哈维氏弧菌铁超氧化物歧化酶基因表达及免疫作用研究
超氧化物歧化酶(SOD)的分子生物学
超氧化物歧化酶(SOD)的分子生物学
陈惠芳;王琦;付学池;梅汝鸿
【期刊名称】《生命的化学》
【年(卷),期】2003(23)4
【摘要】本文主要从分子生物学角度概述了超氧化物歧化酶基因的克隆,表达,分子调控,及转基因研究的情况。
【总页数】3页(P291-293)
【关键词】SOD;基因克隆;表达;分子调控;转基因
【作者】陈惠芳;王琦;付学池;梅汝鸿
【作者单位】中国农业大学农学与生物技术学院植病系
【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.干旱胁迫对2种海棠超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响 [J], 曹亚楠; 王奋香; 杨小娟
2.小麦籽粒超氧化物歧化酶(SOD)活性全基因组关联分析 [J], 王继庆;任毅;时晓磊;王丽丽;张新忠;苏力坛·姑扎丽阿依;谢磊;耿洪伟
3.低氧胁迫对珍珠龙趸幼鱼组织超氧化物歧化酶SOD含量的影响 [J], 陈恺琳;马鹏生;黄建盛;黄德;王婷;黄小洲
4.超氧化物歧化酶SOD及模拟物的研究现状和应用 [J], 刘胜利;吴文达;戴求仲;郑乾坤;徐毅;刘逸寒;郭庆文;王克芬;王春军;张法玲
5.地黄超氧化物歧化酶(SOD)基因的克隆和生物学特性分析 [J], 王欣格;方佳琪;朱彩云;刘童童;张耀广;李玉华
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青石斑幼鱼致病病原哈维氏弧菌的分离鉴定及致病性分析
（ｌｕｘＲ）、几丁质酶基因（ｃｈｉＡ）。 ＰＣＲ 扩增采用 ２５ μＬ 反应体
系，扩增程序：９４ ℃ ，３ ｍｉｎ，９４ ℃ ，３０ ｓ、５８ ℃ ，３０ ｓ、７２ ℃ ，
１ ｍｉｎ，３５ 个循环，７２ ℃ 延伸 ７ ｍｉｎ。 根据 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０
ｔｅｎｔ ｆｏｒｍｅｄ ａｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ｃｌｕｍｐ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｅ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｉｎ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ； ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｗｅｌｌｉｎｇ ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎｇｉｏｔｅｌｅｃ⁃
ｔａｓｉｓ ｉｎ ｇｉｌｌ ｌａｍｅｌｌａｅ； ｂｌｕｎｔｅｄ，ｆｕｓｅｄ ｏｒ ｓｈｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｖｉｌｌｉ ａｎｄ ｌｏｏｓｅｎｅｄ ｍｕｃｏｕｓ ｌａｙｅｒ ａｎｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ； ｃｅｌｌｕｌａｒ ｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ
、拟态弧菌（ Ｖ． ｍｉｍｉｃｕｓ）
［２］
ｖｅｙｉ） ［３］ 、溶藻弧菌（ Ｖ． ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ） ［４］ 等。 近年来，关于哈维
（ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）是一种海洋革兰氏阴性发光微生物，生活在
河口和海洋栖息地，需要氯化钠
［５］
。 该细菌是养殖水生鱼类
的一种重要病原体，可以感染多种水生鱼类。 患病鱼体的常
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５′—３′）
Ｆ：ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ
Ｒ：ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ
Ｆ：ＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＴＡＣＴＡＧ
动物血中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的提取
动物血中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的提取[原理]l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。
国内多采用Mccord和 Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。
[试剂和器材]1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、 2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）DEAE-Sephadex A-502、器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋[方法和步骤]1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。
（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后 4 000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。
哈维氏弧菌对条纹斑竹鲨4种酶活性的影响
哈维氏弧菌对条纹斑竹鲨4种酶活性的影响马骞;洪婧妮;蒋秋芬;苏永全;王军【期刊名称】《应用海洋学学报》【年(卷),期】2010(029)002【摘要】以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)对条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)进行病原接种试验,分别在4、8、12、24、48、72、96h后测定肝脏、脾脏、鳃及血清的酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD) 和血清中溶菌酶(lysozyme,LSZ)的活力.实验结果表明:对照组条纹斑竹鲨的这4种酶的活力呈现出明显的组织差异性,血清中SOD活力为124.32 U/cm3,显著高于其他3种酶的活力;其他组织中3种酶的活力由高到低依次为SOD、ACP、AKP.在实验组条纹斑竹鲨被感染4～72h期间,血清中SOD活力明显下降,ACP活力持续下降,感染96h后除LSZ外,其他3种酶的活力都呈回升趋势;其他组织中ACP与AKP活力变化均为被感染4h后下降,12h后明显回升,SOD则在被感染4h后活力上升,而后下降,96h后回升.这4种酶的活力的变化主要是应激作用与非特异性免疫防御作用共同作用导致的结果.