细胞冻存与复苏-注意事项
细胞冻存、复苏、传代、转染(超详细版)
细胞培养系列方法【实验前准备】（1）实验前准备好高压的离心管、冻存管、1ml/100ul枪头、PBS溶液。
（2）清洁超净工作台面，照紫外30分钟；同时根据需要将培养基、胎牛血清、胰酶PBS液、双抗置于室温下复温。
细胞的冻存与复苏【实验用品】（1）材料：培养的贴壁细胞（70%-80%融合）、于液氮中冻存的细胞（2）试剂： PBS液、0.25%胰蛋白酶液、DMEM培养基、胎牛血清、二甲亚砜（DMSO）、双抗（3）设备：培养瓶、巴氏吸管、15ml离心管、1.5ml冻存管、盛酒精的喷壶、培养箱、离心机、液氮灌、倒置显微镜、超净工作酒精灯、水浴锅、CO2台。
试剂配制：（1）完全培养基含90%DMEM培养液加10%的胎牛血清加1%的双抗。
（2）冻存液含80%的DMEM培养基加10%的胎牛血清加10%的DMSO，用吸管混匀，置于4℃冰箱中备用。
细胞的冻存(1)依照传代的方法用0.25%胰蛋白酶液对处于对数生长期的单层细胞进行消化。
(2)收集消化细胞于离心管中，800-1000r/min离心5min。
(3)弃上清液，加入适量冻存液，用吸管吹打细胞制悬，调整细胞密度为5*106-1*107个/ml。
(4)每个冻存管分装细胞悬液1.5ml，旋紧冻存管的盖，并用封口膜密封。
(5)在冻存管上标明细胞的名称、冻存时间、冻存人名等。
(6)将冻存管置于如下条件下逐步加以冻存：4℃,0.5h→-20℃，1h→-80℃，过夜→转入液氮灌中。
细胞的复苏（1）准备水浴锅，调温度至37℃。
打开离心机。
（2）用止血钳从液氮灌中取出细胞冻存管1只，迅速将其置入38℃水浴锅中，不断摇动使冻存的细胞悬液尽快融化。
（3）用酒精棉球擦拭冻存管，放入超净工作台中。
（4）将已融化的细胞悬液用吸管移入离心管中，加10倍体积的DMEM培养基，吹打混匀。
（5） 1000r/min离心5min，弃上清液。
（6）加入培养液吹打沉淀的细胞，使其悬浮，对细胞进行计数。
细胞冻存的方法及要点
细胞冻存的方法及要点
细胞冻存的方法及要点如下：
1. 准备冷冻培养基，分装成1ml，冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。
也可以使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。
2. 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。
3. 每个冻存管中分装1ml冻存培养基，放置在冰上操作。
4. 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60℃或更低温度的冰箱，放置16~24小时。
5. 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。
如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。
6. 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。
细胞冻存可以保护细胞免受微生物污染、化学污染和物理损伤，是进行细胞储存、运输和交换的一种方法。
冻存前需确保细胞处于健康状态，密度适宜，并且在冷冻和复苏过程中采取适当的措施，以保证细胞的存活率。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞复苏的原理和方法
细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。
细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。
与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
细胞复苏的方法如下：1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。
在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。
细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。
如果37℃水浴时间延长，会提高细胞死亡率。
2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。
3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。
三天可进行一次换液。
当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。
此外，还有一些注意事项：1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。
如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。
由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。
2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。
4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。
动物细胞的冻存和复苏
细胞冻存及复苏一、【实验目的】1、掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存实验方法2、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
二、【实验原理】低温液氮冻存贮存细胞是细胞培养室常规通用技术。
这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会；并防止了在多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。
液氮中温度可达-196℃，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。
为培养工作提供了极大的方便。
在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。
如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生甘油和二甲亚砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有一定的保护作用。
保护剂的使用浓度一般在5%～15%。
降温方法：使用降温仪：以-1～-2℃/min的降温速率→ -25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降温速率→-100 ℃→迅速浸入液氮中。
分步降温：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。
三、【实验仪器与试剂】1、仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。
2、材料：冻存管，离心管，细胞培养用材料，500 mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75％酒精棉球。
3、药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．25％胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜(DMSO)或甘油，0．5％台盼蓝染液，液氮。
四、【实验步骤与内容】1、细胞悬液的准备1）75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。
细胞冻存注意事项
细胞冻存注意事项细胞冻存是一种用于长期保存和保护活的细胞的方法。
