超氧化物歧化酶的研究
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
超氧化物歧化酶资料
超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。
SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。
1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
SOD（超氧化物歧化酶）是国际上公认的具有人体垃圾“清道夫”、“抗衰王”、“美容骄子”之称，是对抗“百病之源”活性氧自由基最有力的物质，是近半个世纪以来社会科学界、医学界、生物界最举世瞩目的价值发现，它的研究与发展代表着生物医药的高科技技术发展的前沿，在科技成果及学术领域占据重要的国际地位。
SOD（超氧化物歧化酶）被国家列入生物医药“国家十一五规划”重点项目。
2011年是“国家十二五规划”的第一年，SOD行业将再次跻身国家当前优先发展的高科技产业化项目，标志着中国健康产业链SOD新兴行业的崛起, 使全人类迈入健康经济时代。
利用超氧化物歧化酶（SOD）产业化建设，一方面可架构生物医药、保健食品、日用美容化妆品、化工化学、农业五大版块经济支柱的绿色产业链循环经济圈发展。
另一方面打造SOD科技应用成果转化的孵化器平台引领生化医药美容化妆品食品等行业的新型健康原料的应用，有利于促进再生资源利用，产生巨大的社会效益和经济效益。
一、反应机理超氧化物岐化酶,它催化如下的反应：2O2-+2H+→H2O2+O2O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。
它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。
SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。
尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。
超氧化物歧化酶(SOD)及其研究进展
其 结 合金 属 种 类 不 同 ， 分 为三 类 ： 一 类 为 Ｃ Ｚ 可 第 ｕｎ Ｓ Ｄ， 蓝 绿 色 ， 对 分 子量 约为 ３ ｋ ａ 主 要 存 Ｏ 呈 相 ２Ｄ ， 在 于 真核 细胞 细胞 浆 、 叶绿体 和过 氧化 物酶 体 内 ； 第 二 类 为 Ｍｎ— Ｓ Ｄ， 紫 红 色 ， 对 分 子 量 约 为 Ｏ 呈 相 ４ｋ ， ０ Ｄａ 主要存 在 予 真核 细 胞 线粒 体和 原 核 细胞 中 ； 第 三类 为 Ｆ —Ｓ ｅ ＯＤ， 呈黄 褐 色 ， 对 分子 量约 为 ３． 相 ８ ７ Ｄ ， 要存 在于 原核 细胞 及一 些植 物 中［ 。 ｋ ａ主 ３ ］ ３ Ｓ ＯＤ的 结构 与催 化机 理
—
不 同来 源 的 Ｍｎ ＯＤ 一 级 结 构 同 一 性 很 高 ， —Ｓ 并 且参与 形成 活性 中 心及与 金属 连接 的氨 基酸 在 所 有 Ｍｎ Ｓ － ＯＤ中 都是保 守 的［。Ｍｎ ＯＤ 是 由 ２ ３ ５ ］ —Ｓ ０ 个氨 基酸 残基 构成 的 四面体 ［ ， １ 结构 简 单 ， 个 亚基 ］ 每 只含一个 金属 离子 ［ ， （ 处于 三 角双 锥配 位 环 ５ Ｍｎ Ⅲ） ］ 境 中 ， 中一轴 向配 体为 水分 子 ， 其 另一 轴 向配体 为蛋 白质辅基 的配 位基 Ｈｉ一２ ， ｓ ８ 另三 个来 自蛋 白质 辅基 的 配基 Ｈｉ－ ８ 、 ｓ １ ０和 Ａｓ ｓ ３ Ｈｉ～ ７ ｐ一１ ６位 于赤 道平 ６
Ｓ ＯＤ 的发现 、 类、 分 结构 、 催化 机 理及研 究进展 ， 并对 其应 用 前景进 行 了展 望 。 关键 词 ： 氧化物 歧化 酶 ； 超 活性 氧 ；ＯＤ Ｓ
中图 分 类号 ： ５ Ｑ５
文献 标 识码 ： Ａ
文章编 号 ：０ ６ ７ ８ （０ ０ １ 一 ｏ １ — ０ １０－ ９１２ １ ）６ ０４ ２
超氧化物歧化酶
超氧化物歧化酶，分子结构：NH2;SCH2 CHCOOHSCH2 CHCOOHNH2 ，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。
SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。
1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。
超氧化物岐化酶的催化如下的反应：2O2-+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。
它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。
SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。
尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。
这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。
过氧化物游离基可造成机体的损害，本品由哺乳动物的红细胞、肝和组织中分离提取的一种肽链大分子的金属酶，能促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧，从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基，而有强大的抗炎作用。
