水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展_王航
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水蛭素的分子改造与结构修饰研究进展
王 航,许 静,谭树华*(中国药科大学分子生物学教研室,江苏南京210009)
摘要:目的 为更好地开发利用重组水蛭素,综述国内外水蛭素结构修饰研究状况。方法 依据近年来国内外文献,进行分析、归纳和总结。结果与结论 笔者通过对水蛭素进行各种分子改造或者结构修饰来产生新的类似物蛋白,从而解决水蛭素在临床应用中出现的种种问题,有的也可能会出现新的功能。关键词:水蛭素;不良反应;结构修饰doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2011.05.032中图分类号:R914 文献标志码:A 文章编号:1004-2407(2011)05-0385-03
Advancesinthestudyofstructuralmodificationsofhirudin
WANGHang,XUJing,TANShuhua*(MolecularBiologyDepartment,SchoolofLifeScience&Technology,ChinaPharmaceut-icalUniversity,JiangsuNanjing210009,China)
Abstract:ObjectiveTostudythestructuralmodificationsofhirudin.MethodsBasedonliteratures,theresearchprogressinhirudinstructuralanalogueswasanalyzedandsummarized.ResultandConclusionHirudinhasbeenmodifiedwithmoleculartransforma-tionandstructuralmodifications.Theobtainedproteinscanalleviateadversereactioninclinical,orbringnewfunctions,suchasthrombolysis,inhibitingtheplateletaggregation,andtargetingspecifically.Keywords:hirudin;adversereactions;structuralmodifications
基金项目:国家自然科学基金项目(编号:30873191)作者简介:王航,女,在读硕士研究生*通信作者:谭树华,男,教授 自1986年起,基因工程技术的发展使人们获得了建立在
多种载体上的重组水蛭素。它在临床治疗和预防各种血栓形
成中有着显著的作用,国内外医药界学者将水蛭素作为治疗
心血管疾病的有效药物进行研究[1]。但是,临床应用水蛭素
还存在一定出血的危险;而且,作为抗凝血酶药物,重组水蛭素预防动脉血栓的效果并不理想。本文将就近年来重组水蛭
素临床出现的一些问题,以及近年来国内外重组水蛭素结构
修饰类似物研究的最新进展进行综述。
1 水蛭素及其结构类似物的不良反应
水蛭素是一种小分子多肽,进入体内后,被体内的蛋白酶
切割而失活;而且,水蛭素不经肝脏代谢,以原形或其衍生物的形式经肾脏排泄,肾功能不全的病人因其排泄功能严重受
损,存在很大的风险。
作为一种兼有抗血小板和抗凝的药物,其主要问题是出
血并发症,可引起一定程度的脏器出血,导致轻度的贫血;高
剂量给药除以上类似变化外,转氨酶升高,主要是因为重组水蛭素抑制凝血酶药理活性放大。目前水蛭素引起的出血反应
尚无有效药物治疗。停止给药可缓解症状,但是有的情况这
种措施并不十分奏效[2]。
