QRT-PCR(荧光定量PCR)
简述荧光定量pcr的用途
简述荧光定量pcr的用途荧光定量PCR（qPCR）是一种通过测量DNA分子在PCR反应过程中的指数增长来定量目标序列的技术。
与常规PCR相比，qPCR具有更高的灵敏度、更广的动态范围和更准确的结果。
由于其高效性和可靠性，qPCR在许多生命科学领域中得到广泛应用。
荧光定量PCR的主要用途之一是基因表达分析。
通过检测特定基因的mRNA水平，我们可以了解基因在不同组织、不同生理状态或不同疾病中的表达水平差异。
这对于研究基因调控机制、寻找潜在治疗靶标以及诊断疾病具有重要意义。
另一个重要的应用是病原微生物的检测和定量。
通过qPCR可以检测特定细菌、病毒或真菌的DNA或RNA，快速而准确地确定其存在与否，甚至定量其数量。
这对于临床诊断、食品安全和环境监测等领域具有重要意义。
荧光定量PCR还广泛应用于遗传学研究。
通过qPCR可以快速测定遗传突变或多态性的存在与否，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失突变等。
这对于遗传疾病的筛查、人口遗传学研究以及个体化医疗具有重要意义。
此外，荧光定量PCR还可以用于DNA甲基化分析、病毒载量测定、组织移植监测等方面。
这些应用都依赖于PCR的高灵敏度和准确性。
荧光定量PCR的核心原理是使用荧光染料标记PCR产物，并通过荧光强度的变化来反应PCR反应过程中目标序列的富集情况。
常用的荧光染料包括SYBR Green和探针，如TaqMan探针和分子雷达探针等。
在SYBR Green qPCR中，SYBR Green染料可与双链DNA结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，目标序列的数量随着时间的增加而增加，导致SYBR Green染料结合的DNA分子也增加，从而产生荧光信号的增强。
通过检测荧光信号的增加速率，可以确定PCR反应开始的阈值循环数（Ct值），Ct值越低表示起始DNA数量越多。
在探针PCR中，探针被荧光标记，并与目标序列的特定部分互补结合。
当探针与目标序列结合时，荧光受阻，不发出信号；当探针被3'末端酶水解，荧光信号就被释放出来。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
荧光定量pcr的基本原理讲稿
荧光定量pcr的基本原理讲稿荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度、高特异性的DNA定量方法。
该方法通过在PCR反应过程中使用特定的荧光信号，实时监测扩增产物的累积情况，从而确定起始模板的数量。
本文将以1500字以上的篇幅，详细介绍荧光定量PCR的基本原理。
一、PCR的基本原理PCR是一种体外扩增DNA特定片段的技术，它基于DNA的复制过程。
PCR反应体系中包含目标DNA序列、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液等多种组分。
PCR 反应主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性PCR反应开始时，反应体系中的DNA双链被高温（通常为94-98C）变性为两条单链，并释放出目标序列片段。
2. 退火PCR反应体系降温至退火温度（通常为55-65C），引物特异性结合到目标序列的两条单链上。
引物的选取通常需要考虑引物的长度、GC含量、特异性等因素。
3. 延伸PCR反应体系升温至延伸温度（通常为72C），聚合酶沿引物向下游延伸合成新的DNA链。
该过程有高效率的DNA合成。
以上三个步骤组成了PCR的循环体系，反复进行循环扩增，可在短时间内从一条目标DNA序列扩增到数百万条，从而实现了DNA定性和定量。
二、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR（qPCR）基于PCR技术，引入了用于荧光信号的特定探针，通过实时监测荧光信号的强度来定量目标DNA。
荧光定量PCR主要包括两种类型的探针：DNA靶向探针和荧光染料。
1. DNA靶向探针DNA靶向探针是一种特异性结合到目标序列的短链DNA分子，其中至少含有一个荧光物质和一个阻尼剂。
典型的DNA靶向探针包括TaqMan探针、分子别探针、Beacon探针等。
这些探针与目标序列的结合会导致探针内的荧光物质被释放出来，从而产生荧光信号。
2. 荧光染料荧光染料是一种无靶向结合到DNA的分子，其荧光性能会受到DNA的存在而发生变化。
典型的荧光染料包括SYBR Green、EvaGreen等。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
