骨组织大面积石蜡切片制作技术
石蜡切片技术原理
固定的目的和作用在于： ①防止组织自溶和腐败； ②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀 保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保 持与生活时相近似的形态和结构； ③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产 生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在 生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且 有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)， 从而使细胞各部易于染色； ④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不 易变形，有利于操作。
若是一般的组织学制片，要求不太严格的话 则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。 蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死， 即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺 鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒， 或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气， 使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。
上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉 球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸 入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯 作静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用 1 g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。 昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气 的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投 入含氰化钾的毒瓶中。
1.2 铺片法
主要用于动、植物组织的表皮层观察，可 活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一 层表皮，迅速平铺在载玻片上。 如: 洋葱表 皮细胞的铺片制备。 1.3 压片法 一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片 上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖 上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成 一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体 ，花粉粒观察发育阶段等。
2.1 取材 根据不同的实验目的，选择相应的材料， 材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、 挫伤、干枯。 所采集材料应立即放入固定剂，并编号， 注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取 组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考 虑固定剂的穿透能力。
石蜡切片制作
• 2．冲洗
数量
• 切片机（带切片刀一把） 1台
• 溶蜡箱（数控）
1台
• 展片台（数控）或水浴锅 1台
• 染色缸（立式或卧式） 30个
• 酒精灯
6个
• 树胶瓶 1个
• 切片盘 6个
• 硬纸板 若干
• 单面刀片 6盒
• 标本瓶（30ml） 6个
• 载玻片 2盒
• 盖玻片 1盒
•
•
• 洗瓶
6个
• 抹布
6块
• 纱布
6块
• 毛笔
1支
• 记号笔
1个
• 无水乙醇
3瓶
• 95％乙醇
5瓶
• 二甲苯
3瓶
• 苏木精
1瓶
• 伊红
1瓶
• 甲醛 1瓶
• 石蜡（52～54、56～58、60～ 62） 3盒、3盒、3盒
三、实验内容与步骤
• 1．取材及固定 • 取动物体上的小块组织成为组织块。组织块的大