生物技术药物均有一定程度的免疫原性,水蛭素的免疫
原性比较弱。文献报道[3],临床上连续给药重组水蛭素5d
以上可使74%的患者产生抗水蛭素抗体(AHAb)。重组水蛭素可能会产生严重的变态反应。2003年,Greinacher等发现
进行重复给药的毒性实验和临床研究中有9例严重变态反
应。其中4例在首次给药时,并无不良反应。
2 水蛭素结构修饰物及类似物
目前的新药研究领域,开发一个全新的药物十分困难,研究热点大都集中在对现有药物的分子改造或是结构修饰上,
同时设法降低毒副作用。针对在临床应用中所出现的问题,
将重组水蛭素类多肽药物进行各种类型的结构修饰,以期降
低不良反应。
2.1 水蛭素融合蛋白 研究表明,许多抗凝溶栓药物具有协
同和互补作用,利用蛋白融合技术连接,产生的融合蛋白较单
一使用有更好的活性,有的甚至产生新的活性[4]。
2.1.1 葡激酶-重组水蛭素融合蛋白 溶栓和抗凝药物的联
合治疗,是当前临床治疗血栓相关性疾病的重要给药方案。
葡激酶与纤溶酶原结合后能激活纤溶酶原,使之成为有活性
的纤溶酶,产生的级联反应能激活更多的纤溶酶原,发挥溶栓
作用。重组融合蛋白是葡激酶和水蛭素通过1个Xa因子连
接起来的蛋白多肽。Lian等[5]通过1个螺旋结构序列将葡激
酶和水蛭素构建成1个Y形异源二聚体,使两者都具有游离
的N末端而不影响各自的功能。融合蛋白不仅保持了原有
的抗凝和溶栓活性,还对富含纤维蛋白的血栓具有一定的靶
向性,因而有着广阔的应用前景。
2.1.2 纤维蛋白抗体-重组水蛭素融合蛋白 纤维蛋白抗体
与水蛭素通过化学偶联,能够有效抑制纤维蛋白的沉积。牛晋阳等[6]利用特异存在于凝血部位的活性凝血因子FXa的
活性和水蛭素N末端延伸会使水蛭素丧失抗凝血活性的特
性,将水蛭素的N末端与含凝血因子FXa识别位点的短肽相
融合,使得融合蛋白在非血栓部位不表现出抗凝血活性。在
血栓部位,由于人体血液中无活性的凝血因子FX在凝血部
位被活化成活性形式的凝血因子FXa,后者再将水蛭素从融
合蛋白上切割下来,使其发挥抗凝血作用,从而在不减少水蛭
素抗凝血活性的同时,最大程度地降低了出血。这在临床上
具有非常重要的意义。
2.2 RGD-重组双功能水蛭素 RGD肽是一类含有精氨酸-
甘氨酸-天冬氨酸序列的短肽,是整合素与其配体蛋白相互作385西北药学杂志 2011年10月 第26卷 第5期http://xbyz.chinajournal.net.cn用的识别位点。自研究者[7]于1984年首次报道纤维蛋白原
中所含的RGD序列为细胞识别位点以来,RGD肽及其衍生
物就成为众多学者关注与研究的热点。RGD与GPÒb/Óa作用时高度保守,是识别配体所必需的。天然水蛭素不含有
RGD序列,只对凝血酶诱导的血小板聚集有抑制作用。许多
研究表明,含RGD序列的外源性多肽能抑制纤维蛋白原与血
小板膜GPIlb/Óa结合,抑制血小板激活和聚集,从而显示抗
凝、防栓作用。基于此,研究者将RGD序列用于制备靶向溶
栓药物[8]。近年来,以RGD序列为基础的GPÒb/Óa受体
拮抗剂,被广泛应用于治疗临床急性冠状动脉综合征[9]。将RGD序列融合于水蛭素分子中,使这种水蛭素的衍生物既有
抗凝血酶作用,又有抗血小板激活和聚集双重功能,并使这2
种功能非常匹配。两者在产生治疗效果的同时,双功能水蛭
素的治疗剂量可降低至天然水蛭素半衰期的1/2~1/3,随着
剂量的加大,治疗效果越好,并有明显的量效关系[10]。
2.3 多功能融合水蛭素 2005年,Szemraj等成功地在重组
葡激酶的C末端加入组织型纤溶酶原激活剂的环饼状结构、RGD序列和水蛭素,得到融合蛋白复合物,实验结果该蛋白
不但保留了各自原有的抗凝活性,而且有更好的抗纤维蛋白
粘连活性。此后,Szemraj等[11]还证明了此蛋白有着更强的
