生物工程复习资料(缩)

第一节生物工程的概述

1.1生物工程的产生及定义

.生物工程的定义：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的，即现代生物工程技术。

1.2生物工程的种类

.基因工程.细胞工程.发酵工程.酶工程.蛋白质工程应用：农业、环境、食品、医药等多个方面基因工程

.基因工程（gene engineering）是指在基因水平上的操作井改变生物遗传特性的技术。

细胞工程

.细胞工程（cellengineering）是指以细胞为基本

单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术。细胞工程主要包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术（也称细胞杂交技术）、细胞器移植技术等。

发酵工程

发酵工程（fermentationengineering）是指利用

包括工程微生物在内的某些微生物或动、植物细胞及其特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化、大型化）生产各种特定的有用物质；或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。由于发酵多与微生物密切联系在一起，所以又有微生物工程或微生物发酵工程之称。。

酶工程

.利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能以及对酶进行的修饰改造，并借助于生物反应器生产人类所需产品的一项技术。

.主要包括酶的固定化技术、细胞固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计技术等。

蛋白质工程

蛋白质工程（protein engineering）这一名称是1981年由美国基因公司的Ulmer提出的，它是指在基因工程的基础上，结合蛋白质晶体学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，对蛋白质进行修饰、改造、拼接，以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术。生物工程发展的趋势

.目前三个平台：DNA重组、细胞培养和DNA -H- t_L 心片

.未来将会形成的几个新的平台

1. 基因组平台

2. 生物芯片

3. 干细胞生物学

4. 生物信息学

5. 神经科学

弟二草基因工肝第一节基因工程基础基因工程gene engineering .运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。

基因工程的基本过程就是利用重组DNA （recomb in a nt DNA）技术，在体外通过人工“剪切（cut）”和“拼接（splice）”等方法，

对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，并使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因。基因工程是用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。基因工程研究的理论依据

①不同的基因有相同的物质基础

②基因是可切割的

③基因是可转移的

④多肽与基因之间存在对应关系

⑤遗传密码是通用的

⑥基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因工程技术路线1、DNA片段的取得（目的基因的分离和制备）

切

2、DNA片段和载体的连接——重组体DNA

接

3、外源DNA片段引入受体细胞一一基因克隆和

基因文库——转

4、选择基因（目的基因）——选

5、目的基因表达——表达

1.1基因工程的工具酶

限制性核酸内切酶 ------ 基因的剪刀

DNA聚合酶...... 基因的针线

DNA连接酶

限制性核酸内切酶

.一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷

酸序列的内切核酸酶。

.restricti on endon uclease

.这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶。

.根据酶的功能、大小和反应条件，及切割D NA

的特点，可以将限制性内切酶分为三类：I型

酶、n型酶、皿型酶

.I型酶不适合做基因工程的工具酶

.皿型酶在基因工程中也不常用

.n型酶是基因工程理想的工具酶

n型限制性核酸内切酶的基本特性

1、识别序列和切割位点

2、切割方式

3、同尾酶和同裂酶

4、限制性片段长度：经限制性核酸内切酶切割

后产生的DNA片段。

切割频率：某限制酶在该DNA切割位点出现频

率

1、识别序列

.可识别长度为4-7bp的双链DNA特定序列，该

识别序列（识别位点）常呈旋转对称性。

1、切割位点

.切割位点与其识别序列一致，在其识别序列内切

割DNA o

2、切割方式

3、同尾酶和同裂酶

.指来源不同、识别序列不同但产生相同的粘性末

端的核酸内切酶。

.同裂酶指来源不同、而识别序列和切割方式均相

同的核酸内切酶。

DNA连接酶

.能够将两端DNA拼接起来的酶类

.原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：

E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。

.最常见的是T4噬菌体DNA连接酶

.DNA连接酶能够催化DNA链上彼此相邻的3'-

羟基（0H ）和5'-磷酸基团（-P），形成磷酸二

酯键。

.DNA连接酶就可以用来在体外连接DNA片段

.DNA连接酶的作用

.是将双螺旋DNA分子的某一条链上两个相邻核

苷酸之失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口封

闭起来，即催化3'-OH和5'-p之间形成磷酸二

酯键，从而将具黏性末端的双链DNA、平末端双

链DNA以及带缺口的双链DNA连接起来。

原核生物主要有两种类型的DNA连接酶

.E. coli DNA连接酶

.T4DNA连接酶

.催化反应能量来源不同

.T4DNA连接酶用ATP而E coliDNA连接酶则用

NAD

.催化平末端连接的能力不同

.只有T4DNA连接酶能够连接两条平末端的

双螺旋的DNA片段

DNA聚合酶

催化DNA体外合成反应

（一）常用的DNA聚合酶:

.大肠杆菌DNA聚合酶

.大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片断酶

.T4噬菌体DNA聚合酶

.T7噬菌体DNA聚合酶

.Taq DNA聚合酶

DNA 聚合酶l（DNasel是—种

单链多肽蛋白质，具有三种不同的酶催活性，即

5'一3的聚合酶活性、5'一3'的核酸外切酶活性

和3'一 5 '的核酸外切酶活性。主要用途是通过

DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射

性标记的DNA探针

Klenow酶的主要用途

.①修补经限制性内切酶消化或其他方法所形成的

5'或3'突出末端，制备平末端。

.②对具有3'隐蔽末端的DNA片段作放射性末端

标记。

.③cDNA克隆中的第二链cDNA的合成。

.④DNA序列测定。

T4DNA聚合酶

.这是由T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物纯化而

来，具有两种酶催活性，即5'一3'的聚合酶活

性和3'一 5 '的核酸外切酶活性。主要用途

.①可将任何形式的双链DNA制备成平末端的双

链DNA o

.外切酶的活性比Klenow酶强200倍，并且在

高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止

.②进行双链DNA的3 '末端标记。

T7DNA聚合酶

具有5'一 3 '的聚合酶活性和3'- 5的核酸外切

酶活性

.主要用途：

.①用于拷贝大分子量模板的引物延伸反应；.②

如同DNA聚合酶一样，可通过单纯的延伸或取

代合成的途径，标记DNA的3'末端，也可用来

将双链DNA的5'或3突出端转变成平末端的结

构。

修饰的T7DNA聚合酶

.对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失

去3'一5'的核酸外切酶活性

.修饰的T7DNA聚合酶的加工能力以及在单链模

板上的聚合作用的速率增加了 3 —9倍.测序时

常用此酶，故亦称测序酶

TaqDNA聚合酶

.最适的活性温度是72 C,连续保温30min 仍具有

相当的活性

.在补加有四种脱氧核苷三磷酸的反应体系中，能

以高温变性的靶DNA分离出来的单链

DNA为模板，按5' -3'的方向合成新生

的互补链DNA o

（二）分子克隆中常用的其他工具酶

.甲基化酶

.末端转移酶

.碱性磷酸酶

.逆转录酶

.S1核酸酶

.Bal31植酸酶

1.2基因工程的载体

.Vector，本质是DNA

.携带外源基因进入到受体细胞的运载工具载体的

功能：

.运送外源基因高效转入受体细胞

.为外源基因提供复制能力或整合能力

.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

基因克隆载体具备条件

.在克隆载体合适的位置含有允许外源DNA

片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点

应尽可能的

多。

.克隆载体能携带外源DNA片段进入受体细胞，

或停留在细胞质中进行自我复制；或整合到染色

体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA 中，随这些

DNA同步复制。

基因克隆载体具备条件

.具有能够直接观察的表型特征

.克隆载体必须是安全的。

.易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。

2基因克隆载体分类

根据导入的受体生物。可以分为：

.大肠杆菌载体

.植物载体

.酵母载体

.动物载体

将外源DNA导入原核生物细胞-大肠杆菌载体

.质粒载体

.噬菌体载体

.柯斯质粒载体

1、质粒载体质粒(plasmid)是指细菌等生物细胞内一类独立于染色体外而能自我复制的遗传物质，一般为双链的共价闭合环状

DNA o

pBR322质粒载体：

“ P'表示是一种质粒；

“ BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字

母

“F.Bilivar和R.L.Rodriguez ”；

“ 322 ”表示实验编号。

质粒载体的条件

一种理想的用作克隆载体的质粒必须满足如下几方面的条件。

1. 具有复制起点

2. 具有抗菌素抗性基因

3. 具有若干限制酶单一识别位点

4. 具有较小的分子量和较高的拷贝数pBR322质粒载体的优点：

1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过

10kb o

2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其

中7种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，

3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可积累1000-3000拷贝。

2、噬菌体载体

噬菌体是一类细菌病毒的总称

.噬菌体颗粒的外壳是蛋白质，内部是核酸。

.噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期。.只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性