qrtpcr溶解曲线
qrtpcr溶解曲线
qRT-PCR溶解曲线是一种常用的实验技术，用于确定目标基因在不同样本中的表达水平。
该技术结合了逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)和溶解曲线分析，能够定量测定靶基因的转录水平。
在qRT-PCR实验中，首先需要从细胞或组织中提取RNA，再通过逆转录酶将mRNA转录成cDNA。
随后，利用合成的cDNA模板进行PCR 反应，其中包含了目标基因的引物和探针。
PCR反应进行时，不断累积产生的DNA可以通过荧光染料的反应来监测。
溶解曲线分析是基于PCR产物的熔解温度来判断目标基因的准确拷贝数。
通过逐渐升高温度，DNA双链逐渐解离，并产生荧光信号的下降。
溶解曲线图是以荧光信号强度（纵轴）和温度（横轴）为标度绘制的曲线，通过分析峰值的温度和形态可以确定PCR产物的特征。
溶解曲线分析可以用来检测PCR反应的特异性和杂交偶联的问题。
通过观察溶解曲线图，可以判断PCR产物是否存在多种长度或非特异性扩增，进而评估反应的可靠性和准确性。
综上所述，qRT-PCR溶解曲线是一种重要的实验方法，用于定量检测目标基因的表达水平，并可以诊断PCR反应的特异性和准确性。
万字长文讲清荧光定量pcr
万字长文讲清荧光定量pcr荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）是一种基于PCR技术的定量分析方法，它可以对DNA或RNA样品中的目标序列进行定量测定。
与传统PCR方法相比，荧光定量PCR具有更高的灵敏度和准确性。
在荧光定量PCR中，首先需要设计一对引物，它们能够特异性地结合到目标序列的两个相邻区域上。
引物的设计需要考虑多个因素，如引物长度、GC含量、Tm值等。
引物的合成通常由专业实验室完成，确保其质量和纯度。
在PCR反应中，首先将DNA或RNA样品与引物、荧光探针和酶进行混合。
然后，在一台PCR仪中，通过一系列的温度变化，使DNA 或RNA样品经历一系列的变性、退火和延伸过程，从而得到目标序列的扩增产物。
在PCR反应过程中，荧光探针发挥着重要的作用。
荧光探针通常由一个引物序列和一个荧光染料序列组成。
当荧光探针结合到目标序列上时，荧光染料与引物序列之间的约束被打破，导致荧光信号的释放。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，可以通过荧光定量PCR仪进行检测和定量分析。
荧光定量PCR仪是一种专门用于测量荧光信号的仪器。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号强度，并根据荧光信号的变化来确定目标序列的初始浓度。
荧光定量PCR仪通常配备有相应的软件，可以自动分析和处理荧光信号数据，生成定量分析结果。
荧光定量PCR在许多领域都得到了广泛应用。
例如，在生物医学研究中，荧光定量PCR可以用于检测病原体的存在和数量，帮助诊断和治疗疾病。
在农业科学中，荧光定量PCR可以用于检测转基因作物的存在和数量，以及检测植物病原体的感染情况。
在环境科学中，荧光定量PCR可以用于监测水体和土壤中的微生物污染情况。
荧光定量PCR的发展和应用为科学研究和实验室诊断提供了重要的工具。
它不仅提高了DNA或RNA分析的灵敏度和准确性，还大大加快了实验的进行速度。
随着技术的不断改进和创新，相信荧光定量PCR将在更多的领域发挥重要作用，为人类的健康和环境保护做出更大的贡献。
microRNA的qRT-PCR检测方法
microRNA的qRT-PCR检测方法（1）选择内参基因：最好选择U6作为内参，actin 、tublin、5S、EF1-a也可以，最好选择两个内参为参照（两个内参结果更加可靠）。
（2）引物设计：所选基因使用Bencon Designer 软件进行引物设计。
此软件会把输入的序列和NBCI上的基因做对比，选出特异性的区域自动设计引物，而Primer 5只是在序列上自己设计引物，这样设计可能会有非特异性扩增。
Bencon Designer 软件使用步骤如下:打开Bencon Designer--File--New Sequence--粘贴序列--Add--在此方框中选择SYBR Green Design。
单击符号BLAST Search Sequence--Eukaryotic Genome BLAST--Search（等一会自动生成一个对比结果，可以不用看）--单击Primer Search--Primer Parameters（Tm和Ta为55±5℃、Length 18 to 24bp、Amplicon Length 75 to 200 bp、Alternate Primer Pairs 5）--Search--OK（自动生成Sense和Anti Sense序列，直接可以送公司合成序列）。