临床用于类风湿关节炎、骨关节病、放射性膀胱炎。
可以清除体内过量的自由基，提高人体免疫力，延缓衰老；抗疲劳，调节女性生理周期，推迟更年期。
应用( 1) 治疗自身免疫性疾病。
各种自身免疫性疾病的发病机制虽有不同, 但O2- 前列腺素及由巨噬细胞、单核细胞、中性白细胞产生出来的水解酶类在引起病变上都起了重要作用。
动物实验已证实SOD 和其他氧自由基清除剂能抑制自身免疫性疾病的慢性发病过程。
应用SOD 治疗红斑狼疮和类风湿性关节炎均有很好的效果。
( 2) 治疗某些心血管疾病。
水生生物超氧化物岐化酶的研究进展
水 生 生物 超氧 化 物 岐 化酶 的研 究进 展
张立颖 ， 赵 萌 ， 王跃智
（ 北京市水产科学研究所 ， 北京 １０６ ） ０ ０ ８ 摘要 ： 超氧化物歧化酶是生物体内一种重要的抗氧化酶 ， 具有清 除生物体 内超氧 阴离子 自由基 的作用 ， 可有效 地抗 御氧 自由基对有机体 的伤害 。概述水生生物 （ 如鱼 、 、 、 ） Ｏ 虾 贝 藻 Ｓ Ｄ的种类 、 分布 、 构特征 、 结 理化性 质及 基因克隆表达的研 究进 展 ， 并对其应用前景进行展望。 关键词 ： 水生生物 ； 超氧化物歧化酶 ； 超氧阴离 子 自由基 中圈分类号 ：９ ７ ￥ １ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：００—２ ８ （ ０２ ０ １０ ２ ６ ２ １ ）４—００ ０ ８０— ５
江西农 业大 学学报
２ １ ，４ ４ ：０ ８ ４ ０ ２ ３ （ ） ８ ０— ０
ｈｔ ：／ ｕ ｂ ｏｊａ ． ｄ ．ｎ ｔ ／ ｘ ｅａ ． ｕ ｅ ｕ ｃ ｐ ｘ
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
超氧化物歧化酶的活性测定
超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(O2-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2-)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
[原理]SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。
其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2 -，利用SOD分解而间接推算酶活力。
在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。
其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。
化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD，但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。
超氧化物岐化酶
超氧化物岐化酶
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）是一种重要的抗氧化酶，它可以将活性氧代谢成氧和氢氧化物，从而起到降低免疫系统细胞受损的作用，并因此成为广泛研究的热点领域。
超氧化物歧化酶具有多种形式，其中最常见的类型包括CU/Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD。
CU/Zn-SOD 以细胞质及细胞膜中的超氧化物物种（O2-）为底物，执行将O2- 分解为H2O2 的反应，Mn-SOD 则以线粒体超氧化物物种（O2•-）为底物，进行将O2•- 分解为
O2- 及H2O2 的反应，而在Fe-SOD 中，则直接以O2- 为底物，将O2- 分解为H2O2。
SOD 具有多方面的功效，它不仅有能够减缓细胞老化的作用，也能够增强免疫细胞的功能，而且还具有调节细胞代谢的作用。
此外，SOD 还能够减少受损细胞的数量，从而有益于细胞的恢复及修复，能够防止细胞的过度分解，从而有效阻止细胞破坏及老化。
SOD 能够帮助减弱细胞和细胞膜与环境的氧自由基氧化反应，可以能够维持细胞膜脂质的可塑性和稳定性，从而减少细胞与外界的氧自由基氧化冲击，并能够在合理的抑制氧自由基的氧化反应的基础上，维持正常的代谢水平。
此外，SOD 还可以维护细胞环境的稳定性，从而能够延缓老化的过程，使细胞保持健康状态，并且能够延缓某些老化相关疾病的发生，增强对各种炎症性及感染性疾病的免疫功能，例如癌症，心脏病等。
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超氧化物歧化酶的研究班级：生物班姓名：胡金金学号：11摘要:超氧化物歧化酶是生物体内清除超氧阴离子自由基的一种重要酶,具有重要的生理功能,在医药、食品、化妆品中有广泛的应用前景。
现从分类、分布、结构、理化性质、催化机理、分离提取工艺、应用前景等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。
关键词：超氧化物歧化酶、理化性质、生物学功能、提取工艺、应用前景到现在为止,人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到SOD。
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD),是一类广泛存在于生物体内的金属酶,能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,平衡机体内的氧自由基,己成为化学及生物化学热门的研究课题。