噬菌体。

.具有溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体。

2、噬菌体载体

.入噬菌体载体

.M13噬菌体载体

.噬菌粒载体

3、柯斯质粒载体

.也称黏粒载体，是指一类由人工构建的含有入DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体

.入噬菌体基因组是一长度为48 502bp的线性双链DNA分子，其末端为长12个核苷酸的互补单链，称为粘端(cohesive end, cos)。这是将DNA 包装到入噬菌体颗粒中所需的

DNA序列。

.入噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以以环状形式存在，并且能够自然成环。

入噬菌体载体的类型

.1 .插入型载体

.插入型的入载体又分免疫功能失活和大肠杆菌B 半乳

糖苷酶失活两种亚型。

.前者凡有外源DNA插入的入重组体都能形成清晰的噬菌斑

.后者形成无色(浅蓝色)的噬菌斑

.2 .置换型载体

.在入载体非必要区的两侧含有核酸限制性内切酶两个切点，两个切点间的片段被取代后不影响噬菌体生活力的载体。可插入长度约为20kb的外源DNA o在可取代的区段中带有lacZ基因的相应序列时，入重组体亦可用B半乳糖苷酶失活法进行筛选。

核酸分子探针的标记

.探针是指在化学及生物学意义上能与特定的靶分子发生特异性相互作用，并可被特殊的方法所测

定的分子。

.核酸分子探针是指能与互补核酸系列复性杂交的

特定已知核苷酸片断。

核酸分子探针的标记

.切刻平移法

.随机引物法

.末端标记法

.随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷

酸片断的混合物。

.随机引物法是近年发展起来的一种较理想的核酸

探针的标记方法。

核酸分子的杂交核酸分子

.是基因工程及分子生物学领域中最常用的基本技

术之一

.是基于在适宜的温度及离子强度等条件下，具有

一定同源性的两条核苷酸单链可按碱基互补原则

复性杂交形成双链的原理建立的.杂交的两条单链

分别是核酸探针和待测核酸

杂交的分类

.核酸原位杂交

.菌落原位杂交

.斑点狭缝杂交

.膜上吸印杂交(目前最常用的一种核酸分子杂交

.目的基因与载体的重组

.将重组体导入受体细胞

.重组转化体的筛选和鉴定

.克隆基因的表达

2.1目的基因的分离与制备

.外源基因(Foreign gene):插入到载体内的非自

身的DNA片段

.目的基因(Objective gene)是指准备导入受体细

胞内的，以研究或应用为目的所需要的外源基因

称目的基因。

.基因化学合成法DNA自动合成仪.基因生物制备

法

.cDNA文库法

.基因组文库法

.基因分离的物理化学方法

.鸟枪法(shot gun)

.cDNA文库的建立与基因的分离.直接从特定的

mRNA分离基因.基因组文库的建立和基因的分

离.从蛋白质人手分离编码此蛋白的基因.基因化

学合成法

利用PCF法或RT-PC盼离基因

基因分离的物理化学方法

.根据DNA分子的两条链存在着G三C、A=T份

别代表GC间的三个氢键、AT间二个氢键)碱基

配对。女口DNA分子中某段的G三C碱基对含

量高，则其热稳定性就高，即其熔解温度仃m)

直就高。这样，人们可以通过控制熔解使富A=T

区解链变性，而富G三C区仍维持双链。当利

用单链核酸酶s1酶去除解开的单链部分，得到

富G- C区的DNA片段。海胆rDNA基因的分

离就是一例。

鸟枪法(shot gun)

.这一方法又叫霰弹法。这一方法是绕过特定基因

分离这一关口，用生物化学方法，如用限制性内

切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度

上同一般基因大小相当的DNA片

段(o. 8 X106?9X 106道尔顿)。然后，将这些

片段混合物随机地重组入适当的载体，转化后在

受体菌(如E. coli)中进行扩增，再用适当的筛选

方法筛选出你所要的基因。

.基因组文库法

.直接从基因组中分离目的基因的方法.以适当的

目的基因片段作探针，利用高密度

的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑

或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑

或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即

可获得所需要的目的基因片段。

.cDNA文库法

.cDNA:具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单

链DNA即complementaryDNA之缩写，或此

DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所

形成的DNA双链。

.以适当的目的基因片段作探针，利用高密度

的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑

或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑

或菌落，再经过扩增，提取其中的重组体，最后即

可获得所需要的目的基因片段。

cDNA文库的建立方法

.1 .分离表达目的基因的组织或细胞

.2 .从组织和细胞中制备总体RNA和mRNA .3 .

第一条cDNA链的合成

.4 .第二条cDNA链的合成

.(i)自身引导法(图1-15)

.(ii)cDNA第二条链的置换合成法

.(iii)引物一衔接头法合成双链cDNA

.5. cDNA的甲基化和接头的加入

.6 .双链cDNA与载体的连接第一条互补DNA链

的合成需要RNA模板、cDNA合成引物、反转

录酶、4种脱氧核苷三磷酸以及相应的缓冲液

(Mg2+)等。

作为第一条链合成反应产物的cDNA：mRNA

杂交分子充当切口平移的模板。

基因的化学合成

1. 基因片段的全化学合成：

所谓基因片段的全化学合成是首先合成组成一个

基因的所有片段，相邻的片段间有4?6 个碱基的

重叠互补，在适当的条件下(主要是温度条件)经

退火后，用T4 DNA连接酶将各片段以磷酸二酯

键的共价键形式连接成一个完整的基因。

.2 .基因的化学一酶促合成：

.此方法的特点是不需要合成组成完整基因的所有

寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的

3'—末端有一短的顺序相互补，在适当的条件下

通过退火形成模板—引物的复合体(template-

primer complex)，然后在存在四种dNTP的条件

下，用E. coli的DNA聚合酶I大片段(Klenow片

段)去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA

连接酶连接及适当的限制性内切酶切割后重组入

载体

.PCR 法

.通过PCR技术获取所需要的特异DNA片段在

实际应用用得非常多，但是前提条件是必须对目

的基因有一定的了解，需要设计引物。 2.2目的

基因与载体的重组

黏性末端连接

1、由同一种限制性核酸内切酶切割的不同DNA

片段具有完全相同的末端；

2、由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA

片段具有相同类型的黏性末端；

.如果目的基因的DNA 片段是用限制性内切酶切

割并有黏性末端，则用同一种限制性内切酶处理

载体DNA，使其成为黏性末端。切下的目的基因

的片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA

连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段

的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一

个重组DNA分子。平末端连接连接平末端

DNA分子的方法有4种：

（1）直接用T4DNA连接酶连接；

（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA

分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行

连接；

（3）用衔接物连接平末端DNA分子；

（4）DNA接头连接法。

（1）T4DNA连接酶除了能够封闭具有3, —

OH和5' —P末端的双链DNA的缺口之外，

在存在ATP和加入高浓度酶（10-100倍）和低

浓度的聚乙二醇PEG8000存在的条件下，它还

能够连接具有完全碱基配对的平末端的DNA分

子。这种反应的原因目前尚不清楚。但平末端连

接效率不高，基因操作不经常采用。且外源DNA

不能原位删除下来。

（2）同聚物加尾连接平末端DNA片段运用末端核苷酸转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体），加到DNA 分子单链延伸末端的3，一OH 基团上，它并不需要模板链的存在，它一个一个加上核苷酸，构成由核苷酸组成的尾巴，长度可达100个核苷酸。