小以不超过0.5立方厘米为宜。切去组织块时动作 要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生 变化。 • 组织块取下后，先用先用0.9％的生理盐水漂洗以 洗掉血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔 中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生 理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀 或其他器具刮之。
取材－ 固定－ 脱水－ 包埋－ 切片－ 染色－ 封片
实验原理
• 首先固定液固定组织会渗透整个组织，然 后脱水过程中，梯度酒精进入组织置换固 定液，然后二甲苯（或TO，透明剂）置换 酒精，最后透蜡，石蜡进入组织置换二甲 苯，因为石蜡和酒精不溶，所以需要二甲 苯作为媒介来用。
石蜡切片具体过程及操作步骤精心整理
石蜡切片具体过程及操作步骤固定：组织块大小：1.5×1.5×0.2 CM固定液>4倍组织体积福尔马林固定市售为40%甲醛水溶液，应放入小量碳酸钠放置一段时间福尔马林固定液：40%甲醛溶液1份，水9份固定数小时后用水洗24小时优点：克服了乙醇固定的缺点脱水（组织块）70%乙醇片刻80%乙醇2-4小时95%乙醇2-4小时95%乙醇2-4小时100%乙醇2-4小时100%乙醇2-4小时注：为保证100%乙醇无水，可在容器中放入无水硫酸铜吸收水分，变蓝后更换。
最好能将100%乙醇中取出来的组织浸入香柏油后再经二甲苯后浸石蜡。
透明（组织块）100%乙醇：二甲苯（1：1）15分钟二甲苯15分钟二甲苯15分钟注意：时间太长变脆浸蜡（组织块）石蜡熔点52—56℃温箱：56℃二甲苯：石蜡（1：1）1-2小时石蜡1-2小时石蜡1-2小时包埋将熔化了的石蜡倾入包埋框内，随即迅速将组织块用加温了的镊子送置于框内，平置底面。
注意组织切面，放入冷水，冷固后将蜡块修齐，固定于木块上。
石蜡切片切片机：调整好。
刀：磨刀时一个方向，液体石蜡。
切下的片子，右手用弯镊子轻轻钳牢石蜡切片，左手用干燥毛笔将切片取下，放入盛温水（约30℃）的玻璃皿内，将切片摊于温水面上，光亮的切面向下，用弯镊子细心张开皱纹。
然后将水温加到40℃，使切片更平均地展开于水面上，再用弯镊子细心分开各蜡片，将涂过少许蛋白甘油的载玻片沉至切片下面，然后将切片从水面取出。
最后将切片置于56℃保温箱内烘干，需时2小时。
刀的倾角：20—30°冬天石蜡52-54℃，夏天56-58℃HE染色法石蜡切片Ⅰ二甲苯2-5分钟（冬季56℃温箱）Ⅱ二甲苯2-5分钟（冬季56℃温箱）100%乙醇1min95%乙醇1min80%乙醇1min70%乙醇1min先用自来水而后用蒸馏水洗0.5minHarris氏苏木紫液5min。
苏木紫为盐基性染料可染细胞核。
石蜡制片技术
（六）烘干
将烫好的片子自然烘干，或 45℃烤片箱干燥1~2天，注意 防尘。
（七）脱蜡、染色、脱水、 透明
将玻片标本放于100%X（15-30min)→100%X(12min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(12min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红 （85%A配制）(2-4h)→85%A(3-5s）→95%A(3-5s） →固绿（100%A配制）(30s)→95%A(12min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min） →50%X+50%A(1-2min)→100%X(12min)→100%X(1-2min) 注意番红染色时间要长些（至少3h以上），随后的两 次经过酒精的时间都应很短，以免洗掉染上的番红， 固绿的染色时间大约在20-30s,其他各步的时间大约1 至2分钟，均要视具体情况而定。
（二）固定和抽气
（一）将切取的植物材料放入固定液中， 使其细胞原生质在极短的时间内停止生命活 动，尽量保持细胞原有的细微结构，也可使 某些柔软的材料适当硬化，便于切片。材料 的长和宽最大不超过1cm。固定液为材料的 20倍左右。固定时间24小时，其间要放入抽 真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固 定液下面。并用铅笔写好标签。
五、石蜡制片的操作流程
（一） 取材 （二）固定和抽气 （三）脱水、透明及渗蜡 （四） 包埋 （五）修块 、切片和烫片 （六）烘干 （七）脱蜡、染色、脱水、透明 （八）封片
（一）取材
选取经过自己设计实验的对照和处理 的材料，根据不同的要求，从植物体上 选取有代表性的器官或组织，取材力求 新鲜，以避免组织发生死后变化。取材 时要用快刀切割材料，不能挤压，所取 的材料不宜过大，在不影响观察的情况 下应尽可能小些，这样有利于药剂透入 组织和细胞中。
石蜡切片的制作过程