溶栓活性。另外,Kowalski等[12]用同样的方法得到此融合蛋
白。体外实验表明:与重组葡激酶相比,其有着更好的溶栓、
抗凝和抗血小板聚集功能。
2.4 聚乙二醇修饰水蛭素 聚乙二醇(PEG)修饰是20世纪
70年代后期发展起来的一项热门技术,已用于多种蛋白质药物或者非蛋白质药物的修饰。聚乙二醇修饰技术能够延长药
物的半衰期,增强稳定性,降低免疫原性和抗原性;改变药物
的分子结构从而改进药物动力学和药效学的性质,提高了作
用部位的血药浓度。秦海娜等[13]在微酸性条件下定点修饰
水蛭素的组氨酸残基,在得到单修饰产物的同时避免水蛭素
活性中心赖氨酸残基的修饰,从而使修饰后产物的活性保留
率更高。目前关于聚乙二醇化水蛭素的研究已经进展到了临床Ò期,国外相关研究也主要集中在聚乙二醇化水蛭素的药
代动力学方面[14-15]。
3 水蛭素其他方面新的研究进展
利用现代生物工程技术和生物药剂学技术还可对蛋白多
肽类药物进行化学修饰或制成前体药物改善其吸收,提高疗
效。现用于临床的水蛭素注射剂还存在一系列问题:半衰期
较短,对纯度要求较高,易经肾排泄,经常注射给患者带来不便。人们正在研究一些非注射给药途径,包括肺部、气管、鼻
腔、口腔黏膜、直肠以及口服给药。Cen等[16]报道了将重组水
蛭素制成肠溶胶囊,斯普拉-道来大鼠口服给药,结果表明,水
蛭素肠溶胶囊不仅避免了胃中蛋白酶和胃酸对其的降解作
用,与静脉注射相比其抗凝血时间延长,生物利用度有所提
高。崔莉等[17]研究也表明,重组水蛭素Ó在人工小肠液中比
在人工胃液中稳定,EDTA-2Na可对其在小肠中的吸收起到
促进作用,重组水蛭素Ó的乳化微粒的抗凝血效果更好。因此,在今后的剂型开发中,可将重组水蛭素的乳化微粒制成肠
溶制剂,以提高其生物利用度。
随着重组水蛭素药学研究的广泛开展,其适应证范围也
在不断拓宽。孙宇等[18]研究了重组水蛭素对实验性白内障的影响和对眼的刺激性,采用D-半乳糖诱发哺乳期大鼠白内
障模型和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型进行实验,并
用家兔进行眼刺激性实验。实验表明,重组水蛭素能减轻D-半乳糖和亚硒酸钠诱发哺乳期大鼠白内障模型的晶状体浑浊
度,升高晶状体超氧化物歧化酶(SOD)活力,降低晶状体丙二
醛(MDA)含量,对家兔眼无明显刺激性。崔莉等采用溶红细
胞实验筛选促吸收剂,用正交实验制备了水蛭素滴眼液。结
果表明,其制剂性质稳定,对硒性及半乳糖性大鼠白内障有显
著的防治作用。
4 前景展望经过20年的临床应用研究,重组水蛭素及其类似物已经
广泛地应用于血栓引发的各种病症,2种水蛭素和1种水蛭
素类似物已经被美国FDA批准生产。Angiamax是根据水蛭
素的结构合成的含有20个氨基酸残基的水蛭素类似物,用于
治疗不稳定性心绞痛、心肌梗死、以及受HIT干扰引起的皮
肤冠状动脉及HIT血栓并发症等。重组水蛭素相对分子质
量小,可渗透至血栓,对血栓结合的凝血酶发挥作用。与肝素、阿司匹林等传统抗凝药物相比,水蛭素用量少、疗效高、不
良反应少。但水蛭素的临床应用也受到了各种限制,因此,研
究如何延长水蛭素的半衰期,研制具有抗凝血酶及抗血小板
激活、聚集双重功能的水蛭素衍生物,或研制重组水蛭素模拟
肽,通过蛋白质工程技术减少水蛭素的出血副作用,以及研制
水蛭素口服制剂等长效、低毒副作用、强效多功能抗凝、防栓
药物也将成为今后的研究方向。
参考文献:[1] 杨丽娅,高菂.水蛭素与凝血酶作用的探讨[J].西北药
学杂志,2007,22(2):95-96.
[2] AndreasG,TheodoreEW.Thedirectthrombininhib-i
tor-hirudin[J].Thrombinhaemost,2008,99:819-829.