.优点在于：①不易自身环化，这是因为同一种DNA分子两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。②因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。③ 用任何一种方法制备的DNA片段都可以用这种方法进行连接。.同聚物加尾法的不足之处：①方法烦琐；② 外源片段难以回收。另外．由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。还要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会重新产生某种核酸限制性内切酶的切点。

.（3）用衔接物连接平末端DNA分子.如果重组体DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么就无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用衔接物法提供必要的序列，进行DNA 分子的连接。

.所谓衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10—12 个核苷酸组成的、具有一个或

数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。

.衔接物的5,-末端和待克隆的DNA片段5, —末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。于是便可以按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来

（4）DNA接头连接法

.DNA 衔接物连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。.当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的衔接物，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头（adapter）连接法。

.DNA接头（adapter）连接法于1978年由康乃

尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。

导入方法

.1. CaCI2处理后的细菌转化或转染。.2．高压电穿孔法。

.3.聚乙二醇介导的原生质体转化法。.4 .磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染。.5.原生质体融合。

.6 .脂质体法。

.7.细胞核的显微注射法。

.1. CaCl2处理后的细菌转化或转染。这是将重组的质粒或噬菌体DNA导入细菌中所用的常规方法，前者叫转化（transformation）后者叫转染（transfection）。作为受体细胞的细菌经一定浓度的冰冷CaCl2（50-100mmol/ L）溶液处理后变成所谓感受态细胞（Competent cells）

处在感受态的菌体有摄取各种外源DNA的能力。

.注意以下几点：（a）用作受体菌的细胞在培养时要掌握好细胞密度，一般在OD 600为0. 4 左右为好。（b）制备受体细胞的整个过程要在0?4C进行，并尽量避免污染。如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。（c）为了提高转化率，可选用复合CaCl2溶液如“分子克隆”一书所介绍的FSB