使其沉淀或过滤后再使用。浸蜡不透包埋后会出现白色不透明部分，此时需要在浸蜡一次。 6．包埋 包埋就是将已经浸渗好的组织块包埋于浸渗剂中，石蜡包埋法如下。 浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，然后从第四 个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向。放好组织后可以 自然冷却，也可以放入冷水中直接冷却。 7．塑型和切片 取已经包埋好的蜡块，将纸盒拆下，用加热的刀片或解剖刀将其分成若干块（每块组织占一 块），用解剖刀将组织块周围多余的石蜡切去，注意不要切到组织。把有组织的蜡块修成正 方形或梯形。在进行塑型时一定要注意组织块切面的方向。蜡块塑好后将其粘在小木块上。 注意要粘牢。最后在木块侧面用铅笔记上组织块名称、编号。 切片时采用手摇连续切片机。使用切片机进行切片时，将蜡块固定在切片机上，调好距离和 所要求的切片厚度，然后用右手摇动手柄，即可进行切片了。一般来讲生物切片的厚度在 5～ 10 微米。 对于切下的切片不要用手去取，因为体温可以使蜡片粘到手上，正确的做法是用毛笔或牙签 挑取，然后放在载玻片上进行展片和粘片。 8．展片和粘片 切下的组织蜡片往往带有皱褶，所以在染色前必须进行蜡片的展片和粘片，即把切好的蜡片 平整的粘在载玻片上。展片的温度因石蜡熔点的不同而的不同，一般的 56～58℃的石蜡切 片℃的温水进行展片，48～52℃的石蜡切片用 35℃的温水进行展片。等到蜡片充分展平后， 取一清洁载玻片，载玻片上涂一薄层蛋白甘油，然后在水中捞取蜡片，捞完后将蜡片摆正， 放到格盘内，置 38℃温箱中烘干，然后即可进行染色。 展片和粘片比较简单容易做，但是如果处理不好则无法进行染色，即使能染上色，组织切片 内部的结构也往往被破坏。 9．染色和封固 为了观察组织内部的细微结构，必须应用某些与固定后的原生质有亲合性的染料，对组织进 行染色，否则有碍观察。普通的染色法有两种即苏木紫伊红染色法（简写为 H•E）染色结果 是细胞核为紫色，细胞质为粉红色；另一种方法为铁苏木紫染色（简写为 I•A），染色的结 果是全部着以深浅不同的蓝色。 苏木紫伊红染色法整个染色过程如下： 取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡 10min 左右，这个过程称为脱蜡。脱完 蜡后的切片即可进行染色，具体染色过程和时间如下： （1）100％酒精洗去二甲苯 2～5min。 （2）95％酒精 2～5min。 （3）90％酒精 2～5min。 （4）80％酒精 2～5min。 （5）70％酒精 2～5min。 （6）50％酒精 2～5min。 （7）蒸馏水洗 2～5min。 （8）苏木紫染液 10～20min。 （9）普通水洗 1min。 （10）盐酸酒精分色数秒～半分钟（70％酒精 100ml＋盐酸 1ml），分色到切片为带粉红色 后立即取出。 （11）自来水冲洗数小时。镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。
山西中学组织学石蜡切片制作过程
山西中学组织学石蜡切片制作过程一、前期准备工作1.2保存组织标本：取得组织标本后，应及时将其放入含有固定剂（如福尔马林）的容器中。
目的是阻止组织中的生物活动，保持组织的完整性，并且避免其腐烂。
1.3固定组织标本：将标本浸泡在福尔马林等固定剂中，时间根据组织的大小和性质而定，一般为24-48小时。
固定后，将固定剂倒掉，并用80%乙醇代替，以除去固定剂残留。
二、石蜡包埋2.1脱水处理：为了去除组织中的水分，使其逐渐转变为可以被石蜡所取代的有机物质，需要使用一系列递增浓度的酒精溶液浸泡标本。
一般步骤为70%酒精浸泡2小时，85%酒精浸泡2小时，95%酒精浸泡1小时，绝对酒精浸泡1小时，每次浸泡30分钟。
2.2渗透处理：将标本放入石蜡浸泡器中，利用负压吸取空气，将石蜡通过负压使其渗透到组织内部。
首先使用浓度为70%的石蜡浸泡1小时，然后逐渐转移到90%、100%的石蜡浸泡器中，每次浸泡时间为30分钟。
2.3包埋处理：取出石蜡浸泡器中的标本，将其放入石蜡中央的切底模具中。
使用石蜡将标本完全覆盖，并且与切底模具紧密贴合。
然后将模具放入冷却器中，待石蜡冷却凝固。
三、切片制作3.1准备切片机：将切片机的刀刃和刀脊擦拭干净，然后固定标本架在切片机上。
调整刀刃角度和切片厚度，一般切片厚度为3-5微米。
3.2开始切片：启动切片机，使刀刃快速向下移动，与固定的石蜡标本接触。
切割完毕后，将得到的石蜡切片放入温水中，使其浮起来。
3.3过片处理：使用刷子将切片从水中捞出，并悬挂在热面层上。
用热力将切片展平，然后放入烘箱中进行烘干。
四、切片染色4.1染料溶液准备：准备需要的染色溶液，常用的染色剂有伊红、苏木精、淡甲酸溶液等。
根据实验需求和组织特性选择合适的染料。
4.2开始染色：将石蜡切片依次放入每种染料溶液中，染色时间根据组织特性和染料浓度来确定。
一般染色时间不宜过长，以免影响染色质量。
4.3染色过程控制：对于希望获得不同颜色的组织结构，可以通过控制染色时间来实现。