[3] 吕秋军.生物技术药物免疫原性的评价以及面临的挑战
天然水蛭素水凝胶可改善随意皮瓣的存活
中国组织工程研究 第17卷 第53期 2013–12–31出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research December 31, 2013 Vol.17, No.53
doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.53.002 []
韦淑怡，殷国前，韩志强，潘新元，林博杰. 天然水蛭素水凝胶可改善随意皮瓣的存活[J].中国组织工程研究，2013，17(53):9107-9112.
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 9107
韦淑怡★，女，1987年生，广西壮族自治区南宁市人，广西医科大学在读硕士，主要从事组织修复研究。
pp99.student@
通讯作者：殷国前，广西医科大学第一附属医院整形美容外科，广西壮族自治区南宁市 530021
yingq61@
中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:2095-4344
(2013)53-09107-06
修回日期：2013-10-09
(201308219/M〃W)
Wei Shu-yi★, Studying for
master’s degree, Department of
Plastic Surgery, the First
Affiliated Hospital of Guangxi
Medical University, Nanning
530021, Guangxi Zhuang
Autonomous Region, China
pp99.student@
Corresponding author: Yin
Guo-qian, Department of
水蛭素的提取及含量测定
水蛭素的提取及含量测定
HEIL0NGJIANGMEDICINEANDPHARMACYAug.2010,Vo1.33No.4?87?
水蛭素的提取及含量测定
田丽华,刘娟,刘利成
(1.佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯154007;z.佳木斯大学生药学研究生,黑龙江佳木斯154007)
关键词:水蛭素;仿生诱导;凝血酶滴定
中图分类号;R284文献标识码:A文章编号:1008—0104(201O)04—0087—01
水蛭素是从水蛭中提取的一种酸性多肽,在临床上多用酶的分子表面有一个富含碱性氨基酸的纤维蛋白原识别位
于治疗不稳定性心绞痛(USA),急性心肌梗死(AM),血管形点(FRS).而水蛭索的C端含有较多的酸性氨基酸,可以结
成术,血液透析,体外循环,肾移植(CRRT),弥漫性血管内凝合在FRS上,阻止凝血酶与其底物血纤维蛋白原的相互作
血(DIC)等病症.用,从而达到抗凝血的目的.
天然水蛭索的分离与纯化主要包括从活体水蛭素和干2.2.2凝血酶滴定过程
水蛭中分离提取水蛭素.传统的水蛭素的获得是对水蛭的一
次性掠夺,而本实验采用诱导方法对活体水蛭素的提取,避
免了传统方法对水蛭的一次性掠夺,保护了水蛭的野生资
源,又带动了水蛭养殖业的发展.国内曾报道了一种能利用
水蛭反复吸血并用其嗉囊消化液为原料,既不杀死水蛭又能
提取批量水蛭素的方法.
水蛭素的含量测定方法有多种,如生物底色法,凝血酶
滴定法,光散射法,酶联免疫法吸附测定法,同位素标记示踪
法等.本实验采用凝血酶滴定法,1970年Markwardt报道了
凝血酶滴定法,其原理是根据水蛭素与凝血酶结合比例为1:
1(mol/mo1)和1:5(g/g).凝血酶的国际单位NIH,水蛭素的
活性以抗凝血酶活力单位ATU表示,一个AUT等于中和
一
个NIH凝血酶的水蛭索量.