溶液。

2. 高压电穿孔法。通过调节外加电场的强度、电脉冲的长度和用于转化的DNA浓度可将外源DNA导入细菌或真核细胞。用电穿孔法实现基因

导入比CaCl2法方便，对细菌而言其转化效率可

达109?1010转化体/微克

DNA，但必须有专门仪器

3. 聚乙二

醇介导的原生质体转化法。这种方

法常用于转化酵母细胞以及其它真菌细胞。活跃

生长的细胞或菌丝体用消化细胞壁的酶（如

driselase）处理变成球形体后，在适当浓度的聚

乙二醇6000（PEG —6000）的介导下将外源

DNA转化入受体细胞中。

.4 .磷酸钙或DEAE葡聚糖介导的转染。这是将

外源基因导入哺乳类细胞中进行瞬时表达的常规

方法。用磷酸钙和DNA共沉淀方法时是将被转

染的DNA同正在溶液中形成的磷酸钙微粒共沉

淀后可能通过内吞作用进入受体细胞。

5. 原生质体融合。通过带有多拷贝重组质粒

的细菌原生质体同培养的哺乳细胞直接融合。经

过细胞膜融合，细菌内容物转入动物细胞质中，

质粒DNA被转移到细胞核中。.6 .脂质体法。将

DNA或RNA包裹于脂质体内，然后进行脂质体

与细胞膜融合将基因导入。

.7.细胞核的显微注射法。即将目的基因重组体通

过显微注射装置直接注入细胞核中。 2.4重组转

化体的筛选和鉴定

筛选和鉴定

遗传检测

核酸分析法物理检测法目的基因转录产物检

测目的基因翻译产物检测

一、遗传检测根据载体表型特征的筛选

抗药性标记

半乳糖苷酶显色反应根据插入基因遗传

性状的筛选

二、核酸分析法

（一）PCR法

（二）核酸杂交法菌落印迹原位杂交斑点印迹

杂交Southern 印迹杂交

（三）DNA测序法

（一）PCR 法

.根据含目的基因两端或两侧已知核苷酸序列，设

计合成一对引物，以待鉴定的克隆子的总DNA

为模板进行扩增，若获得特异性扩增DNA片

段，表明待鉴定的克隆子含有目的基因。而采用

DNA分子杂交的方法，只能在被杂交的DNA中

存在目的基因的一部分DNA 序列，就会出现杂交

信号。

（二）核酸杂交法

1 .菌落印迹原位杂交.将被筛选的菌落或噬菌

斑，从其生长的琼脂平板中通过影印方法，小

心地原位转移到放在琼脂平板表面的硝酸纤维素

滤膜上，并保存好原来的菌落或噬菌斑平板作为

参照。将影印的硝酸纤维素滤膜，用碱液处理，

促使细菌细胞壁原位裂解、释放出DNA并随之

原位变性。然后80C下烘烤滤膜，使变性DNA

原位同硝酸纤维素滤膜形成不可逆的结合。将这

块固定有DNA印迹的滤膜干燥后，同放射性标

记的特异性DNA或RNA探针杂交，漂洗除去多

余的探针，最后经放射自显影检测杂交的结果。

含有同探针序列同源的DNA的印迹，在x 光底

片上呈现黑色的斑点，将胶片同原先保存的参照

平板进行对照，即可确定阳性菌落或噬菌斑的位

置，从而获得含有目的基因插入片段的重组础工

业体克隆。

2. 斑点印迹杂交.斑点印迹杂交法与菌落印迹原

位杂交的原理一样，但方法更简单、迅速，可直

接将噬菌体的上清液或是由转化子提取的DNA

（RNA）样品直接点在硝酸纤维素滤膜等固体支

持物上，然后同核酸探针进行分子杂交。通过放

射自显影，从底片中找出黑点即为阳性斑点。

此方法常用于病毒核酸的定量检测。

3. Southern 印迹杂交

.它首先将初筛的重组DNA提取出来，用合适的

核酸限制性内切酶将DNA切割，并进行凝胶电

泳分离，然后经碱变性，利用干燥的吸水纸产生

的毛细作用，让液体流经凝胶，使DNA片段由液

流携带，从凝胶转移并结合在硝酸纤维素滤膜的

表面，最后将此膜同标记的核酸探针进行分子杂

交。如果被检测DNA 片段与核酸探针具有互补序

列，就能在被检测DNA的条带部位结合成双链

的杂交分子，并通过放射自显影显示出黑色条带

来。

（三）DNA测序法.进行目的基因的核苷酸测

序。如果待测序的目的基因比较大，测序有困

难，也可用RFLP限制性片段长度多态性）技

术。.用限制性内切酶对待克隆的目的基因和已

克隆的目的基因进行切割，若凝胶电泳结果不一

致，可断定克隆子中克隆的不是目的基因，或者

克隆的目的基因的核苷酸序列已发生了变化。经

多种限制性内切酶切割分析，若两种结果都一

样，可认为克隆子中克隆的是原定的目的基因，

其核苷酸序列没有变化。

三、物理检测法

（一）凝胶电泳检测法:利用凝胶电泳检测重

组质粒DNA分子的大小，也可以初步证明外源

目的基因片段是否已插入载体。

（二）R环检测法：采用mRNA作探针，利用电

子显微镜观察其核酸杂交结果。在临近双链DNA

的变性温度下和高浓度（70％）的甲酰胺溶液

中，双链的DNA—RNA分子要比双链的DNA—

DNA分子更为稳定。因此，当RNA探针及待测

DNA 的混合物置于这种退火条件下，RNA便会

同它的购DNA分子中的互补序列退火形成稳定

的DNA— RNA杂交分子，而使被取代的DNA

链处于单链状态。这种由单链DNA分支和双链

DNA-RNA分支形成的“泡状”体，叫做R环结

构。

四、目的基因转录产物检测

.用RNA印迹（Northern blotting）法检测。根据

转录的RNA 在一定条件下可以同转录该种RNA

的模板DNA链进行杂交的特性，制备目的基因

DNA 探针，变性后同克隆子总RNA 杂交，若出

现明显的杂交信号，可以认定进入受体细胞的目

的基因转录出相应的mRNA。

五、目的基因翻译产物检测

.最常用的是蛋白质印迹（Western-blotting）

法。提取克隆子总蛋白质，经SDS-聚丙烯酰胺

凝胶电泳按分子大小分开后，转移到供杂交用的

膜上，随后与放射性同位素或非放射性标记物标

记的特异性抗体结合，通过一系列抗原抗体反

应，在杂交膜上显示出明显的杂交信号，表明受

体细胞中存在目的基因表达产物。

2.5基因工程的应用一、基础理论研究：

.基因的结构与功能。

.基因的人工定点突变。

.人类基因组计划

小结

.基因工程是一项非常复杂的技术操作，它的

环节之繁多、操作之细致是其他工程所无法比拟

的。但是如果抛开细节问题，基因工程操作流程

还是比较明了的。它的基本步骤可以大致归纳如

下：

.（1）获取目的基因，即用各种不同的方法取得

人所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里

面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获

取目的基因是基因工程操作的关键。

.（2）获取基因载体。用人工方法，取得目的基

因的适宜的载体，即质粒或病毒。载体一般带有

必要的标志基因，以便进行检测。

.（3）重组DNA,即用人工方法，让目的基因与

运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一

些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然

后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载

体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物

体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重

组。从这里就可以看出工具酶的重要性，没有它

们，重组工作就寸步难行。

.（4）把重组DNA导入受体细胞进行扩增，即

用人工方法，让携带着目的基因的运载体进入新

的生物细胞里，让其增殖，由此形成重组DNA

的无性生殖系（即克隆）。

.（5）筛选与培育，即基因表达产物的鉴定、收

集和加工等一系列复杂过程的综合。前几步工作

是“播种”，这一步工作则是“收获”。

“收获”工作比较复杂，这里不再介绍。作业

.基因工程的定义、研究内容.基因工程研究的理论依据是什么？.基因工程的工具酶有哪些？其作用是什么？

.基因工程的载体有哪些？载体的功能有哪些？.Southern杂交、Northern杂交的概念是什

么？

.PCR技术的概念、原理及步骤| .目的基因的制备方法有哪些？.目的基因与载体重组过程中平末端连接方式有哪

Protein Engineering

§ 3--1蛋白结构基础和蛋白质工程的原理蛋白质结构的基本构件在自然界中，构成生命最基本的物质有蛋白质、核酸、多糖和脂类等生物大分子，其中蛋白质最为重要，核酸则最为根本。

各种生物功能、生命现象和生理活动往往是通过蛋白质来实现的，蛋白质不仅是生物体的重要组分，更重要的是它与生命活动有着十分密切的关系。

在体内，蛋白质执行着酶催化作用，使新陈代谢能有序地进行，从而表现出各种生命的现象；通过激素的调节代谢作用，以确保动物正常的生理活动；产生相应的抗体蛋白，使人和动物具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力；构建成的各种生物膜，形成生物体内物质和信息交流的通路和能量转换的场所。

蛋白质的生理功能白质是一切生命活动的体现者：构成细胞和生物体的主要成分调节作用：酶，部分激素（如胰岛素、生长激素）

运输作用：如血红蛋白、载体、肌红蛋白（贮氧）

免疫作用：如抗体

运动作用：如肌动蛋白、肌球蛋白

凝血：如纤维蛋白

化学组成

蛋白质经干燥后，其元素组成平均值约为：碳：50 —55%;氢：6.0—7.0%;氧：20—23%;

氮：15—17%;硫：0.3-2.5 %分子量：10，000 —1，000，000 道尔顿

生产上常把蛋白质不完全水解的产物按分子大小分别称为shi、胨、肽。shi和胨仅用于表示分子量较大但不确定的多肽混合物。

短肽可以进一步水解成氨基酸，并成为蛋白质水解的最小单位，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有20种，除了脯基酸外，所有的氨基酸均可一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合失去一分子水，形成酰胺键，这种氨基酸之间连接的酰胺键又称为肽键，一般由三个或三个以上的氨基酸残基组成的肽称为多肽。

蛋白质的分子结构可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构，这种结构由各种化学键组成。蛋白质的分子构象又称为空间结构、高级结构、立体结构、三维结构等等，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的摆布情况规律。

蛋白质是由许多氨基酸按一定的排列顺序通过肽键相连而成的多肽链。蛋白质的肽链结构成为蛋白质的化学结构，它包括氨基酸组成、肽链数目、末端组成、氨基酸排列顺序和二硫键位置等。

蛋白质的一级结构就是由许多氨基酸序列按照一定的排列顺序，通过肽键相连接而成的多肽链结构，每一种蛋白质的肽链的氨基酸都有一定的排列顺序。蛋白质的一级结构是最基本的，它包含着决定蛋白质的高级结构的关键性因素。

蛋白质的二级结构是指多肽链主链骨架中的若干肽段，各自沿着某个轴盘旋或折叠，并以氢键维系，从而形成有规则的构象。如a -

螺旋、B -折叠和B -转角等。a -螺旋和B -折叠是蛋白质构象的重要单元。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。