作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂,SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。
目前,世界各地学者对SOD的研究方兴未艾,深入研究SOD不仅有着大的理论意义,也有着重大的实际应用价值。
1超氧化物歧化酶的结构和理化性质1.1 超氧化物歧化酶的结构超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族:CuZn-SOD为第一族,Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。
天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。
CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族,是人们对于SOD结构研究的突破口,也是人们了解最多的一种SOD。
比较不同来源的CuZn-SOD的氨基酸序列可以发现,它们的同源性都很高。
有些氨基酸还很保守,在所有序列中都不变,这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。
如图1牛红细胞CuZn-SOD的结构所示:每个铜原子除分别与4个组氨基酸残基(His441461611118)的咪唑氮配位外,还与一轴向水分子形成远距离的第五配位,Zn则与3个组氨酸残基(His61169178)和1个天冬氨酸(D81)配位。
Cu、Zn共同连接组氨酸61组成/咪唑桥0结构。
图1 牛红细胞CuZn-SOD的结构示意图图1 牛红细胞CuZn-SOD的结构示意图[1]]Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族,Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,Mn(Ó)是处于三角双锥配位环境中,其中一轴向配位为水分子,另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据,另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。
Fe-SOD的活性中心是由3个His,1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。
1.2超氧化物歧化酶的理化性质SOD 的等电点偏酸性, 为酸性蛋白SOD 对热、pH 值和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。
三种 SOD 的主要理化性质见下表[2]。
2超氧化物歧化酶生物学功能2.1 超氧化物歧化酶与胁迫生存环境的变化是不可避免的,任何生物必须去适应各种变化.以植物为例,经研究发现,不同条件、不同物种、不同的发育时期及不同器官发生胁迫后,SOD活性表现有升有降。
然而SOD活性不论是升高还是降低,都表现出抗性强的品种比抗性弱的品种活性高.即当SOD活性降低时,抗性强的品种下降幅度小;而当SOD活性升高时,抗性强的品种升高幅度大;或者抗逆性强的品种活性升高而抗逆性弱的品种降低。
这说明在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。
SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基O厂,作用机理是:之后H2O2:被抗坏血酸和过氧化氮酶(前者是主要的)分解为H2O和O2,从而解除O2-所造成的氧化胁迫[3]。
2.2.1超氧化物歧化酶的活性测定SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。
直接测定法的原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。
常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。
直接法需专用的仪器,故此类方法一般实验室较难应用。
间接测定法是通过某种能产生O-2的系统,使O-2进行另一个便于检测的反应,测定特征波长下的光吸收变化速率,计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。
常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。
2.2.2 超氧化物歧化酶活性的影响SOD的催化活性主要与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、/咪唑桥0的变化有关。
SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对SOD的催化活性具有极其重要的意义。
这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物O-2,进入活性中心,并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。
如这两个氨基酸残基被破坏或修饰,SOD将会失活。
SOD中心金属离子的作用也不相同。
对于CuPZn-SOD,Zn(Ò)的作用一是调节咪唑基与Cu的相互作用,二是稳定活性中心的结构。
