发酵综合实验 实验报告

目录

摘要.................................... 错误！未定义书签。

1 引言 (4)

2材料与方法 ............................ 错误！未定义书签。

3 结果与讨论............................ 错误！未定义书签。

4 总结.................................. 错误！未定义书签。

5 心得体会.............................. 错误！未定义书签。参考文献................................ 错误！未定义书签。

蛋白酶的发酵工艺研究

摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响。通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3.0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，pH 7.2-7.4为最适宜培养基组分。并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。

关键词：中性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐

The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment.The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis （AS1.398） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml, corn flour 4.0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml,disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture. Keywords: Neutral protease；Bacillus subtilis；Shaking culture；Fermentation

1 引言

1.1 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性最优。微生物来源蛋白酶一般按蛋白酶的最适pH值分为酸性、中性、碱性蛋白酶三类。中性蛋白酶最早被发现并广泛应用于工业化生产中。本实验采用枯草芽孢杆菌AS1.398做为研究菌株，其产酶量大，酶的耐热性好，因而被广泛应用于工业化生产中。此菌株在C/N为1:4左右时的产蛋白酶活性最高，并且有机N源优于无机N源，因而其发酵成本较高。探索新的发酵途径，寻找更加经济的组合方式显出了重大的意义。

1.2 此次实验主要做蛋白酶摇瓶发酵工艺的优化，改变发酵的C源浓度和接种量，测定蛋白酶酶活，以确定最优的发酵工艺条件。提取发酵液中的蛋白酶，测定酶活算出前后总活力，计算得率。并且进行发酵罐培养实验，比较发酵罐培养与摇瓶培养的产酶活性差异。通过此次实验学习蛋白酶的测定方法和发酵液酶蛋白的初步提取方法，考察不同发酵条件对微生物产酶的影响，以及熟悉小型发酵罐的使用方法，包括灭菌，清洗，加料，接种，取样等环节。

2 材料与方法

2.1 菌种

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）AS1.398

2.2试剂

（1）生理盐水：称取0.85g NaCl ,用蒸馏水定容至100ml, 即为0.85%生理盐水， 121℃灭菌20min。

（2）福林试剂（Folin试剂）:使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。

（3）0.4mol碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g, 用蒸馏水定容至1000ml。

（4）0.4mol三氯乙酸（TCA）溶液:称取三氯乙酸65.4g,用蒸馏水定容至1000ml。

（5）pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.2g,用蒸馏水定容至1000ml,即成0.2mol溶液（A液）。称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.63g,定容至1000ml,即成0.2mol溶液（B液）。

取A液28ml和B液72ml,再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液。

（6）2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10ml，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100ml即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。

（7）100µg/ml酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重