a -螺旋的螺距（pitch ）5.4A，螺旋每绕一圈（360）为3.8个氨基酸残基，每个重复单位沿螺旋轴上升1.5A。

B -折叠是一种肽链相对伸展的结构。在这种结构模型中，肽链按层排列，在相邻的肽链之间形成氢键，得以巩固这种结构。在天然蛋白质变性

时，往往就包含a -螺旋向B -折叠的转变。

在自然界中，多数蛋白质的空间结构呈球状。环

球蛋白是在三维空间中沿着多方向进行卷曲、折

叠、盘绕而成的近似球形结构。这种在二级结构

基础上的肽链再折叠，称为蛋白质的三级结构。

维持蛋白质构象的作用力有四种共价键类型：

①R基之间的氢键；②非极性R基之间的疏水基

相互作用（范德华引力）；3a -螺旋和B -折叠中

的肽链内或肽链间德氢键；④ 带正负电荷的R基

之间的离子键。维持蛋白质的三级结构最重要的

作用力是疏水键的相互作用。

从共价结构上看，亚基就是蛋白质分子的最小共

价单位。亚基一般是由一条多肽链组成的，但有

的亚基也可以由几条多肽链组成，这些多肽链通

常以二硫键相连接称为亚基。由亚基聚合而成的

蛋白质分子称为寡聚蛋白。由亚基组成的寡聚蛋

白结构被称为四级结构，侧重强调亚基之间的相

互作用和空间排布情况。

维持四级结构的主要力靠疏水键。四级结构中的

聚合物，大致可分为不对称性的聚合物和对称性

的聚合物。构成四级结构的原体可排列成二聚

体、三聚体、四聚体、五聚体，最多可聚合成六

十聚体等。

蛋白质分子之间的相互作用

在一定条件下，蛋白质亚基的聚合可以被解离成

游离的亚基，但在适当的条件下，这些游离的亚基

又能重新聚合成具有四级结构的蛋白质分子。

在特殊环境条件下，某些具有四级结构的蛋白质

分子之间，一种蛋白质分子的亚基可以与另一种

蛋白质的亚基聚合，并产生有活性的杂交分子。这

一过程也是一种分子杂交。不少多肽和蛋白质分

子，不论其是否由亚基组成，都能聚合成聚合物。

蛋白质结构与功能的关系

蛋白质分子所具有的多种多样的生物学功能是与

它们特殊的和复杂的结构紧密相关的。一般来说，

蛋白质结构与功能的关系包含着两个方面的问题：

①蛋白质必须具备特定的结构，才能表现特定的

功能，在蛋白质肽链中有一些基团对特定功能而

言是必需基团，另一些是非必需基团；②在体内，

蛋白质分子是如何利用它的特定结构执行特定的

生物功能的。

目前，在化学结构和空间结构已经阐明的酶蛋白，

其酶分子的活性中心与底物结合时，整个酶分子

的立体构象有所扭动，这种扭动引起的张力正是

促使底物化学键容易发生断裂的基本原因。这种

张力也是依靠酶分子中的许多非活性中心部位的

协调作用而发生的。

蛋白质工程的原理

以蛋白质结构与功能的研究为基础，掌握蛋白质

活性中心的结构，了解构成中心的各氨基酸残基

及其侧链基团的位置，再借助计算机图像与处理

系统的模拟进行分子设计，提出对目的蛋白质的

改建或构建方案，确定活性中心的氨基酸残基组

成，并辅助设计和预测其结构功能的变化。同时计

算机辅助处理系统可以通过生物物理学原理，模

拟预测氨基酸序列的变化对蛋白质空间结构的影

响。按照目的蛋白质分子的改进或构建方案，进

行编码该蛋白质基因的修饰和合成，再通过遗传

工程途径，在适当的载体表达系统中表达所需要

的蛋白质。通过这一过程的重复进行，最终符合目

的蛋白质分子的结构、性质和功能设计的要求。

蛋白质工程操作中的问题

1、有关分子遗传学和基因工程的问题；

如更有效cDNA克隆技术，精确高效的定位突变

技术，高效目的基因表达系统等等。

2、有关蛋白质结构功能研究的理论和技术；如

准确地由一级机构推测高级机构、肽链折叠的精

确控制，蛋白质的翻译后修饰，蛋白质结构可变

性，分

子动力学与蛋白质功能的关系，蛋白质在晶体、

液体以及细胞中的不同存在状态及其对蛋白质性

质、功能的影响等等。

§ |3-2 蛋白质工程的工作定义- .建立蛋白质工程

的研究方法系统.随机诱变基因库的定向筛选.研

究蛋白质结构与功能的关系.严格意义上的蛋白质

工程 2.1建立蛋白质工程的研究方法系统.在研究

某些蛋白质一级结构及其结构功能元件相互关系

的基础上建立起应用蛋白质工程方法的系统。

2.2随机诱变基因库的定向筛选

.利用目的基因表型具有高效检测筛选系统这一特

性，在目标条件下从随机诱变基因库中分离出目

标基因，最终获得突变蛋白质。 2.3研究蛋白质

结构与功能的关系

.利用各种方法，包括蛋白质工程的方法，研究和

阐明蛋白质分子结构与功能关系，并且尽可能达

到定量描述的水平。

2.4严格意义上的蛋白质工程

.在深入了解某一个蛋白质结构与功能关系的基础

上，经过有目标的、严格的分子设计，定向地改

造或构建一个具有特定性质和功能的目的蛋白

质。

.一是对天然蛋白质的改造，包括小改、中改以及

大改；

.二是完全重新构建一个自然界中没有的全新的蛋

白质

蛋白质的分子设计可以按改造部位的多寡分为三

类

.第一类为“小改”

.第二类为“中改”

.第三类为“大改”

§ 3-3蛋白质工程的研究方法|

.结构分析方法

.蛋白质的分离纯化鉴定方法

.功能研究方法

.进行结构改造的分子生物学研究方法

3.1蛋白质结构分析方法

.与研究蛋白质的空间结构有关的理论与技

术

.1、蛋白质一级结构分析方法

.2、蛋白质构象研究方法

.3、蛋白质折叠过程研究方法

.4、蛋白质生物物理研究方法及计算机结构

模拟研究

蛋白质一级结构研究，既氨基酸序列的测定，其

原理是片段重叠、逐级降解、cDNA以质谱法等

几种，其中片段重叠和逐级降解是最常用的方

法。

蛋白质构象研究方法

在蛋白质高级结构研究方面，一种是单晶体衍射

法另一种是核磁共振（NMR）法。

?单晶体衍射法是研究蛋白质空间结构最主要的

分析手段，分别用于对结晶蛋白质，单晶体衍射

主要对结晶蛋白质的各向基团的空间排布进行分

析，对蛋白质分子的整体空间构架研究作用很

大。

?核磁共振（NMR）法是对溶液中蛋白质空间构

象的研究。核磁共振可以直接对水溶液中的蛋白

质结构进行分析，溶液中的空间构象更接近于生

物体中的自然状态，更能反映蛋白质在执行功能

时的实际构象状态。

蛋白质折叠过程研究方法

.目前流行的蛋白质折叠过程理论是Amfinsen提

出的随机成核理论：即线性多肽链折叠呈现“成

核-折卷-凝集”三个阶段。

.成核作用是由于挤压效应或疏水作用，多肽

链中的一些小肽段迅速形成螺旋性的核心区；

.折卷则是已成核的结构散落成为较大的超二级结

构单元的集合体；

.凝集则是集合体在原子水平凝集，形成致密的三

级结构。

3.2分子生物学研究方法

.1、寡居核苷酸片段及基因的人工合成

.2、目的基因的克隆与分析

.3、目的基因的定位诱变

.4、目的基因高效表达系统

蛋白质工程主要研究手段是利用所谓的反向生物

学技术，其基本思路是按期望的结构寻找最适合

的氨基酸序列，通过计算机设计，进而模拟特定

的氨基酸序列在细胞内或体内环境中进行多肽折

叠而成三维结构的全过程，并预测蛋白质空间结

构和表达出生物学 功能的可能及其高低程度。 § 3-4 蛋白质工程的应用

通过基因定点突变或基因克隆的方法，人们 就可以对自然界存在的酶或蛋白质进行改 造，使它们变成适合于工业化生产的新酶。

一般来说提高蛋白的稳定性包括以下几个方 面：①延长酶的半衰期；②提高酶的热稳定 性；③延长药用蛋白质的保存期；④抵御由 于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。 1、消除酶的被抑制特性

芽抱杆菌是工业上发酵生产蛋白质水解酶的 主要生产酶，枯草芽抱杆菌的不同菌株产生 的胞外碱性蛋白酶统称为枯草杆菌蛋白酶。 1985 年,美国的埃斯特尔借助 PCR 技术，用 19种其他氨基酸分别替换枯草芽抱杆菌蛋 白酶分子第222位残基上容易受氧化的蛋氨 酸，获得了一系列活性差异很大的突变酶。

2、 弓|入二硫键，改善蛋白质的热稳定性 溶菌酶是一种广泛用于食品工业的酶制品， 其催化速率随温度升高而升高，因此，这种 工业用酶的热稳定性是提高其应用潜力的重 要标准。 蛋白质晶体结构研究表明，T4溶菌酶分子由 一条肽链构成，并在空间上折叠形成两个相 对独立的单元，酶活性中心位于两个单元之 间，该酶分子的一个重要特性是在第 97位和 第54位残基上是两个未形成二硫键的半胱 氨酸，所以野生性的溶菌酶是不含二硫键的 蛋白质分子。

3、 转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性 研究人员对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行 诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个 亚基含有两个天门冬酰胺，它们都位于亚基 之间的界面上，对酶的热稳定性起决定性作 用。通过PCR 定向诱变技术，研究人员将第 14位和第78位上的两个天门冬酰胺分别转 变成苏氨酸和异亮氨酸残基，大幅度提高突 变酶的热稳定性。

通过对蛋白质中非必需的天门冬酰胺进行突 变，有利于提高蛋白质的热稳定性。 4、 改变酶的最适pH 值条件

改变工业用酶的最适 pH 值是蛋白质工程研 究和实践中的另一个重要目标。改变食品级 酶的最适pH 值条件，使酶适应食品加工环 境，在工艺控制上非常重要。

葡萄糖异构酶（GI ）能将D —葡萄糖、D —木 糖和D-核糖等催化为相应的酮糖；在体外 一定条件下，它也能催化 D -葡萄糖转化为 果糖，因而成为工业上制备高果糖浆的关键 酶；它还用于含木聚糖类物质发酵生产乙醇， 是一种具有重大经济价值得工业用酶。 5、 提高酶的催化特性

研究人员对嗜热脂肪芽抱杆菌的（苏氨酸） Tyr-tRNA 合成酶进行定位突变后，改变了其 与底物结合的特异性，从而提高了催化效率。 酪氨酰tPNA 合成酶的氨酰化活性