【总页数】9页(P196-204)【作者】马骞;洪婧妮;蒋秋芬;苏永全;王军【作者单位】厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005【正文语种】中文【中图分类】P735【相关文献】1.条纹斑竹鲨养殖藻丛刷系统水质净化技术的应用 [J], 张达娟;张树林;孙茂军;戴伟2.中国南部海域不同地理群体条纹斑竹鲨的形态差异分析 [J], 李萌;曾凡荣;王军3.条纹斑竹鲨5个地理群体的简单重复序列中间区域分析 [J], 潘滢;郑利兵;王军4.条纹斑竹鲨IRF-1基因的克隆和特征分析 [J], 甘小妮;陈新文5.厦门湾条纹斑竹鲨生物学特性 [J], 王家樵;李军;黄良敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SOD是什么？带你走进超氧化物歧化酶的神奇世界！
SOD是什么？带你⾛进超氧化物歧化酶的神奇世界！上世纪30年代，Mann和Keilin从⽜红细胞和肝脏中分离到⼀种蓝⾊含铜的蛋⽩质，并将这种蛋⽩质命名为⾎铜蛋⽩，后来⼜陆续发现了含铁和锰离⼦的同类蛋⽩质，开始科学家并不清楚这些蛋⽩质有什么功能。
超氧阴离⼦⾃由基也是在30年代研究放射线处理⽔的过程中被Linus Pauling发现的，超氧阴离⼦是产量依赖于⽔中氧⽓的浓度。
后来通过脉冲射线技术，放射化学家确定了超氧阴离⼦共轭酸的pKa，并研究了超氧阴离⼦⾃⾝歧化反应的动⼒学性质，确定了这种物质的吸收光谱。
但Pauling不知道这种⾃由基在⽣物体系也能产⽣，更不清楚这种⾃由基会伤害组织细胞。
⼀般根据正式发表的⽂献，认为是1969年，Irwin Fridovich和他的学⽣JoeMcCord优化了这种蛋⽩的纯化⽅法，并确定了⾎铜蛋⽩具有超氧阴离⼦歧化酶活性，根据这⼀功能将这类蛋⽩命名为超氧化物歧化酶SOD。
根据Fridovich的回忆，这⼀发现是在1968年，这是⼀个多事之秋，新年开始越南战场就展开了春季攻势，4⽉著名美国⿊⼈活动家马丁路德⾦博⼠被暗杀，6⽉众议员罗伯特·肯尼迪被暗杀。
就在马丁路德⾦博⼠被暗杀的当天，4⽉4⽇，美国杜克⼤学校园内⼀个简单的酶动⼒学实验使两位科学家Joe M. McCord和IrwinFridovich发现了⼀种新的酶，根据其活性命名为超氧化物歧化酶（SOD），SOD的独特作⽤是清除⼀种氧⽓衍⽣的超氧阴离⼦⾃由基。
虽然研究技术得益于放射化学的研究，不过开始研究超氧阴离⼦的物理化学家并不接受⽣物系统存在超氧阴离⼦以及能催化这种物质发⽣歧化反应的酶。
随着越来越多的证据证明这⼀发现的正确性，最终这⼀发现被⼴泛接受。
两位科学家⾸先在美国实验⽣物学会联合会会议上⼝头报告，随后1969年以分析技术的形式发表在JBC杂志上，这也是为什么许多⽂献将这⼀年作为SOD发现的时间。
通过凝胶电泳分析，不久发现了更多类型的SOD。
哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用
哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用陶然;刘瑞;王晴;陈吉祥【期刊名称】《大连海洋大学学报》【年(卷),期】2012(027)002【摘要】从致病性哈维氏弧菌Vibrio harveyi SF1基因组中扩增获得含硫氧还蛋白还原酶（trxR）基因的1 133bp目的片段,连接至载体pMD19-T Simple。
测序结果表明,目的片段含有960 bp trxR基因阅读框,编码为319个氨基酸残基的蛋白质。
Blast分析结果显示,硫氧还蛋白还原酶蛋白氨基酸序列与哈维氏弧菌、溶藻胶弧菌、副溶血弧菌、灿烂弧菌、弗氏弧菌的硫氧还蛋白还原酶蛋白序列的相似性分别为99%、98%、96%、94%、92%。