若除去酶分子中Zn(Ò)而保留原有环境中时Cu(Ò),SOD仍有相当高的活性。
Cu(Ò)与酶催化作用有关,起着传递电子的作用。
若除去Cu(Ò),则SOD将会失活,重新加入Cu(Ò)后SOD的酶活性恢复。
另一方面,Cu(Ò)所处的环境对活性有重要影响。
若以其它金属离子代替Cu(Ò),同时用Cu(Ò)代替Zn(Ò),则酶失去全部活性。
另外,只有结合态的Cu(Ò)才直接与活性有关,但在一定浓度范围内,增加游离的Cu(Ò)的浓度可显著提高SOD活性[4]。
对/咪唑桥0配合物进行催化的研究表明,在催化过程中,/咪唑桥0在与铜相连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化[5],对酶的催化活性有重要影响。
3超氧化物歧化酶的提取3.1超声波超氧化物歧化酶提取流程取新鲜蒜瓣，去皮洗净，用匀浆机匀浆 1.5min，分别分成 6 组、8组，每组 30g，取 6 组分别用200～450W功率超声波破碎 4min，另取 8 组按上述确定的功率破碎0～7.0min，在每组蒜汁中加入 1.5 倍体积 0.05MpH7.8 的磷酸缓冲液，浸提 8h（4℃），离心得浸提液，测定浸提液中的总蛋白含量及总酶活性，取三次的平均值。
超声波提取超氧化物歧化酶是目前最常用效率高的提取方法[6]。
3.2纯化工艺方法[7]3.2.1 热变性法热变性法是提取工艺中一种较为廉价的方法, 可以降低生产成本, 并且简单易行。
热变性法不引入其他杂质, 对提取工艺非常有利。
SOD 是一种热稳定性较好的酶, 并且大部分杂蛋白在 55 ℃时就可变性, 因此可以利用 SOD 和杂蛋白变性温度的差异来实现初步分离。
3.2.2丙酮分级沉淀法向蛋白质溶液中加入有机溶剂丙酮, 水的活度降低。
随着有机溶剂浓度的增大, 水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低, 溶液的介电常数下降, 蛋白质分子间的静电引力增大, 发生沉淀。
有机溶剂密度较低,易于沉淀分离; 与盐析法相比, 沉淀产品不需脱盐处理。
但该法容易引起蛋白质变性, 必须低温下进行。
3.2.3 硫酸铵盐析法硫酸铵是常用的盐析盐。
因为其价格便宜, 操作简单, 安全( 溶解度大且受温度影响小, 具有稳定蛋白质的作用) , 且可较好的保持 SOD 的活性, 它常被用在蛋白质初级纯化和浓缩。
3.2.4 层析法层析是获得 SOD 精品的重要一步, 对 SOD 比活力有很大提高, 在经过沉淀分级后常采用层析方法纯化 SOD 提取液, 目前国内外对层析的多步组合纯化研究较活跃。
4 超氧化物歧化酶的模拟研究与天然SOD相比,SOD的模拟物有着更显著的优点。
首先是获取和制备比天然SOD要简单得多。
天然SOD要从人或其它生物中提取,这就决定了天然SOD的提取必然困难重重,而且产量不高。
而模拟SOD 可以用化学方法来人工合成,其物质和能量消耗低,且产量不会受到限制。
其次,天然SOD作为一种生物大分子,在进入体内时存在着诸如进入细胞能力弱、细胞渗透性差、在血中半衰期短(在人体中SOD只是在很短时间内稳定,其半衰期为分钟级)、不能口服、价格昂贵等缺点。
另外,对于非人体SOD还存在着造成免疫损伤的可能。
所以人们把目光投向了SOD模拟物,尤其是低分子量模拟物上。
目前,生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD,期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床。
其中研究最多的含铜络合物是3,5-二异丙基水杨酸铜[Cu(3,5-DIPS),这是一种低分子量的亲脂性络合物,具有天然CuZn-SOD样活性,可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病。
合成的铁(Ò)-酪氨酸模拟SOD金属酶,分子量比天然酶小得多,与天然SOD活性差距较小,且毒性小,从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作。
但是由于超氧化物歧化酶的模拟属于新型交叉学科,需要化学和生物学知识乃至技术的高度结合,目前的模拟还没有走向成熟,相信随着21世纪化学生物学的崛起,这一新兴交叉学科将会对化学、生物学及医学产生深远的影响[1]。
5超氧化物歧化酶的应用5.1 SOD在医药上的应用[8]SOD的药用研究,国内外主要用于治疗因超氧阴离子伤害引起的疾病如心肌缺血与缺血再灌注综合症、类风湿关节炎、红斑狼疮等。
5.1.1治疗心肌缺血与缺血再灌注综合症心肌缺血与缺血再灌注损伤是当今十分活跃的研究领域,它揭示了过去某些临床难以解释的疾病矛盾,例如在冠状动脉的搭桥手术、溶栓术、变异型心绞痛及冠状动脉痉挛缓解再时导致的病情恶化等均与O2-存在密切相关。
实验证明,心肌缺血再灌注损伤过程O2-产生增加[9],O2-通过膜的脂质氧化损伤心肌细胞内线粒体膜、内质网膜和溶酶体膜,从而破坏了机体的正常代谢。
如果在这个时候注射适量的SOD便可有效防治/综合症0出现。
SOD除应用于心脏和小肠动脉缺血再灌注外,也可应用于肝、肾、心脏等器官的保存和移植,断肢再植,整形美容等手术过程。
5.1.2治疗炎症炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应。
吞噬细胞在炎症反应中起着重要作用,它们在吞噬过程或受剌激产生呼吸爆发,消耗氧气,释放大量活性氧自由基,如O2-和羟基自由基(#OH),从而直接毒害真核细胞,损伤内皮细胞,红细胞,成纤维细胞,血小板和精子,白细胞本身也能被它自己产生的氧自由基损伤。