（3）RNA提取：Trizol法提取植物总RNA，跑1%的琼脂糖凝胶电泳（可以看到small RNA），也可以用热酚法提取小分子RNA。
（OD260/OD280在1.8-2.2之间，OD260/OD230在2.0-2.2之间）。
（4）microRNA反转录：小分子RNA的反转录要买试剂盒，一般分两步，先在小分子RNA 后加Ploy A，再就行反转录（按试剂盒步骤操作就可以）。
（5）以反转录产物为模板稀释3倍、5倍、10倍做qRT-PCR，选择一个合适的稀释倍数（一般microRNA的qRT-PCR不做标准曲线，因为稀释10倍以上Ct值大于35）。
qRT-PCR原理与应用
引物质量评价：评价“高效+特异”
软件打分
PCR验证
qPCR扩增曲线+融解曲线
定量检测
程序设置与普通PCR无异，但产物长度较小，可使用两步法（退火延伸 qPCR程序 同时完成）替代三步法，同时需要增加荧光采样点。
也可以使用一步法qRT-PCR：使用目标序列特异性引物，同时完成逆 转录与定量。
荧光值到模板量
结果与图片
数据分析
绝对定量-标准曲线
标准品 梯度稀释
PCR-Ct扩增曲线
模板浓度 C0-Ct标曲
结果图片展示
扩增与融解曲线
相对定量-ΔΔCt法 内参基因 扩增曲线 Δ数学关系
表达量柱状图
mRNA/Lnc
miR特异性序列+茎环结构，每 个目标序列需要逆转录一次
利用ploy A
随机引物
添加ploy A
一步到位，无特异性逆转录全部RNA为cDNA
miR
茎环法
5’-端引物在逆转 录与qPCR间通用， 3’-端随机
模板质量评价
电泳
光度
梯度模板下qPCR扩增曲线
引物设计与检验
qPCR引物设计原则
原理 qRT-PCR
从PCR到qPCR
qPCR原理
荧光标记 Ct值
Taqman探针：探针两端分别接荧光基团 与荧光淬灭基团,PCR中Taq酶切开探针，
分离荧光基团，使之荧光不被淬灭
染料荧光：SYBR染料，结合DNA双螺旋大 沟发荧光，与单链不结合
扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数 （Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值
荧光定量 pcr 的基本原理和步骤 -回复
荧光定量pcr 的基本原理和步骤-回复荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种常用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它基于传统PCR技术，但在PCR反应中使用了特殊的荧光标记物，并且通过荧光信号的变化来测定目标分子的数量。
本文将详细介绍荧光定量PCR的基本原理和步骤。
一、基本原理：荧光定量PCR的核心原理是在PCR反应过程中，通过检测荧光信号的强度来确定目标分子的数量。
这种荧光信号可以来自于反应过程中特定的荧光探针或染料，也可以来自于PCR产物的累积。
荧光定量PCR通常基于特异性扩增和靶向检测的原则。
首先，通过引物的设计，选择特异性的引物来扩增目标序列。
然后，在PCR反应中加入荧光标记的引物或探针，使其与目标序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过与标准曲线比较可以确定初始目标分子的数量。
二、步骤说明：1. 样品准备：首先，从样品中提取目标DNA或RNA，并对其进行纯化和浓缩。
样品的质量和纯度对于后续的PCR反应和荧光信号的准确性至关重要。
2. 引物设计：根据目标序列的特点，设计适当的引物。
引物的选择应考虑到其特异性、长度、GC含量、3’末端的稳定性等因素。
此外，还可以设计一对引物和一个荧光标记的探针，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
3. PCR反应体系：准备PCR反应的体系。
体系中通常包括模板DNA或RNA、引物、荧光标记物、酶、缓冲液和dNTPs等。
酶的选择通常是Taq DNA聚合酶，其在PCR反应温度下活性稳定。
4. PCR反应：在PCR仪中设定合适的温度参数，按照以下程序进行PCR 反应：变性（Denaturation）→退火（Annealing）→延伸（Extension）。
这个循环通常要重复多次，以扩增目标序列。
5. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，可以使用实时荧光PCR仪，以实时监测PCR产物的荧光信号强度。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。