利用蛋白质工程技术可以改变新支链淀粉酶 的催化特异性。借助定点突变技术，研究人 员确定了嗜热脂肪芽抱杆菌产生的新支链淀 粉酶的活性中心。

当活性中心内的谷氨酸和天门冬氨酸残基分 别被具有相反电荷或中性的氨基酸残基（组 氨酸、谷氨酰胺或天门冬酰胺）取代时，将 导致突变体酶裂解a — 1 ,4糖苷键与a — 1, 6糖苷键的活性比例发生明显改变。 7、 修饰Nisin 的生物防腐效应 （Nis in ）乳酸链球菌素，是一种乳酸链球菌在 代谢过程中合成和分泌的有较强抑菌作用的 小分子肽，是目前研究最多，应用最广，由 乳酸菌产

生的唯一能应用于商业化生产的细 菌素。 思考题

.蛋白质工程的定义、原理。 .蛋白质工程的组成部分。 .蛋白质工程的主要研究方法。 .定点突变技术。 第四章酶工程］

质。 2、 本身就是一段RNA,不需要额外的蛋白酶 就可以对自身进行剪切。 .高效率

比非催化高108— 1020倍 比非酶催化高107— 1013倍 .高度专一性 .反应条件温和 .酶催化是可调控的 .酶工程

.（e nzyme en gi neeri ng ）即利用酶的催化作用，

在一定的生物反应器中，将相应的原料转化 成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化 工技术的交叉技术，它的应用

主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等 领域。 酶工程：

酶是基因工程、细胞工程、发酵工程和生化 工程的研究对象和工具。

酶工程的研究可以促进基因工程、细胞工程、 发酵工程和生化工程的发展。 酶工程分为 化学酶工程

自然酶 化学修饰酶 固定化酶 人工合成酶 生物酶工程

克隆酶 突变酶 新酶

1.1酶的催化特性 .（一）反应条件温和 .（二）催化效率高 .（三）反应专一性强 .（四）反应可调节控制 一、产酶菌种的选育和保藏 .（一）常用产酶微生物 .（二）菌种的分离筛选

.1.优良菌种的特点

.一个优良菌种应具备以下几个条件： ①繁殖 快，产酶量高，生产周期短；②适应性强， 容易培养和控制，便于管理和降低生产成本； ③产酶性能稳定，不易退化，不易受噬菌体 侵袭；④产生的酶容易分离纯化；⑤菌种本 身和代谢产物安全无毒，对生产人员、生产 环境，酶的应用不会产生不良影响。 .2 .菌种的分离 .（1）含菌样品的收集 .（2 ）富集培养 .（3）菌种的纯化 .3.菌种的筛选

.（三）产酶微生物育种 .1 .诱变育种

.2 .原生质体融合育种 .3 .基因工程育种 .（四）菌种的保藏 .1 .斜面冰箱保藏法 .2 .沙土管保藏法 .3 .石蜡油封保藏法 .4 .真空干燥冷冻保藏 ..液氮超低温保藏法 1.2酶工程的应用范围

（1） 对生物宝库中存在天然酶的开发和生 产；

（2） 自然酶的分离纯化及鉴定技术；

（3） 酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4） 酶反应器的研制和应用；

（5） 与其他生物技术领域的交叉和渗透。 其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上 有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利 用价值才真正得以体现。

1.3酶和酶工程的研究意义

生命活动过程中的新陈代谢所涉及的各化学 反应由各种酶的催化来实现。 （1）生命活动规律； （2） 生物工程的工具；

（3） 医药工业（疾病发生、诊断和治疗等）； （4） 工农业、环保等领域的应用； （5） 分析工具。 § 4-2酶的生物发酵生产 21酶的生产万法 .提取法

.采用各种提取、分离技术从动物、植物或微 生物细胞或组织中将酶提取分离出来。是最 早采用的酶生产技术。目前在动、植物资源 丰富的地区，仍有使用价值。

.简单方便，但受气候、地理环境的影响，产 品含杂质较多，分离纯化较困难。

.例如，从动物胰脏中提取胰酶；从动物胃中 提取胃蛋白酶等。 .酶的生产方法 .发酵法

.利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而 获得所需的酶。

.根据微生物培养方式的不同，分为固体培养 法、液体深层法、固定化细胞和固定化原生 质体法等。

.化学合成法

.现在已可用肽合成仪来进行酶的化学合成。

.合成成本高昂，且只能合成已知化学结构的 酶。 22发酵生产用产酶菌株的要求 .酶的产量高 .容易培养和管理 .产酶稳定性好 .利于酶的分离纯化 .安全可靠

23菌种获得途径： .菌种保存机构 .筛选 .菌种米集

.菌种的分离、纯化 .菌种生产性能的检定

.初筛：从已分离的菌种中挑出可产生目 的酶的菌株。

.复筛：在初筛基础上筛选产酶量高、性能 更符合要求的菌株。 一、 菌种的活化和扩大培养 （一） 菌种活化

（二） 菌种的扩大培养 二、 发酵培养基的制备

1. 碳源，碳源是指能向细胞提供碳素的含碳 化合物。一般采用淀粉及其水解产物，如糊 精、麦芽糖等

2. 氮源，能够向细胞提供氮素的化合物称为 氮源。氮源分为有机氮和无机氮。有机氮主 要是各种蛋白质材料及蛋白质的水解产物。 无机氮包括各种铵盐和硝酸盐等。

3. 无机盐类无机盐提供细胞生命活动必需的 无机元素，对培养基的pH 、缓冲能力和渗透 压起调节作用。

4. 生长因子生长因子是指细胞生长繁殖所必 需的微量有机物质，包括维生素、氨基酸、 嘧啶、嘌吟等，它们是构成辅酶的必需物质。 .三、酶合成的促进剂和阻遏物 .（一）酶合成的促进剂

.在培养基中少量添加就明显著增加酶产量 的物质，统称为产酶促进剂.它们大多属于 酶合成的诱导物、酶的稳定剂或表面活性剂。 诱导物多为底物或底物类似物，如淀粉、蔗 糖、纤维素分别是淀粉酶、蔗糖酶、纤维素 酶的诱导物。 .（二 ）酶合成的阻遏物

.微生物酶的生产受代谢途径末端产物和分解代谢产物的阻遏。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶的合成受其催化产物无机磷酸的抑制 2.4酶的发酵生产方法

.①产酶效率高，细胞被固定化后，只能在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，故可加快生化反应速度，提高产酶率。.②可进行连续发酵，固定化细胞固定在载体上，不易脱落，可反复使用多次。.④缩短发酵周期，提高设备利用率，在利用固定化细胞发酵时，第二批次及以后批次的发酵周期缩短。⑤酶容易分离纯化，固定化细胞颗粒很容易与发酵液分离，发酵液中游离细胞很少，因此有利于酶的分离纯化

2.5酶的发酵条件控制

.（一）温度

.不同的微生物生长有不同的最适温度，例如

黑曲霉的最适

温度为28?32 C,枯草杆菌最适温度是34 —37 Co

（二）pH 值

.不同的微生物所需要的最适pH不同。例如，黑曲霉既可产生，淀粉酶，又可产生化酶，当培养基的pH偏中性时，有利于淀粉酶的生产；而当pH偏酸性时.糖化酶产量提高，淀粉酶产量降低。

.（三）溶解氧

.在发酵过程中应连续不断地供给无菌空气，同时进行搅拌以增加培养基中溶解氧的含量。

§ 4-3酶的分离纯化

.3.1酶分离纯化的一般程序

.①首先获得出发酶液。如果微生物发酵生产的是胞外酶，液体发酵的培养液或固体培养物的抽提液就是出发酶液；如果发酵生产的是胞内酶，先分离收集菌体，将其破碎，再利用提取液将酶抽提至液相，即获得出发酶液。.②除去出发酶液中的悬浮固形物.获得澄清的酶液。.③利用各种技术将酶沉淀分离。.④将获得的沉淀干燥，研磨成粉，加入适当的稳定剂、填充剂等，做成粉末制剂。.⑤当对酶产品的纯度要求很高时，还需要精制。一般工艺流程：