构建表达质粒pET-28a（＋）/TrxR后转化至大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析显示,重组蛋白的相对分子质量为34 000。
用Ni琼脂糖亲和层析柱分离得到纯化的重组蛋白,将该蛋白以50μg/尾的剂量肌肉注射免疫大菱鲆Scophthalmus maximus,用ELISA法检测免疫1～4周内鱼血清中特异性抗体的效价。
结果表明,特异性抗体效价持续升高,第2周则达到1∶128。
免疫4周后用哈维氏弧菌SF1对大菱鲆进行人工感染,对照组鱼的死亡率为100%,免疫组鱼的死亡率为25%,相对免疫保护力为75%。
试验表明,哈维氏弧菌TrxR蛋白具有较好的免疫原性,可作为潜在的亚单位疫苗用于哈维氏弧菌病的免疫预防。
【总页数】6页(P137-142)【作者】陶然;刘瑞;王晴;陈吉祥【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】S941【相关文献】1.哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用2.幽门螺杆菌黏附素HpaA蛋白在大肠杆菌中表达及其免疫保护作用3.人硫氧还蛋白还原酶cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达4.哈维氏弧菌溶血素基因vhhA在大肠杆菌中的表达及活性研究5.鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因的原核表达及重组蛋白对强毒攻击的免疫保护作用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
哈维氏弧菌溶血素基因vhhA在大肠杆菌中的表达及活性研究
哈维氏弧菌溶血素基因vhhA在大肠杆菌中的表达及活性研究钟英斌;张晓华;陈吉祥;孙铂光;李筠【期刊名称】《中国海洋大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(037)001【摘要】哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是水产养殖动物(鱼、虾)的重要致病菌.已发现哈维氏弧菌对鱼类的致病性与其分泌的胞外产物中的溶血素相关,致病力最强的菌株VIB 645有2个碱基序列非常相似的溶血素基因,vhhA和vhhB.本研究将vhhA克隆于pET-24d(+)表达质粒,VHH溶血素蛋白作为1种带6组氨酸的融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了过量表达.重组菌在鱼血平板上表现出很强的溶血活性,并且在卵磷脂平板上表现出磷脂酶活性.SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子量约为43 kDa.在17,25和37 ℃时重组的VHH溶血素蛋白都能得到很好的表达,达到最大表达量的时间分别为9,6和3 h.在25 ℃进行诱导时,分泌到上清液中的表达蛋白的量最多.【总页数】6页(P97-102)【作者】钟英斌;张晓华;陈吉祥;孙铂光;李筠【作者单位】中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003;中国海洋大学海洋生命学院,山东,青岛,266003【正文语种】中文【中图分类】Q933;S917.1【相关文献】1.肠出血性大肠杆菌O157:H7Tir基因的克隆、表达及生物学活性研究 [J], 张雪寒;何孔旺;茅爱华;周俊明;俞正玉;温立斌;倪艳秀;郭容利;吕立新2.哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用[J], 陶然;刘瑞;王晴;陈吉祥3.哈维氏弧菌硫氧还蛋白还原酶在大肠杆菌中的表达及对大菱鲆的免疫保护作用[J], 陶然;刘瑞;王晴;陈吉祥4.嗜水气单胞菌TPS-30株丝氨酸蛋白酶基因与溶血素基因在大肠杆菌中的融合表达 [J], 潘晓艺;郝贵杰;姚嘉赟;徐洋;尹文林;沈锦玉5.产单核细胞李斯特菌溶血素O基因在大肠杆菌中的优化表达及ELISA检测方法的建立 [J], 赵松波;孙晓林;张少华;周邦信;窦永喜;骆学农因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
海水养殖鱼类弧菌病的研究进展
第26卷第4期海洋水产研究Vol.26,N o.4 2005年8月M ARINE FISH ERIES RESEARCH Aug.,2005海水养殖鱼类弧菌病的研究进展杨少丽1,2王印庚2*董树刚1(1中国海洋大学,青岛266003)(2中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛266071)摘要综述了由鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌等弧菌引起的海水养殖鱼类弧菌病的典型症状、病原学、病理、检测技术以及防治等方面的研究进展。
笔者对弧菌病的防治方法提出了一些有益的见解,另外对弧菌病的研究方向也进行了探讨和展望。
关键词海水养殖鱼病弧菌病检测技术防治中图分类号S941文献识别码A文章编号1000-7075(2005)04-0075-09Progress of research on vibriosis in marine cultured fishY A N G Shao-li1,2WA N G Y in-geng2*DON G Shu-gang1(1Ocean U niv ersity of China,Q ing dao266003)(2Y ellow Sea F isheries Research Inst itute,Chinese A cademy of Fisher y Scienses,Qing dao266071)ABSTRAC T T he paper summarized the research progress on the t ypical symptom,et iology, pat hology,det ective technology,the prevention and treatment of vibriosis caused by more than 10vibrio strains such as Vibrio anguil larum,V.alginoly ticus,V.harvey i and V.sp lendi-dus.T he authors provided some valuable recommendation on the prevention and t reatment f or these vibriosises,and t he f urther research direct ion w as also discussed.KEY WORDS M aricult ure Fish disease Vibriosis DiagnosisPrevention and treatment弧菌是引起海水养殖鱼类细菌性疾病的最重要的病原菌之一。
哈维氏弧菌对条纹斑竹鲨4种酶活性的影响
的主要指标 ． 超氧化物歧 化酶 （ Ｏ 与过 氧化氢 酶 （ Ａ ） Ｓ Ｄ） Ｃ Ｔ 和过 氧 化物 酶 （ Ｏ 相 互 协调 ， Ｐ Ｄ） 使细 胞 内 自由
