细胞工程基础实验技术(细胞育种)教案

实验1 细胞工程基础实验技术

实验准备：

MS培养基母液配制

按配方表配制MS培养基母液：大量元素配20×，微量元素和其它成分配制成200×，母液贮存于2～4℃的冰箱中。

植物激素配制

BA和NAA配制成浓度为0.5mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。

1.1 实验目的

使学生了解培养基母液的配制方法和注意事项；掌握培养的配制及灭菌方法，为植物愈伤组织诱导实验准备培养基。

1.2 实验用品及溶液

实验按每4个学生一组，每组分发培养基母液及激素母液一套，50ml量筒、1000ml 有刻度烧杯、吸球、电炉各1 个，5ml移液管9支，50ml三角瓶20个。

公用设备：pH计，高压灭菌锅。

1.3 操作方法

实验按500ml容量一组配制培养基，保证下一次实验每一学生有5瓶培养基供接种用。

愈伤组织诱导培养基：MS＋BA 2mgl-1+NAA mgl-1+ Sucrose 20g-1+ Agar 7g-1 A．向容量瓶中顺序加入培养基母液：

大量元素25ml

微量元素2.5ml

铁盐 2.5ml

其它成分各2.5ml

BA和NAA 各2.0ml

B．加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水，加入10g蔗糖后搅拌使其溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。

C．加入3.5g琼脂，将烧杯置于电炉上，搅拌加热使琼脂完全溶化，然后用蒸馏水定容至终体积500ml，继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。用记号笔写上学号或姓名。

D. 分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力

1.1kg/cm2，灭菌时间20min.左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

1.4 记载内容

培养基配制过程。

灭菌方法

介绍不同类型灭菌设备的使用方法；采用高压蒸汽灭菌器对配置的培养基进行灭菌。

实验2 无菌操作及愈伤组织诱导技术

实验准备：

烟草无菌试管苗培养：将烟草种子用消毒液84＃消毒后，无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，接种在MS培养基上。种子苗具4-5叶时继代扩繁90盒，保证每学生1盒。

无菌培养皿每学生2套。

实验课开始前30min. 将实验用具、培养基及无菌烟草苗同时用酒精用75%酒精擦洗后置于超净工作台，打开超净工作台风机和紫外灯。

2.1 实验目的

掌握无菌操作技术；基本掌握植物愈伤组织诱导培养技术和调控条件。

2.2实验材料及设备

外植体材料：烟草无菌苗叶片；实验1配制的培养基。

设备及工具：超净工作台；不锈钢镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等；75%酒精。

2.3 操作方法

A. 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。

B. 点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。

C. 取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种4-5小片。

D. 快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。

E. 接种后的三角瓶置于24℃，条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养直至愈伤组织形成。

注意外植体切割时，动作要快，否则会造成失水而影响生长。为防止操作时失水也可在培养皿中滴几滴无菌水，然后将无菌苗置于其中进行切割。

2.4 记载内容

培养基凝固状况；实验操作过程；叶片生长状况、接种外植体大小；每瓶接种数、接种总瓶数。

实验3 器官发生与植株再生调控培养；愈伤组织增殖培养

实验准备：

配制器官分化和愈伤组织诱导培养基。

培养基配方：分化培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和0.5mgl-1NAA。愈伤组织增殖培养基—MS基本培养基附加2.0mgl-1BA、和2.0mgl-1NAA。

3.1 实验目的

观察和分析不同光照条件形成的愈伤组织对器官分化的影响，观察和分析愈伤组织诱导和器官分化的激素使用差异；了解器官分化和植株再生的过程。掌握离体培养中的转接技术。

3.2 实验材料及设备

实验材料：实验2中诱导的愈伤组织

实验设备和用具：同实验2。

3.3 操作方法

A. 观察实验1愈伤组织诱导结果：统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析。

愈伤组织形成率＝愈伤组织数/接种外植体数

B. 按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。

C. 将实验2中光照下诱导的愈伤组织，全部转入分化培养基上，黑暗诱导的愈伤组织一半转入分化培养基，所有转入分化培养基的愈伤组织均置于连续光照或16h/d光照，温度20－22℃条件下培养。

需要注意的是，愈伤组织的状态常常受许多因素的影响，如果转入分化培养后3－4周仍然没有芽的形成，或愈伤组织状态没有明显变化，应及时调整培养基激素浓度，更换新鲜培养基。

D. 将另黑暗下培养的另一半愈伤组织转入增殖培养基中，继续置于黑暗条件下培养，培养温度24℃。

3.4 记载内容

上次实验愈伤组织诱导结果：愈伤组织诱导率；愈伤组织状态、大小；不同光照形成的愈伤组织状态描述；污染率统计。

本次实验操作过程，接种瓶数，每瓶接种量。

实验4 细胞悬浮培养

实验准备：

用MS培养基配置2%的果胶酶并用过滤灭菌器过滤；配置液体培养基分装于200ml的三角瓶中，每瓶50ml。

培养基配方：MS无机盐附加烟酸0.05mgL-1、VB6和VB1各0.01mgL-1、甘氨酸3mgL-1、肌醇100mgL-1、激动素0.2mgL-1、2,4—D 0.1mgL-1、蔗糖20gL-1，pH5.8。

4.1 实验目的

了解细胞悬浮系建立的全过程，掌握细胞液体悬浮培养技术。

4.2 实验材料

烟草叶片在黑暗条件下培养形成的愈伤组织，再经过1-2次增殖培养后用于悬浮细胞系的建立（可与体细胞胚诱导实验同时培养）。

4.3 操作方法

A. 按照实验2相同的步骤，作好无菌操作准备。

B. 在净化工作台上，用无菌注射器将果胶酶1ml加入到已灭菌的含有液体培养基的三角瓶中，轻轻摇匀，再将复合要求的松散愈伤组织用细胞铲接种于液体培养基中。接种量大约为培养基体积的十分之一。

C. 接种后的三角瓶用1/100的天平称取重量并记载，然后置于摇床上，在转速100rpm，25℃下培养。

D. 培养24小时后，将培养物收集到50的离心管中，在800 rpm下离心5min.，去除含有果胶酶的培养基，加入新鲜培养基，摇匀再离心一次，去除上清夜，然后按照细胞与培养基1：10的比例接种到三角瓶中。

E. 培养5天后观察结果。

4.4 结果观察内容

采用重量法测定细胞生长量。

实验5 种子细胞筛选与细胞规模化培养