保藏菌种一.活化一.扩培一.发酵（固体发酵液体发酵

）—分离纯化.-成品（酶）

3.2酶分离提取的条件控制

.1 .温度操作过程尽可能在低温（0—4C ）

下进行，溶液中存在无机盐或有机溶剂时，更应如此，以防止蛋白质水解酶对目的酶的分解破坏。

.2 . pH在提纯过程中通常采用一定pH的缓冲液，防止溶液过酸或过碱影响酶的稳定性和溶解度。

.3 .盐浓度大多数蛋白质具有在适当的盐浓度下溶解度增大的性质，但当盐浓度过高时，酶蛋白易变性失活。

.4 .杂菌污染含酶溶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中要防止杂菌污染。

3.3酶的工业分离纯化技术

.（一）细胞破碎技术

.1.机械破碎

.2 .物理破碎

.3 .化学破碎法

.4 .酶法酶法

细胞破碎

许多酶存在于细胞内。

为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破

碎处理。

细胞破碎方法及其原理

机械破碎-通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。-捣碎法/研磨法/匀浆法物理破碎-通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。

-温度差破碎法/压力差破碎法/超声波破碎法

化学破碎-通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎-有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿；表面活性剂：Triton、Tween 酶促破碎-通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使

细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎-自溶

法/外加酶制剂法微生物细胞的破碎

一、机械破碎法

1、高压匀浆法

2、珠磨法

3、超声破碎法

二、非机械破碎法

1、酶溶法

2、化学渗透法

.（二）发酵液的絮凝与凝聚技术

.1、凝聚

.凝聚是指在电解质作用下，溶液的胶粒之间双电

层排斥作用降低，而使胶体体系不稳定，胶粒间

相互凝聚的现象。常用的凝聚电解质有硫酸铝、

氯化铝、三氯化铁、硫酸亚铁、石灰、硫酸锌、

碳酸镁等。

.2 .絮凝

.絮凝是指在某些高分子絮凝剂的作用下，溶

掖中的较小胶粒聚合形成较大絮疑团的过程。采

用絮凝法产生的絮凝团较粗大，容易过滤分离。

.絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物. 分

子量可高达数万至一千万以上，它们具有长的链

状结构，其链节上含有许多活性基团，包括带

正、负电荷的离子，如羧基（—COOH）氨基

（—NH2）等

.絮凝剂可分为三类：.①有机高分子聚合物，如

聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；②无

机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐

等；.③天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶黏

物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳

多糖等。

.（三）发酵液的过滤技术

.1 .过滤技术的分类根据过滤介质截留的物质颗

粒大小不同，过滤可分为粗滤、微滤、超滤和反

渗透4大类。

.2 .根据过滤对产生推动力的条件不同，粗滤可

分为常压过滤、离心过滤、加压过滤、减压过滤

等4种。

.常用的过滤设备

.（1）板框过滤机，适合于固体含量1%—10%

的悬浮液的分离。

.（2）真空转鼓过滤机，适合于固体颗粒大、固

体含量高（＞10%）的悬浮液的分离酶的提取、

分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶

浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心

分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分

离，萃取分离，结晶分离等。酶提取和分离纯化

的步骤

.酶产品的提取和分离纯化的一般步骤：胞内

酶：细胞分离收集菌体-破碎-匀浆胞外酶：发酵

液或固体培养物的酶浸提物—离心或过滤-沉淀

分离-干燥-精制

四）酶的提取技术

.1.稀盐溶液抽提，是利用某些蛋白质溶解于稀盐

溶液的特性来提取酶的。大多数酶溶于水，而且

在一定浓度盐存在的条件下，溶解度增加，这称

为盐溶现象。

.2 .稀酸溶液抽提，某些酶在酸性条件下溶解度

较大，且稳定性较好，适宜用稀酸溶液提取。

.3 .稀碱溶液抽提，某些酶在碱性条件下溶解度

较大，而且稳定性好，适用于稀碱溶液提取。

.4 .有机溶剂抽提，某些酶与脂质结合比较牢固

或分子中含非极性基团较多，不溶或难溶于极性

溶剂，需用乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂提取。

.5 .双水相体系萃取它是利用两种不同水溶性聚

合物的水溶液混合时，体系形成的互不兼容的两

相，即双水相体系来提取酶。

（五）酶的离心分离技术

.离心分离是酶提取纯化过程中最常用的方法，是

借助离心机旋转所产生的离心力，使酶与其他物

质分离的技术。主要用于除去发酵液中的菌体残

渣、培养基残渣以及抽提过程中生成的沉淀物。

.（六）酶的沉淀分离技术

.1 .盐析沉淀法

.盐析沉淀法又称为盐析法，该法利用蛋白质在一

定浓度的盐溶液中沉淀的特性分离蛋白质。在盐

浓度较高时，由于盐离子的水合作用，使水分子

的活度降低，导致蛋白质的溶解度下降，蛋白质

沉淀，这就是盐析现象。2．有机溶剂法

.在等电点附近，蛋白质分子主要以两性电解质

的形式存在。如果这时添加有机溶剂，由于有机

溶剂的存在使溶液的介电常数降低，两性电解质

分子之间的静电引力增大，从而使分子凝聚沉

淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用也会破

坏蛋白质表面的水合层，导致蛋白质分子脱水而

沉淀。

.3．有机聚合物沉淀法.除了盐和有机溶剂能使蛋

白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白

质。常用于蛋白质沉淀的有机聚合物有

PEG6000 PEG20000聚丙烯酸、单宁

等。.4．选择性变性沉淀法

.有一些蛋白质的稳定相当好，可忍受极端环境

条件，因此，可利用极端条件使非目的酶变性，

并从溶液中沉淀出来，从而使目的酶得到分离。

可供利用的变性条件有热变性、pH 变性和有机

溶剂变性。

.（七）酶的浓缩技术.由于发酵液或酶的抽提液

中酶的浓度一般都比较低，一般用减压、超滤等

方法进行适当浓度的浓缩。

.（八）酶的干燥技术.酶的工业化制剂有液态和

固体粉剂两种。固体酶制剂稳定性高，便于贮

存、运输和应用。干燥是将固体、半固体或浓缩

液中的水分除去一部分，以获得含水量较少的固

体的过程。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干

燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥等。

3.4 酶的精制技术.（一）透析与超滤技

术.1．透析

.2 ．超滤.（二）层析分离技术.1．吸附层析技

术.2．离子交换层析技术.3．凝胶层析技

术.4．亲和层析.（三）电泳分离技术.1．凝胶

电泳技术.2．等电聚焦电泳技术

1 、根据酶分子溶解度不同的方法

2 、2 、根据酶分子大小和形状不同的方法

3 、根据酶分子电荷性质的方法

4 、根据酶分子专一性结合的分离方法

5 、根据分配系数的分离方法

6 、其他分离方法酶的提取和精制溶解度不同

盐析沉淀法等电点沉淀法有机溶剂沉淀法复合

沉淀法根据某一浓度的盐溶液中不同浓度的蛋

白质和酶的溶解度不同根据两性电解质在等电点

时溶解度最低利用酶在有机质中的溶解度的不同

利用酶能与某些物质形成沉淀酶分子大小和形状

离心分离法凝胶过滤法透析超滤反渗透电渗

析

琼脂和琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、葡萄糖凝胶

zl1 膜分离技术膜分离技术

离子交换柱层析层析聚焦电泳分离等电聚焦电泳

酶分子电荷性质hands1

酶分子专一性结合

1 、亲和层析

2 、免疫吸附层析

3 、染料配体亲和层析

4 、共价层析

3.5 酶制剂的保藏条件.（一）合适的温度.

（二）适当的p H值.（三）抗氧化保护.

（四）提高酶的浓度和纯度

§ 4-4 酶分子的改造与修饰

1 、稳定性差

2、对反应的温度、要求严格

3、Km 值过大

4 、具有抗原性天然酶在应用中的限制因素

11782907685610550 定义：通过化学基团的引入

或除去，而使蛋白质共价结构发生改变，从而

改变酶的某些特性和功能的过程。

即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学

基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，

进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。酶的

活性中心1

4.1 酶分子修饰的意义. 提高酶的活力activity .

