大肠菌群和粪大肠菌的检验

实验四大肠菌群和粪大肠菌的检验

一、实验目的要求

1、了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义。

2、学习并掌握大肠菌群检验的原理和方法。

二、原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般认为该菌群细菌可包括：大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称MPN）表示。

三、试剂和仪器

（一）最先准备的器材

规格名称数量用途

1、500ml广口瓶1个稀释样品

2、500ml三角瓶2个制生理盐水

3、250ml三角瓶1个制EMB琼脂

4、18×180mm试管8支稀释及制双料乳糖胆盐发酵管

5、18×150mm试管20～25支单料乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管

6、13×130mm试管20支制蛋白胨水、EC肉汤

7、1ml移液管 5 支

8、10ml移液管 3 支

9、直径为90mm平皿12套制EMB平板

10、250ml量筒1支

（二）应灭菌消毒的器材

剪刀1把开瓶器不锈钢药匙1把滴管胶头4只称量纸适量

（三）应制备的培养基

培养基总量所用容器

1、0.85%NaCl生理盐水300ml 500ml三角瓶

2、乳糖胆盐发酵管

双料：10ml/支5支60ml 18×180mm试管(装有导管)

单料：10ml/ 8支90ml 18×150mm试管(装有导管)

3、EMB琼脂：1瓶120ml 250ml三角瓶

4、乳糖发酵管：3ml/支5支20ml 13×130mm试管(装有导管)

5、EC肉汤：3ml/支6支20ml 13×130mm试管(装有导管)

6、蛋白胨水：2ml/支10支20ml 13×130mm试管

四、实验内容

（第一天）样品处理及初发酵接种：

所需培养基与器材：

? 培养基：

1. 0.85%NaCl生理盐水：300ml 1瓶

2. 乳糖胆盐发酵管

双料：10ml/支3～5支18×180mm试管(有导管)

单料：10ml/支6～8支18×150mm试管(有导管)

? 灭菌器材：

500ml广口瓶（内带5mm带玻璃珠）1～2个

18×180mm试管3支

250ml量筒1支

1ml移液管 5 支

10ml移液管3支

当样品袋装样品时：消毒酒精、棉花、无菌剪刀、称量纸、不锈钢药匙、橡皮胶头3只；当样品瓶装样品时：石炭酸消毒纱布两块、开瓶器。

（一）、样品处理（无菌操作）

? 样品：瓶装饮料或酿造酒类：

用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌的开瓶器将盖打开，将含二氧化碳的样品倒入一信灭菌瓶内，加盖假盖，口勿盖紧，在其上覆盖在一块灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，妈样进行稀释。

? 乳制品：

袋装奶粉用75%的酒精棉球涂擦消毒袋口，以无菌操作取样，放入灭菌的三角瓶内，将225mL 温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先用少量生理盐水将奶粉调成糊状，再全部加入，以免结块）。（二）、检样稀释与乳糖胆盐发酵试验----[初发酵]（无菌操作）

1、用无菌量筒量取225mL灭菌生理盐水倒入灭菌玻璃瓶内，用10ml移液管吸取9mL生理盐水注入无菌试管中，共2支，备用。

2、以无菌操作将检样25mL(g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。

3、用10ml移液管吸取1：10的稀释液10ml分别注入双料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

4、用1ml移液管吸取1∶10的稀释液1ml分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

5、用同上一支1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，换一支吸管，吸吹5次，或振摇试管混匀，做成1∶100的稀释液。再用这支吸管吸取1∶100稀释液1mL分别注入单料乳糖胆盐发酵管中：共3支。

? 注意：做10倍递增稀释时，每递增稀释一次，要换用1支1mL灭菌吸管。

? 放入培养箱培养：

将接种后的乳糖胆盐发酵管置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产酸产气者（培养液由紫蓝色变成黄色并有气泡），则按下列程序进行试验。

（第二天）进行EMB平板分离，[EC肉汤、蛋白胨水接种（粪大肠菌群检验）]：（无菌操作）所需培养基与器材：

? 培养基：

1. EMB琼脂平板5只

2. EC肉汤：5支

3. 蛋白胨水：5支

? 器材：

44.5±0.2℃水浴箱，接种环。

（一）、接种EMB平板进行分离培养

将产气的发酵管分别转种在EMB琼脂平板上（一管对一个平板），置36±1℃温箱内，培养18～24h，然后取出，观察菌落形态，并挑取可疑菌落做：革兰氏染色和证实试验。

在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选。

（二）、接种EC肉汤（用于粪大肠菌群检验）

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于EC肉汤管内（一管对一个管），置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面)，培养24±2h。经培养后，如所有EC 肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。

（三）、接种蛋白胨水：（用于粪大肠菌群检验）

用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物转种于蛋白胨水内（一管对一个管），置44.5±0.2℃水浴箱内，培养24±2h。同时取一蛋白胨水培养基不接种，一起培养做对照试验。（第三天）进行乳糖发酵（证实试验）接种、镜检、靛基质试验、观察EC肉汤发酵结果

所需培养基与器材：

? 培养基：

1. 乳糖发酵管：5支

2. 靛基质试剂、（欧—波试剂）

3. 革兰氏染色液

? 器材：显微镜

（一）、乳糖发酵接种

在EMB平板上的典型菌落：呈紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常有金属光泽。由于药物影响，亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等，常为大肠杆菌，均应注意挑选

从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。

（二）、进行镜检

从EMB平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1～2个进行革兰氏染色。大肠菌群菌：革兰氏染色阴性无芽胞短杆菌。

（三）、进行靛基质试验

向培养后的蛋白胨水中沿管壁加入靛基质试剂（欧—波试剂）0.5mL，静置片刻，观察液面。阳性反应者，液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。则证实为粪大肠菌群阳性。（四）、观察EC肉汤发酵结果

如所有EC肉汤管均不产气，则可报告：为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养18～24h，凡平板上有典型菌落者，则证实：为粪大肠菌群阳性。

（第四天）观察乳糖发酵结果及器材的消毒和清洗

（一）、观察乳糖发酵结果

观察：乳糖发酵管内是否有气体产生

? 凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。（二）、查表报告结果

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)大肠菌群的MPN 值。

根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN 值。