1实验仪器,材料及试剂
本实验所用水蛭购于山东省济宁市,经佳木斯大学药学
复方水蛭素提取物抗移植性肿瘤的实验研究
２００７年０５月第２４卷第０５期Ｐｒａｃ Ｊ Ｍｅｄ＆Ｐｈａｒｍ．Ｖ Ｌ 生２０Ｑ！＝Ｑ ：Ｑ
复方水蛭素提取物抗移植性肿瘤
的实验研究 ：ｌ：
于瑞发①王 杰②张 博③任青华③姜枫勤③李军凯①
（①４５６医院肿瘤科，山东济南 ２５００３１；②山东省职业病防治研究院，山东济南 ２５００７５；
③山东省医学科学院基础所，山东济南２５００６２） 一
［摘要】 目的探讨复方水蛭素提取物（ＣＥＨ）对小鼠移植性肿瘤和Ｔｈｌ／Ｔｈ２类细胞因子的作用机制，
为临床用药提供理论依据。方法０）ＣＥＨ体内抑瘤实验：取小鼠４０只，随机分组，均接种Ｓ－１８０瘤细胞。
阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予氟脲嘧啶，实验组分别给予大小剂量的ＣＥＨ，连续用药１４ｄ，
比较各组肿瘤生长情况。并计算抑瘤率；②检测Ｔｈｌ／Ｔｈ２类细胞因子：取荷瘤鼠组织标本，提取细胞总
ＲＮＡ，紫外分光光度计测出Ａ２６０及Ａ２８０值；采用逆转录（Ｒ 反应、聚合酶链反应（ＰＣＲ）、电泳鉴定，及定
量分析。将凝胶电泳图像输入美国Ｋｏｄａｋ凝胶分析系统，应用１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ进行表达强度
分析。结果ＣＥＨ对小鼠移植性肿瘤具有明显的抑制作用，抑制率分别为４９．０６％和３５．５３％，其中大剂量
组优于小剂量组。荷瘤鼠用药后，ＩＬ一２、ＩＦＮ一＾ｙ细胞因子升高，ＩＬ一１０、ＩＬ－４细胞因子降低。结论ＣＥＨ对小
鼠移植性肿瘤具有显著的影响，同时使荷瘤鼠低下的Ｔｈｌ类细胞因子增多，免疫能力提高，促使漂移失调
的Ｔｈｌ／Ｔｈ２类细胞达到平衡状态。 【关键词】复方水蛭素提取物（ＣＥＨ） Ｓ－１８０肿瘤细胞ＴｈｌｆＦｈ２类细胞因子
【中图分类号】Ｒ３９２．１１：Ｒ７３．３６：Ｒ２８２．７４ 【文献标识码］Ａ
Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＥＨ ｏｎ ｍｏｕｓｅ＂ｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ａｎｄ ＣＫ—Ｔｈ１厂】ｒｌｌ２ ＹＵ Ｒｕｉ—ｆａ ，ＷＡＮＧ Ｊｉｅ，
水蛭素科普与健康
水蛭素科普与健康
中文名称：水蛭素
英文名称：
hirudin
定义：
水蛭体内的一种蛋白质，含65个氨基酸残基和3对二硫键，具有高度特异的抗凝血酶活性，抑制凝血酶结合底物，故有抗凝血作用。所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）
；氨基酸、多肽与蛋白质（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布
百科名片
水蛭素
(hirudin)
是水蛭（Leech）及其唾液腺中已提取出多种活性成分中活性最显著并且研究得最多的一种成分，它是由65—66个氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。
1.
作用
动物试验与临床研究表明，水蛭素能高效抗凝血、抗血栓形成，以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反
应等进一步血瘀现象。此外，它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。与肝素相比，
它不仅用量少，不会引起出血，也不依赖于内源性辅助因子；而肝素则有引起出血的危险，在弥漫性血管内凝血的发
病过程中抗凝血酶III往往减少，这将限制肝素的疗效，采用水蛭会有较好的效果
2.