增强酶的稳定性stability . 降低或消除酶的抗原性

immunological property .研究和了解酶分子中主

链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素

对酶分子空间构象的影响structure

酶分子修饰的基本要求和条件

.1 对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。

.（1）酶的稳定性

.热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、pH、抑

制剂等。

.（2）酶活性中心的状况.活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。

酶分子修饰的条件

.2 在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。

.（1）pH 与离子强度

.pH 决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。.（2）修饰反应的温度与时间. 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。

.（3）反应体系中酶与修饰剂的比例1、金属离子置换修饰2、大分子结合修饰

3、侧链水解修饰

4、侧链基团修饰

5、酶基因与改造

6、酶分子的物理修饰4.2主要修饰技术glhchem$12105628

1、金属离子置换修饰

.定义：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。.定义：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。.常用于酶分子修饰的是二价金属离子，如：Ca2+，

Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+, Cu2+，Fe2+等。

.若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。

1、金属离子置换修饰

.a. 酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。

.b. 除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA等，使

酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA- 金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。

.c. 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。

1、金属离子置换修饰

金属离子置换修饰只适用于那些在分子结

构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子

置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。

1、金属离子置换修饰

例如：锌型蛋白酶Zn2+ - Ca2+活力提高20%—30%

a —淀粉酶Mg2+,Zn2+ —Ca2+可提咼活力

增加稳定性

2、大分子结合修饰

.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。.常用修饰剂：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖

聚

合物、聚氨基酸等。使用前一般需经过活化，

然后

在一定条件下与酶分子共价结合。.修饰条件的控

制：修饰剂的种类与浓度、温度、pH 和反应时

间等。

.此法是目前应用最广泛的酶分子修饰方法如尿激

酶与大分子结合增加稳定性,木瓜蛋

白酶与右旋糖酐结合.聚乙二醇对色氨酸酶进行

修饰消除抗原性

定义：有些酶的肽链经有限水解，使酶的空间结

构发生

某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方

法。

.利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化

学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶

的特性和功能的方法。

. 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/ 酶原激活法。

. 方法：

.常用修饰剂：专一性较强的蛋白酶或肽酶。

.其他：如EDTA+屯水或稀盐酸透析处理枯草杆

菌中性蛋白酶，可使其部分水解。

3、酶侧链水解修饰（肽链有限水解修饰）

4、酶分子的侧链基团修饰

.采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧

链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能

的修饰方法。

.酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残

基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍

基、酚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶

蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基

团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而

改变酶的特性和功能。

.（1）羧基修饰剂羧基修饰剂可使羧基酯化、酰

基化或结合上其他基团。最早用来修饰蛋白质侧

链羧基的修饰剂是乙醇—盐酸试剂，它可使羧基

产生酯化作用。常见基团的化学修饰反应：羧基

m-12 .（2）氨基修饰剂主要有二硝基氟苯、醋酸

酐、琥珀酸酐、二硫化碳、亚硝酸、乙亚胺甲

酯、o—甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。它们可与

氨基共价结合将氨基屏蔽起来，或导致脱氨基作

用，从而改变酶蛋白的构象或性质。例如用o—

甲基异脲与溶菌酶赖氨酸残基的￡—氨基结合，

酶活力保持不变，但稳定性提高，而且很容易结

晶析出；用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末

端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸的氨基转变为羟

基，使酶的稳定性提高，在体内的半衰期可延

长2倍常见基团的化学修饰反应：氨基m-11

（3）巯基修饰剂巯基在维持亚基间的相互作用

和在酶的催化过程中起重要的作用，然而巯基却

容易发生变化，从而改变酶的性质和催化特性。

常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、

硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化

剂、烷基化剂等。

（4）常见基团的化学修饰反应：巯基m-2 常见

基团的化学修饰反应：咪唑基m-6 .（4）酚基修

饰剂常用碘化法、硝化法和琥珀酰化法等修饰酶

蛋白中的酚基。酚基经修饰剂修饰后，引入负电

荷，因而增大酶对带正电荷的底物的结合力常

见基团的化学修饰反应：酚羟基m-7 .（5）胍基

修饰剂精氨酸含有胍基。胍基可与二羰基化合物

缩合生成稳定的杂环。所以二羰基化合物，如环

己二酮、乙二醛、苯乙二醛等，都可以用做胍基

修饰剂。常见基团的化学修饰反应：胍基m-8

常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基m-9 .

（6）分子内交联剂用含有双功能团的化合物，

如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶分子内

两个侧链基团反应，在分子内共价交联，可使酶

分子空间构象更加稳定。

5、酶基因与改造

20 世纪80 年代在基因工程基础上发展而来的

酶的蛋白质工程，又称为第二代基因工程，是指

通过改造与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次

序，或设计合成新的基因，将它克隆到寄主细胞

中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质

的技术。新蛋白质的设计——突变基因的核苷酸

序列的确定——突变基因的获得——新蛋白质的

产生

.生物酶工程主要包括三方面内容：.①用基因工

程技术大量生产酶；.②修饰酶基因，产生遗传修

饰；.③设计出新酶基因，合成自然界中从未有

过的酶。

基因工程的方法包括: .利用克隆,良好的宿主-

载体系统和不同的表达系统

.基因的定点诱变

.随机诱变.蛋白质分子剪裁

. 对蛋白质功能元件进行分解或重组来获得具有

单一

或复合功能的新蛋白质

HWoCRTEMP_RoC00

HWoCRTEMP_RoC10 酶基因克隆及表达的大致

步骤.克隆是酶基因工程的关键一步，是把编码

目的酶的基因插入适当的载体，后带入载体相

容的宿主，并随宿主复制。

.酶基因插入载体后，在宿主中有两种表达方

式，一种是利用自身携带的起始密码子，启动合

成与天然酶完全相同的酶

.另一种是利用载体所具有的密码子，合成相应

的融合蛋白，融合蛋白经化学或酶法水解后形成

天然酶。要构建一个具有良好产酶性能的菌株，

必须具备良好的宿主—载体系统理想的宿主应具

备以下几个特性：.①所希望的酶占细胞总蛋白

量的比例要高，能以活性形式分泌；

.②菌体容易大规模培养，生长无特殊要求，且能

利用廉价的原料；

.③载体与宿主相容，克隆酶基因的载体能在宿

主中稳定维持；

.④宿主中的蛋白酶尽可能少，产生的外源酶不

会被迅速降解；.⑤宿主菌对人安全，不分泌毒

素。

例如；青霉素酰化酶,葡萄糖异构酶,凝乳蛋白

酶,丝氨酸蛋白酶

6、酶分子的物理修饰

特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子

中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用

下，副键发生某些变化和重排。

.通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别

是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH

值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特

性和功能的变化情况。

酶修饰后的性质变化

.热稳定性：一般来说，热稳定性有较大的提

高。

.抗原性：比较公认的是PEG和人血清白蛋白在

消除酶的抗原性上效果比较明显。

.各类失活因子的抵抗力：修饰酶对蛋白酶、

抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定

性。

.半衰期：一般在体内的半衰期得到有效延

长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白

酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半

衰期。

.最适pH：大部分酶经化学修饰后，酶的最

适pH 发生了变化，这种变化在应用研究上有时

具有重要意义。修饰酶最适pH 更接近于生理环

境，在临床应用上有较大意义。

.Km 的变化：大多数酶经修饰后，Vm 没有明

显变化，但有些酶经修饰后，Km 值变大。

修饰酶的性质特征：

1、酶的热稳定性增强；

2、消除抗原性作用；

3、许多修饰酶在体内的半衰期延长；

4、修饰酶的最适pH 值均向有利于生理和临床

应用范围变化；

5、对最大反应速度和米氏常数的影响；

6、修饰酶对组织的分布能力有所提高。

§4-5酶的固定化

.游离酶在应用中的不足