基维持 在较低 的动态平衡 状态 ， 机体最 重要 的抗 氧化 防御 酶类 ¨ 本研 究 利用 哈维 氏弧菌 悬液 以 注射方 是 引．
马 骞， 洪婧妮 Biblioteka 蒋秋芬 ， 苏永全 ， 王 军
（ 厦门大学海洋与环境学院 ， 福建 厦 门 ３ １０ ） ６ ０５
摘要： 以哈 维氏弧 茵（ ｉ ｉ ｈ ｒ ｙ ） Ｖ ｒ ａｖ ｉ对条 纹斑竹 鲨（ ｈ ｏｃｌｕ ｌ ｉ ｕ 进 行病原 接种 试验 ， ｂｏ ｅ Ｃ ｉｓ ｌ ｍｐａ ｏ ｍ） ｌ ｙｉ ｇｓ 分别
哈维 氏弧 菌（ ｉｉ ｈｒ ｙ） Ｖｂｏ ａｖ ｉ是一 种革兰 氏 阴性 、 光 的 海洋 细 菌 ， 泛分 布 于 海洋 环 境 中 ， ｒ ｅ 发 广 是水 产 养殖 动物 的重要 致病菌 Ｊ鲨鱼弧 菌 （ ｃｒ ａ ａ ） 从 死亡 棕 色 鲨鱼 （ ａｃａｈｎｓ ｌｍ ｅｓ 中分 离 出来 的海 ． ａｃ ｎ ｅ 是 ｈ Ｃ ｒ ｒｉｕ ｕ ｂｕ） ｈ ｐ 洋 弧菌 ， 于 １８ 并 ９５年确定 种名 Ｊ且 鲨鱼弧菌对 多棘角 鲨鱼 （ｑａｕ ｃｎｈａ） ， Ｓｕｌｓ ａｔｉ 也有致 病性 ＿． ａ ｓ ２ 近年来 ， Ｊ 研
式接种于健康条纹斑竹鲨， 通过检测病原接种后条纹斑竹鲨不同组织在不同时间的酸性磷酸酶（ Ｃ ）碱性 ＡＰ、
磷酸酶 （ Ｋ ） 超氧化 物歧化酶 （ Ｏ 及 血清溶 菌酶 （ Ｓ ） Ａ Ｐ、 Ｓ Ｄ） Ｌ Ｚ 的活力 变化 ， 以期 了解 病原弧 菌感 染对 条纹斑 竹 鲨免疫功 能 的影 响 ， 并通过探 讨这 ４种酶 的免疫 防御作 用 ， 为条纹斑竹 鲨免疫 功能 的基 础研究 提供参考 资料
水产动物哈氏弧菌病及其防治方法
二、病原学意义
哈氏弧菌对水产养殖动物尤其是对虾的危害严重， 有记述， 该菌曾引起澳大 利亚、印度、印度尼西亚、泰国、菲律宾及我国台湾对虾育苗场斑节对虾幼体的 大量死亡；Saeoni 等(1987) 报道，该菌也可引起墨吉对虾幼体的大量死亡；在 我国， 李军等(1998)报道在山东丰城地区部分对虾育苗场发生由该菌引起的大规 模暴发性传染病，主要感染中国对虾幼体、尤其是蚤状幼体，死亡率高达 80％ 以上。 被感染的幼体表现为活力减弱，缺乏食欲，身体不透明旱混浊状，刚毛缺少 且弯曲， 沉于池底； 林克冰等(1999)报道哈氏弧菌也是网箱养殖大黄鱼危害严重 的病原之一。病鱼一般前期症状不明显，中后期主要症状是鱼体发白，体侧鳞片 脱落，脱落处表皮充血，逐渐溃烂，而后下颔、眼球、腹部及各鳍基发红，鳍条 散裂，病鱼缓慢浮游于网箱边缘水面，严重者两侧体表大片溃烂直至肌肉，肝、 肾充血肿大，胆囊褪色，胃幽门肿大，停止摄食，逐渐死亡。吴后波等(1997) 报道哈氏弧菌引起海水网箱养殖高体鰤的严重感染发病， 病鱼的主要症状为鱼体 发黄、发瘦弯曲成弓形，并在水中不停旋转，体表有大小不一的溃烂面，溃烂部 何脱鳞、充血、水肿，肠壁充血发炎，有黏液样物从肛门流出，此病春、夏季易 于流行，严重发病时死亡率可达 90％以上；于保坤等(2002)报告在山东青岛胶 南小口子网箱养鱼场养殖的花鲈幼鱼因该菌感染引起大量死亡，病鱼体表发白、 游动迟缓、厌食、尾部严重溃烂，有的尾鳍完全烂掉；陈献稿等(2004)报道该菌 引起广东省阳江市东平镇海水养殖斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)发生溃 疡病(发病率 80％)，症状为体表溃疡，无力侧卧于网箱底部，下颌充血。