应用
水蛭素是一类很有前途的抗凝化瘀药物，它可用于治疗各种血栓疾病，尤其是静
脉血栓和弥漫性血管凝血的治疗；也可用于外科手术后预防动脉血栓的形成，预防溶解血栓后或血管再造后血栓的形成；改善体外血液循环和血液透析过程。在显微外科手术中常因为吻合处血管栓塞而导致失败，采用水蛭素可促进伤口愈合。研究还表明，水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。它能阻止肿瘤细胞的转移，已证明有疗效的肿瘤如纤维肉瘤，骨肉瘤，血管肉瘤，黑素瘤和白血病等。水蛭素还可配合化学治疗和放射治疗，由于促进肿瘤中的血流而增强疗效。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素均无明显毒副作用，无论急性、亚急性的毒性试验，对血压、心率、血相、出血时间和血液化学成分均不受影响，呼吸系统也没有影响，无过敏反应，一般无特异抗体发现。半致死剂量LD50＞50mgAg，远大于治疗所用的剂量(1mgAg)。尤其值得指出的是，水蛭素可以口服，这给用药带来很大方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶和糜蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用，这就可以解释为何口服中药水蛭提取液仍然有疗效的原理。近年来在我国以水蛭素为主要成分的中成药已有许多种，如脑血康口服液、抗血栓片、活血通胶囊等，其年产值达数千万元。含水蛭的新药也在不断研究和推出。利用基因工程生产重组水蛭类多肽药物，以取代水蛭素或作为抗凝化瘀药的添加成分，这在近期内就可实现。作为注射剂用于心血管系统疾病和肿瘤治疗药物，则还需要进一步的临床研究。毋庸置疑，重组水蛭素类多肽药物的开发将会带来巨大的社会效益和经济效益。
水蛭素抗血栓肽将进入临床试验
水蛭素抗血栓肽将进入临床试验
孙国凤
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】1991(000)006
【摘 要】美国Biogen公司在美国开始抗血栓蛋白水蛭素的临床试验.水蛭素是吸血希耳制造出来的血液凝固抑制肽.该公司以水蛭素的作用部分为基础设计的新肽“Hirulog”有水蛭素的约2倍的血液凝固作用.已结束第一阶段的临床试验,没有发现出血过多和引起过敏等严重副作用,最近将对抑制血栓形成的抗凝血酶药着手第二阶段临床试验.
【总页数】1页(P20-20)
【作 者】孙国凤
【作者单位】
【正文语种】中 文
【中图分类】Q81
【相关文献】
1.两种新型抗血栓药物--水蛭素与水蛭肽 [J], 王于杰;陈劲春
2.重组水蛭素抗凝和抗血栓形成作用的实验研究 [J], 马雪瑛;林成仁;刘志去;王敏;葛争艳;石体仁;刘建勋;范开;王建;张益
3.水蛭素与阿司匹林联用抗血栓治疗的研究 [J], 朱再胜;杜晓红;李颖
4.口服重组水蛭素抗凝、抗血栓作用的实验研究 [J], 成小蔓;杨辉
5.重组水蛭素的抗血栓形成作用及其机制 [J], 曹文理;李菁 因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买
中药水蛭生药学与化学成分的研究进展与展望
中药水蛭生药学与化学成分的研究进展与展望
刘晓帆;杨瑶珺;吴丽洁;徐佳
【摘 要】本文系统总结了近年来水蛭的原动物品种、鉴定与质量评价、化学成分等研究,并对水蛭药材的未来的发展前景做了初步展望.通过查阅大量文献,发现2010版在水蛭的来源的描述与实际情况有较大的偏差,主要体现在分类和命名方面.对于水蛭的药材质量和化学成分的研究,近年来的研究均集中在性状鉴别和指纹图谱等定性鉴别和对水蛭中的大分子物质的研究,对水蛭的定量理化鉴定和小分子物质研究较少.%These passage summaries recent years of
research of Hirudo, including species identification and quality, chemical
composition, pharmacological effect etc. This passage also preliminary
prospects the development in the future. Through research the literature,
the author found that there is a huge different between the description of
China Pharmacopoeia and the actual situation, particularly the
classification and nomenclature. To Hirudo medicine quality and chemical
composition studies, recent research are focused on the morphological
identification and fingerprinting identification and the macromolecules,
动物药水蛭高温炮制的科学合理性
动物药水蛭高温炮制的科学合理性