它可以帮助科学家们保存珍贵的细胞系列和遗传资源，以便在未来的研究中使用。
然而，为了能够成功地进行细胞冻存并保持细胞的完整性和功能，有几个重要的注意事项需要牢记。
首先，细胞的选择和处理非常关键。
在进行冻存之前，需要仔细检查细胞的生长状态和纯度。
细胞应该是健康的、无菌的，并且没有任何可能影响细胞质保护和复苏的潜在问题。
处理细胞时要小心，并尽可能减少细胞的暴露于外界环境的时间，以防止细胞的损伤和变化。
其次，选择适当的冷冻保护剂和冷冻介质也是非常重要的。
冻存过程中，添加适当的冷冻保护剂可以有效地减少细胞受到的冻结损伤。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO和血清蛋白等。
冷冻介质应该是无菌的，能够保持细胞的稳定性，并提供适当的pH和离子平衡。
第三，选择合适的冻存方法也是非常重要的。
目前，最常用的细胞冻存方法是液氮冷冻保存法。
在这种方法中，细胞应该在冻结之前缓慢冷却，并在冷冻过程中避免冰晶和冷冻损伤的形成。
冻存容器也应该是无菌的，并且能够提供最佳的细胞保护环境。
第四，正确的冻存和解冻过程也是非常重要的。
冻存过程中，必须确保细胞被均匀地分装到冷冻容器中，并且冻存温度和冷冻速率控制在适宜的范围内。
解冻过程中，需要逐步将细胞恢复到正常的生长条件下，避免快速温度变化和暴露于有害物质。
此外，适当的质量控制和记录对于冻存和解冻过程的监控也是必要的，可以帮助确保冻存的细胞质量和完整性。
最后，对冻存细胞样本的定期监测和维护也是至关重要的。
冻存细胞应该定期检查其活力和纯度，并及时采取必要的措施来确保细胞的完整性和功能。
此外，冻存细胞的备份也是很重要的，可以将冻存样本放置在不同的存储位置，以防止任何可能的突发情况。
总之，细胞冻存是一项复杂的技术，需要仔细的规划和操作。
选择适当的细胞和处理方式，使用适当的冷冻保护剂和介质，采用合适的冻存方法和解冻过程，以及定期监测和维护冻存细胞样本都是非常重要的。
细胞冻存步骤范文
细胞冻存步骤范文细胞冻存是一种常见的研究技术，它能够将细胞样本保存在非常低的温度下，以便长期保存和使用。
下面是细胞冻存的一般步骤和注意事项。
1.选取适当的细胞首先，我们需要选择适合冻存的细胞。
一般来说，由于其易于维持和操作，肾上腺皮质细胞、乳腺上皮细胞等成熟细胞被广泛应用于细胞冻存。
此外，干细胞和肿瘤细胞等具有特殊生物学性质的细胞也可以被冻存。
2.细胞培养在细胞冻存之前，需要进行细胞培养，以保证细胞数量足够并且处于最理想的生长状态。
一般来说，细胞会在培养皿中以液体方式培养，使用含有适宜的营养物质和生长因子的培养基。
同时，细胞宜处于对称的增殖期，以便保证细胞的活力和生命力。
3.细胞分离和处理在细胞培养达到最佳状态后，可以开始进行细胞分离和处理。
细胞分离方法多样，例如酶处理法、离心法和脱附法等等。
分离的目的是将细胞从培养底物中分离出来以便于后续的冻存处理。
4.细胞冻存液的准备细胞冻存液主要由培养基、凝胶剂和冻存剂组成。
培养基可以提供细胞正常生长所需的营养物质，凝胶剂可提供支撑和空间结构。
冻存剂通常是由DMSO（二甲基亚砜）或甘油等物质组成，具有较低的冰点和高渗透性，能够保护细胞免受低温冻结时的伤害。
5.细胞冻存管的准备细胞冻存管需要提前准备好。
首先，应选择具有良好密封性和化学惰性的管子。
然后，将细胞冻存液加入冻存管中。
值得注意的是，冷冻管中的液体应占容器的一部分，以允许细胞经历冷冻和解冻时的体积变化。
6.细胞冷冻细胞冻存的第一步是冷冻细胞。
通常，细胞需要在-80°C的低温下快速冷冻。
为了优化冷冻速度，可以在冷冻前将细胞盖子放在冷冻器中，或使用专用的冷冻器。
7.长期储存8.细胞解冻和复苏当需要使用冷冻保存的细胞时，需要进行细胞解冻和复苏。
首先，需要将细胞冷冻管迅速从液氮罐中取出，置于37°C水槽中进行快速解冻。
解冻之后，应立即将细胞转移到含有适宜的培养基的培养皿中，并迅速将细胞置于37°C的培养箱中进行恢复。
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方法：
冻存液最好现配：按1：3：6（或1：2：7）配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。
取生长状态量好的细胞进行冻存处理，对于贴壁细胞：
1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次
2胰酶消化
3加培养基中止消化，有的细胞是加血清中止
4离心收集细胞，不同细胞离心率不一样（以上仅为贴壁细胞，悬浮细胞收集就用第四部）5吸出离心管上清液，加1ML 的冻存液重悬细胞，移到冻存管，放4度半小时，-20 度两小时，-70度过夜，再放液氮长期保存
悬浮细胞：直接离心收集，PBS洗涤
注意事项：
1.错误的时机：
细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；
连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。
最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。
1.细胞太少：
冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。
（复苏很难成功）。
解决：
离心后调整细胞浓度。
（不要重新洗细胞）。
1.盖子不紧：
冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。
解决：
选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。
1.单薄的冻存盒：
放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。
解决：
选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。
（冻存的原则：缓降！）
1.-80度太久：
放在－80度冰箱的时间超过半年。
（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：
尽快转入液氮。
1.液氮不足：
液面不能漫过所有细胞。
解决：
定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。
1.取错细胞：
找不到/拿错冻存管。
解决：
每支冻存管都标上细胞的名称，冻存时间，并记录在册。
二、细胞复苏：
方法：
1.从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2.从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以
上培养液，混匀；
3.离心，1000rpm，5min；
4.弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，
37℃培养箱静置培养；
5.次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1.取错细胞：
拿错冻存管。
（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！
1.水浴时间太长：
2min还没融化。
（冻存管的壁较厚，隔热）
解决：
（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。
1.冰盒内时间太长：
复苏1h后，还没有加入新的培养液。
（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。
1.失去耐心：
复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。
（有些细胞复苏后一星期，才有起色）
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定,英格恩。