2005 年 2 月，笔者对河北秦皇岛某海洋公园相继死亡的 2 尾观赏用长鳍真 鲨进行了检查，从病死长鳍真鲨病变血液、肝脏、脾脏、肾脏和性腺组织中检出 哈氏弧菌，所检 2 尾长鳍真鲨其中 1 尾表现为鳍基部溃烂出血、鳞片脱落，脱 鳞处表面暴露肌肉呈红色，但质地正常(未腐烂)；剖检见肝脏肿胀、质地糜烂， 多处存在大量灰黄色、圆形或椭圆形、直径为 2～8 毫米或 2 毫米×4 毫米或 4 毫米×8 毫米大小不等的病灶(内部质地呈泥状)；脾脏肿胀，存在大量同肝脏上 的坏死灶(呈直径 1～2 毫米的圆形或 1 毫米×2 毫米大小的椭圆形)；生殖腺肿 胀且严重出血，有少量同肝脏上的病灶(直径 2 毫米左右的圆形或 2 毫米×3 毫 米大小的椭圆形)；胸腔有血样积液(淡红色、较透明)，胃内无食物，小肠内黏 膜出血呈鲜红色，肾脏变化不明显。另 1 尾表现为尾鳍基部溃烂、出血、有裂口 (长 2 ～6 厘米)， 尾鳍基部向头部处(长度 25 厘米左右)有大血积鳞片脱落(接近 整个周围)并有溃烂出血现象， 臀鳍基部溃烂并有长 10～12 厘米的裂口； 剖检见 肝脏肿胀、土黄色、无明显病灶，脾脏肿胀、有直径 1～2 毫米的灰黄色病灶， 性腺严重出血、肿胀，胸腔积水(淡黄色透叫液并有少量絮状物)，胃内有少量食 物。
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（．中 国海 洋 大 学 ，海 洋生 物 遗 传 学 与基 因资 源 利 用教 育 部 重 点 实验 室 ，青 岛 ２ ６ ０ ； １ ６ ０３ ２ ．山东 出入 境检 验 检 疫 局 ， 岛 ２ ６０ ） 青 ６ ０ ２
弧 菌 的胞外 蛋 白酶 、磷酯酶 、溶 血素 等 与致病 性密 切相 关， ｈ ｎ ， ｔ １ Ｚ ａｇ ｅ ａ． 同来 源 的哈维 氏弧菌 致病 对不
性 及其 胞外 产物 毒性 进行 研究 ，发 现致 病性 强 的 菌
自由基 防御体 系 ｌ 钔 ３ ，包括酶 和非酶 抗氧化 系统 ，酶 ，
ＡＣ Ａ ＨＹＤＲ Ｔ ＯＢＩ ＯＧＩ Ｉ ＣＡ ＯＬ ＣＡ ＳＮＩ
Ｖｏ１ ．３６．Ｎ Ｏ． ２ Ｍ ａｒ ， ２ ０ １２ ．
ＤＯＩ １ ． ７ ４ Ｓ ．． ０ ５ ２ １ ． ０ １ ： ０３ ２ ／ ＰＪ１ ３ ．０ ２０ ２ ２
哈维 氏弧菌铁超 氧化物歧 化酶基 因表达及 免疫作 用研究
摘 要：哈维 氏弧菌 （ ｒｏ ｈ ｒｅ ｉ Ｈｂｉ ａｖｙ） 是鱼虾 等海水 动物 的重要 病原菌 。超 氧化物歧 化酶 （ｕ ｅｏ ｉｅ ｄｓ ｔｓ） Ｓ ｐ ｒｘｄ ｉ ａｅ ｍｕ 通过 催化超 氧 阴离子 自由基 （ 形 成 Ｏ２ Ｈ２ ２ Ｏ） 和 Ｏ ，以保 持细胞 自由基产 生和 清除之 间的平衡 ，在病 原菌适 应 环境 及细菌 致病 性方面 发挥重 要作用 。用 Ｐ Ｒ从哈 维氏弧菌 基 因组 扩增得 到 ６ ０ｂ Ｃ ０ ｐ的 目的片段 ，序列分 析 表 明与弧 菌 Ｆ ．ＯＤ的序 列相似性 为 ９ ％一 ９ ％。 目的基 因片段克 隆到原核 表达 载体进 行表达 。 ＤＳＰ ｅＳ １ ９ 将 Ｓ ．ＡＧＥ 电泳 分析显 示纯 化 的蛋 白为单 一条 带，分 子量 为 ２ Ｄ。 ７ ｋ 具有 典型 的 Ｆ ． Ｏ 吸收光谱 ，对氯 仿． ｅＳ Ｄ 乙醇和 Ｈ Ｏ ２２
收 稿 日期 ：２ １－ １２ ；修 订 日期 ： ０Ｉ．Ｉ２ ０ １０ —７ ２ １Ｉ一９ 基 金项 目：国家 自然科 学基 金项 目（０ ７ ２ ５ ；国家 ８ ３计 划 项 目（ ｏ ７ Ａ ９ ４ ６；中国海 洋大 学“ ３９ ２７） ６ ２ ０Ａ ０ｚ １） 国家大学 生创 新性 实 验计
维 氏弧 菌进行 人工感染 试验 ， 大菱鲆 的免疫保 护率 为 ８． ％。Ｗｅｔ ｎ ｌ 可 以检测 到免疫 大菱鲆 的血 清 对 ００ ０ ｓｒｂ ｔ ｅ ｏ
中 的特 异抗体 。 关键 词：哈维 氏弧菌；超 氧化物歧化 酶；基 因；表达；性 质；免疫 原性
中图分类号 ： ８ Ｑ７ ６ 文献标 识码： Ａ 文 章编 号： ０ ０３ ０ （０ ２０ —２ ２０ １ ０ －２ ７２ １ ）２０ １ ．８