动物药主要含蛋白质，蛋白质是具有四级结构的有机大分子，具有热变性的属性，在高温条件下持续作用时，蛋白易变性而致其生物活性丧失、某些理化性质和生物化学性质改变。水蛭是经典的破血逐瘀类动物药。炮制入药历史悠久，其传统的炮制方法，无论是《中国药典》收载的滑石粉烫炒法还是北京地区的特色炮制工艺酒炙法，基本都需要高温处理，其炮制目的多局限于当时技术条件。该文从水蛭现有炮制工艺及其特点出发，对高温炮制前后水蛭的主要活性成分与药理活性的变化进行总结，分析结果表明高温炮制会使水蛭中的蛋白质变性；活性多肽水蛭素会被部分或完全破坏；炮制过程会使水蛭中铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）等有毒无机元素含量下降；加热也会促使水蛭中某些物质转化为具有降压、平喘、镇痛作用的次黄嘌呤，进而实现减毒和缓和药性的目的。高温对水蛭药理活性的影响主要表现在抗凝活性、抗血栓活性等方面。该文在了解动物药水蛭炮制研究现状的同时，对水蛭高温炮制科学合理性未来的研究手段和研究方向提出思考。
标签：动物药；水蛭；高温炮制；科学合理性
[Abstract]Animal medicines mainly contain protein which was organic molecule
with quaternary structure and had the property of thermal denaturation When
suffering from heat for a consistent time， the native conformation of protein would
be destroyed After denaturation the biological activity of protein will lose and some
physicochemical and biochemical properties will be changed Leech was a classical
抗凝良药水蛭素的研究进展
抗凝良药水蛭素的研究进展
陈华友 黄 静 蒋芝君 邢自立 吴自荣
(华东师范大学生命科学学院上海
200062)
摘要 从水蛭素的分子生物学性质、克隆表达研究
,以及临床应用研究等主要方面论
述抗凝防栓良药水蛭素的研究进展。并对水蛭的临床应用价值
,开发研究成为抗栓领域的
一大热点进行了论述。
关键词 水蛭素 大肠杆菌 表达系统 枯草杆菌
当今心血管疾病已成为危害人类健康的头号大
敌
,水蛭素自古以来就是防栓抗凝逐瘀之良药
,首载于
《神农本草经》、后在《本草纲目》和《中国动物药》等专
著中均有收载
,但天然水蛭素来源有限
,使其不能广泛
应用。自从
1986年重组水蛭素问世以来
,开始了大规
模的临床应用研究
,可用于抗凝抗栓
,治疗不稳定性心
绞痛
,急性心肌梗塞
,血管成形术后血栓形成
,血液透
析
,体外循环
,弥散性血管内凝血等等
,其效果明显优
于肝素等
,而又无肝素诱导的血小板减小症和血栓复
形成、肾衰等后遗症。水蛭素又无毒性
,无明显抗原性
,
在合理剂量内
,没有引起出血的危险
,因此它将成为防
治血栓类疾病的新一类药物
,具有很大的社会效益和
经济效益。本文主要从水蛭素的分子生物学性质、克隆
研究进展以及临床应用研究等方面进行综述。
1 水蛭素分子生物学性质研究
1954年
,
Markward从水蛭头部唾液腺中分离出
水蛭素纯品
,开始对其组成结构和理化性质进行研究。
20世纪
60年代进一步发展了天然水蛭素的分离和纯
化技术
,得出水蛭素由
65个氨基酸残基组成
,分子量
为
7000
D。
20世纪
70年代确证了肽链的组成和一级
结构。
20世纪
80年代完成了二级和三级结构分析。
N
端有
3个二硫桥
,使
N端肽链绕迭成密集形核心环肽
结构。
C端富含酸性氨基酸残基
,具亲水性
,游离在分
子表面。肽链中部还有一个由
pro2
lys
472
pro组成的特
殊序列
,不被一般蛋白酶所降解。
水蛭素是现在知道的最强的凝血酶特异性抑制
剂
,带负电的
C端结合在凝血酶的带正电的纤维蛋白
原识别位点
,最小保持抗凝活性的片段为酸性
重组毕赤酵母表达水蛭素发酵工艺の研究
重庆大学硕士学位论文中文摘要
摘要
天然水蛭素是从医用水蛭的唾液腺分泌的一种小分子活性多肽，是目前己知
的自然界中最强的抗凝血因子，可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限，产量低，成本高，限制了其临床应用，从而采用基因工程技术开发重组水蛭
素，可克服以上不足。
本文对基因工程菌毕赤酵母表达外源蛋白水蛭素的发酵工艺进行了深入的研
究。通过摇瓶培养筛选发酵条件，研究了工程菌的生长特性，通过单因素和正交实验，确定了工程菌的最佳生长和表达条件。在摇瓶研究的基础上，用３０Ｌ发酵罐进行了放大培养表达实验。依据工程菌生长状态来变速流加甘油和甲醇的培养方
式下，考察了溶氧、温度、ｐＨ、外营养物的添加以及改变诱导菌体密度对工程菌生长与表达的影响。结果显示，在整个发酵过程中溶氧控制在３０．５０％有利于工程
菌的生长和表达；在表达阶段，控制温度为２４℃、ｐＨ４．０、添加ｌ％的酪蛋白水解物，当菌体湿重达至１Ｊ３２０∥Ｌ后开始诱导，水蛭素的抗凝活力可达至ｌＪ３００００ＡＴＵ／ｍｌ。综合确定了发酵结束时间为诱导后４２＋时，表达量在２８０００至３１０００Ａ１ｍ／ｍｌ之间。
