位】南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,脊柱外科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000;南昌大学第二附属医院,创伤骨科,江西省南昌市 330000【正文语种】中文【中图分类】R394.2文章快速阅读：文题释义：慢病毒载体：慢病毒载体是调控生物基因表达与功能最常用的载体系统，能够将目的基因完整的整合至靶细胞，实现长期稳定的表达，具有转染效率高、免疫反应小等优点，该技术目前已成为研究基因功能和实现基因治疗的重要手段。
Runx2：Runx2基因位于人类常染色体的6p21，长约220 kb，包括8个外显子，并具有和其他家族成员相似的Runt结构域，是骨发育过程中调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成熟最关键的转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用。
0 引言 Introduction骨性关节炎是一种由于关节软骨变性、骨质增生而引起的慢性进行性骨关节疾病，其发病机制尚不明确[1-2]。
该病临床上主要表现为关节疼痛、活动受限和畸形，致残率较高，严重影响患者的生活质量[3]。
镇痛及抗炎药物是目前临床治疗骨性关节炎的主要手段，然而这些药物尚不能阻止疾病的发展，晚期患者需进行全关节置换，但是这种治疗手段费用高且并发症较多[4]。
近年来骨组织工程技术的快速发展为骨性关节炎的治疗带来了希望。
骨髓间充质干细胞可在骨形成蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等细胞生长因子的诱导下向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟，促进骨愈合[5-6]。
由于骨髓间充质干细胞取材方便，来源充足，在体外扩增后不会丢失多向分化潜能，移植后排斥反应小，所以非常适合作为骨组织工程技术的种子细胞[7-8]。
Runx2属于Runx蛋白家族，是一种能诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟的关键转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用[9-10]。
但既往研究多着重于其对疾病相关基因和蛋白表达的影响，缺乏对膝关节炎模型自身变化的研究[11-12]。
作者拟在检测骨性关节炎模型小鼠基因及蛋白表达的同时观察其影像学变化、组织学变化和相关评分变化，从而更好的反映Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作用，从而为骨性关节炎的临床治疗提供一定的指导。
1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计细胞学体外实验和动物体内实验观察。
1.2 时间及地点于2016年3月至2017年10月在南昌大学第二附属医院实验室完成。
1.3 材料实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，鼠龄3周，体质量约10 g，购自上海斯莱克实验动物中心，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，用于骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定。
实验经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准，批准号为20160123。
实验用主要试剂和仪器：Runx2过表达慢病毒载体购自美国System Biosciences 公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液购自美国Gibco公司；TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒(美国ABI Applied Biosystems公司；RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa 公司；兔抗鼠一抗(抗Runx2、抗骨形成蛋白2、抗碱性磷酸酶、抗骨钙素、抗骨桥蛋白)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，二氨基联苯胺显色试剂盒，均购自美国Santa Cruz；小鼠Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白免疫组化试剂盒购自美国R＆D公司；超净工作台、恒温CO2培养箱、酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；低温高速离心机、微量移液枪购自德国Eppendorff公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司。
1.4 方法1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定C57BL/6小鼠腹腔注射苯巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉处死后取出股骨，用含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液溶液反复冲洗，用无菌钳夹碎股骨两端，用骨髓间充质干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗液过滤后以1 500 r/min离心10 min弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的 DMEM培养液重悬细胞，以1×1010 L-1的细胞浓度将细胞接种于培养瓶，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
48 h后更换培养液，以后每3 d更换1次，细胞长满至85%时，利用骨髓间充质干细胞消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)进行消化，离心收集细胞后传代，收集第3代细胞用于后续实验。
利用流式细胞仪通过CD90和CD105表面抗原进行鉴定。
1.4.2 Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞及稳定转染细胞株筛选取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板，细胞长满至60%时，用感染复数为50的Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞，同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组)，以及未用慢病毒转染的正常培养细胞作为空白对照组。
转染48 h后，在荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白的表达情况，先在白光视野下计数细胞总数，再在荧光视野下计数表达荧光的细胞数目，转染效率=(荧光表达细胞数目/白光视野细胞总数)×100%，取10个视野，计算平均值。
取转染后的骨髓间充质干细胞接种于6孔板，加入不同质量浓度(0，1，2，3，4，5 mg/L)的嘌呤霉素，选择在10-14 d内让全部细胞死亡的最低浓度作为最佳筛选浓度。
另取转染后的骨髓间充质干细胞接种于6孔板，孵育24 h后加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素，每隔2 d更换新的含最佳筛选浓度嘌呤霉素的培养液，连续培养10 d。
收集抗性细胞，获得稳定转染细胞株。
1.4.3 骨性关节炎小鼠模型制备、分组和干预将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断以建立骨性关节炎模型[13]，建模2周后将30只小鼠随机分为3组，每组10只。
Runx2转染骨髓间充质干细胞组(n=10)膝关节腔内注射0.1 mL含1×107个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水；单纯骨髓间充质干细胞组(n=10)注射0.1 mL含1×107个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水；生理盐水组(n=10)注射0.1 mL生理盐水。
1.4.4 膝关节X射线片检查、软骨组织形态观察和免疫组织化学检测移植2周后，所有小鼠行侧位X射线片检查；之后处死各组小鼠，取膝关节软骨组织，行甲苯胺蓝染色，观察软骨组织形态，并根据Mankin's评分标准对软骨组织情况进行评分；另取膝关节软骨组织，行免疫组织化学检测Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达，所有操作按照免疫组化试剂盒说明进行。
1.4.5 反转录PCR检测取膝关节滑膜组织，Trizol法提取总RNA，A260/A280比值1.8-2.0提示样品RNA满足实验要求，按反转录试剂盒操作反转录成cDNA，进行PCR扩增分析，引物委托上海吉玛公司合成，Runx2上游：5'-TCT TCC CAA AGC CAG AGC G-3'，下游：5'-TGC CAT TCG AGG TGG TCG-3'。
骨形成蛋白2上游：5'-GCG TGC TTC TTA GAC GGA CTG-3'，下游：5'-CGT CAG AGG GCT GGG ATG-3'。
碱性磷酸酶上游：5'-GTC CCA CAA GAG CCC ACA AT-3'，下游：5'-CAA CGG CAG AGC CAG GAA T-3'。
骨钙素上游：5'-CAG TAA GGT GGT GAA TAG ACT CCG-3'，下游：5'-GGT GCC ATA GAT GCG CTT G-3'。
骨桥蛋白上游：5'-TGG ATG AAC CAA GCG TGG A-3'，下游：5'-TCG CCT GAC TGT CGA TAC CA-3'。