泌系统 、铁载体 、 多糖的产生，与致病性密切相关 Ｉ】 】。 但 哈 维 氏弧 菌 的致 病机 理 尚未完 全清楚 。本 文从 哈
维 氏弧菌 基 因组 Ｄ ＮＡ克 隆 Ｆ — Ｏ ｅＳ Ｄ基 因，构建原 核
铜绿 假单 胞菌 （ｓｕ ｏ ｏ ａ ｅｕ ｉｏａＦ ．Ｏ 突 Ｐ ｅｄｍ ｎｓａｒｇｎｓ）ｅＳ Ｄ
株 溶血 性和 其他 胞外 产 物毒性 都很 强 ，部 分强 致病
性 哈维 氏弧菌 中有两个 溶血 素编码 基 因［１ １ 。哈维 氏 ０ 弧 菌 的密度感 应 系统可 以调控 细 菌 的发 光 、Ｉ 型 分 Ｉ Ｉ
清除 ０ 一 从而保持 Ｒ Ｓ产 生和清 除之 间的平衡， ， Ｏ 在 微生 物适应 环境及细菌致病性方 面发挥重要作用『。 ６ 】
微 生物在 紫外 辐射 、温度 变化 、渗 透压 改变 、 氧 化等 环境应 激过 程 中常常 遇到环 境 中较多超 氧 阴 离 子 自由基（ 、过氧 化氢（ ２ ２、羟 自由基（ Ｈ・ ０） Ｈ Ｏ） Ｏ ）
变 株 在有 氧环 境 中生长 缓慢 ，对 百草 枯 的抵抗 力 降
低 ，绿 脓菌 素生 产 能力 降低 【；新 生 隐球 菌（ ｒｐｏ １ Ｃｙ ｔ— Ｃ ＣＨ ｅ ｏｍ ｎ） Ｏ ＯＣＳ ｏ ｒ ａ ｓＳ Ｄ基 因突变株荧 光 素酶 、 酶 ｎｆ 尿 和磷脂 酶活力 明显 降低 。 】
划” 目（９ ０ ２ ２ ） 农业 部公益 性行业专 项（ｙ ｙ ｘ０ —４ ） 项 ０ １４３４； ｎ ｈ ｚ ７０ ６资助 作 者简介 ：辛瑞 晓（９ ５ ） 女，青海人 ； 士研究 生；主要从事 海洋微 生物分 子生物学 研究 。Ｅｍａ ： ｉ ｕｘ ｏ ２ ． ｒ １８一 ， 硕 － ｉ ｘ ｒ ｉ ａ ＠１６ｃ ｎ ｌ ｎ ｉ ｏ 通 讯作者 ：陈吉 祥， 授； Ｅ ｍ ｉ ｂ ｔ ｎ Ｕ ． ｕｃ 教 — ａ ： ｅｃ ＠Ｏ Ｃ ｄ ． ｌ ｅ ｅ ｎ
哈维 氏弧 菌是 一 种革 兰 氏阴性 海洋 细 菌，是海 水养 殖鱼 类 和对虾 的条件性 致 病菌 ｌ。 已知 哈 维 氏 ９ ］
等 的损 害 ，在应 激状 态下 细胞 自身代谢 产 生 的 自由
基 增 加 ［，较 多 的 自由基 引 起 细胞 毒 性 作 用 ，如 细 １ 】
胞 膜损 坏 、蛋 白质 变性 、酶 失活 、Ｄ ＮＡ链 断裂 、染 色体 畸变 等 【。生 物在 进化 过程 中形 成 了有效 的抗 ２ 】
蛋白浓度的测定采用免疫周后用致病性哈维氏弧菌进行人法以牛血清白蛋白作为标准蛋白感染实验实验组对照组和对照组分别用表达的吸收光谱测定哈维氏弧菌腹腔注射感染记取纯化的超氧化物歧化酶液进行紫外和可见光录攻毒后两周内各组别每日的发病和死亡情况根扫描对照为
第３卷 第２ ６ 期
２ 年 ３月 ０１ ２
水 生 生 物 学 报
抗氧 化 系统 包括 超 氧化 物 歧化 酶（ Ｏ ） Ｓ Ｄ 、谷胱 甘 肽
过氧化 物酶（ Ｈ．ｘ、过氧化 氢酶（Ａ ） 【。超 氧 ＧＳ Ｐ ） Ｃ Ｔ等 ５ ］
化 物 歧 化 酶 （ｕ ｅｏ ｉｅ ｉ ｔｓ，简 称 Ｓ Ｄ， Ｓ ｐｒｘｄ ｄｓ ａｅ ｍｕ Ｏ
Ｅ １１．．）通过催 化超 氧 阴离 子形成 Ｏ Ｃ． ５１ ． １ ２和 Ｈ Ｏ ２２
敏感 ， 明纯化 的蛋 白属 于 Ｆ ．Ｏ 。用邻 苯三酚 自氧化法 测得 酶的最适 ｐ ， 适温 度 ２ ￣ 表 ｅ Ｄ Ｓ Ｈ７ 最 ０ Ｃ。该 酶在 ｐ Ｈ
６ —８的范 围内稳定 ，当温度 超过 ４ ￣ ０Ｃ时酶 的活 力迅速ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ丧失 。纯化 的重组 蛋 白免疫大菱 鲆， ４周后 用致 病性 哈