关键词：毕赤酵母，水蛭素，发酵重庆大学硕士学位论文英文摘要
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｎａｔｕｒａｌｈｉｎｌｄｉｎｉｓａｋｉｎｄｏｆｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓｅｃｒｅｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅ
ｓａｌｉｖａｒｙ百ａｎｄｏｆＨｉｍｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｓ，ｉｓａｍｏｓｔｓｔｒｏｎｇａｎｔｉｃｏａｇｕｌｉｎＳＯｆａｒ，Ｃａｌｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ
ｃｕｒｅｔｈｒｏｍｂｕｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅｓｏｕｒｃｅｏｆｎａｔｕｒａｌｈｉｒｕｄｉｎｉｓｌｉｍｉｔｅｄ，ｌｏｗｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｈｉ曲ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｏｓｔ，ｔｈｕｓｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｉｎｉｃ．ＴｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｉｒｕｄｉｎｂｙｕｓｉｎｇｇｅｎｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣａｎｈｕｒｄｌｅｔｈｅｓｈｏｒｔｃｏｍ．
水蛭素生物学特性的研究进展
第 5 卷 第 1 期2019 年 2 月生物化工Biological Chemical EngineeringVol.5 No.1Feb. 2019
水蛭素生物学特性的研究进展
张子文，王尉，刘胜男，张舒宁，张耀方
（天津农学院 基础科学学院，天津 ３００３８４）
摘 要：水蛭素是由水蛭唾液腺分泌的一种酸性多肽，能够从一定程度上影响血液凝固和促进纤溶，是迄今为止所发现最强
的凝血酶天然特异抑制剂，在治疗血栓类疾病和心血管疾病具有很好疗效，同时还有良好的抗炎、抗肿瘤作用。本文对水蛭素的
结构和作用作一综述。
关键词：水蛭素；凝血酶；抗凝血
中图分类号：Ｒ２８５ 文献标志码：Ａ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｈｉｒｕｄｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
Ｚｈａｎｇ Ｚｉ－ｗｅｎ， Ｗａｎｇ Ｗｅｉ， Ｌｉｕ Ｓｈｅｎｇ－ｎａｎ， Ｚｈａｎｇ Ｓｈｕ－ｎｉｎｇ， Ｚｈａｎｇ Ｙａｏ－ｆａｎｇ＊
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４）
Abstract: Ｈｉｒｕｄｉｎ ｉｓ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ａｃｉｄｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｏｆ ｌｅｅｃｈ， ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ａｆｆｅｃｔ ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｔｏ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｘｔｅｎｔ． Ｉｔ ｗａｓ ｅｖｅｒ ｆｏｕｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｎａｔｕｒａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ａｎｄ ｈａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｎｔｉ－ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ａｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｈａｓ ｇｏｏｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ． Ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｍａｉｎｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｒｕｄｉｎ．Key words： Ｈｉｒｕｄｉｎ； Ｔｈｒｏｍｂｉｎ； Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