1-1 石蜡切片的制作
• 4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）: 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，继续浸泡固定 2～24h。 • 另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
试剂：多聚甲醛 0.1mol/L磷酸缓冲液 40g 至1000ml
配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加 入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以 下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌） 使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清 亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
21:12
28
• 影响切片质量的因素： • （1）蜡片卷曲：刀不锋利、角度不正确、切片太薄或太 厚、材料硬、石蜡太软或太硬、蜡块中的材料不在中央。 • （2）材料与蜡片分离：包埋时石蜡温度与材料温度不一 致。 • （3）蜡片破碎不成蜡带而吸附于切片刀上：材料过脆与 刀口摩擦产生静电。 • （4）髓部发达的茎段，在浸蜡时，蜡很难浸到中央髓部， 因而髓部疏松，导致切片时髓部被切坏，成空心状态。这 种情况，可以重点切材料两端的部位，该部位浸蜡的程度 比材料中部好！！！ • （5）蜡片不成蜡带：有时是因为刀切蜡块的一面的劈面 不成平面（系磨刀不善造成），这时，可以将刀片的两面 交换后再切。
21:12
18
3.洗涤与脱水
• 固定后的组织材料需除去留在组织内的固 定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染 色效果。 • 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的 酒清洗。
21:12
19
• 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后， 才能让透明剂进入。 • 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合， 又能与透明剂相混，为了减少组织材料的 急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增 的顺序进行. • 30%--50%---70%---85%---95%--100%--100% 每步30-60分钟左右。
石蜡切片
石蜡切片一、取材骨组织剔除上面的肌肉及结缔组织后，用浸满生理盐水的纱布包裹后再用锡箔纸包裹，-20放置两小时后转移至-80保存。
二、脱钙1、固定在4%PFA中4℃固定48h，然后PBS漂洗过夜，然后置于脱钙液中进行脱钙。
注:①、固定液一般新配的为好，配好后应密封放置在阴凉避光处；②、固定组织时，固定液必须充足，一般是组织体积的20-30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次固定液。
2、脱钙a、酸脱钙20倍。
每天更换脱钙液，直至脱钙完成，小鼠股骨大概需要24-26小时。
脱钙完成后，立即将组织转移进氨水（浓氨水5滴加进100ml蒸馏水中配制）中30分钟中和残余在组织中剩余的酸。
b、EDTA脱钙15%EDTA骨组织脱钙液：首先在800mlPBS溶液中加入63.5NaOH搅拌至完全溶解，随后加入150g乙二胺四乙酸粉剂继续搅拌至溶液清亮，再加入2.5g多聚甲醛搅拌至溶解，最后调整pH值7.2-7.4，并定容为1L。
EDTA脱钙大概需要一个至两个月，第一个星期要每天换液，之后两三天换一次即可。
3、判断脱钙终点a、物理测试法用注射针扎入骨组织，能顺利无阻碍的扎进去即是脱钙完成。
b草酸铵工作液，充分混合放置过夜，每天测试一次，连续测试两天不出现沉淀即为脱钙完成。
三、脱水1、脱钙完成后的组织在PBS中漂洗过夜。
2、再在4%PFA固定过夜。
（可以省略）3、40%酒精脱水40min；4、75%酒精脱水35min；5、95%酒精脱水30min；6、100%酒精脱水20min；7、100%酒精脱水20min。
注：①、脱水时应在带盖的容器中进行，防止吸收空气中的水分。
②、更换更高一级的脱水剂时，最好不要移动组织防止损坏，可以用吸管吸出液体，再用滤纸吸净脱水剂，再加入新的脱水剂。
③、在低浓度酒精中停留不宜太长，防止组织变软，助长组织的解体。
④、在高浓度酒精和纯乙醇中停留也不宜太长，防止组织变脆，影响切片。
⑤、如需过夜，应放在70%酒精中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
骨组织大面积石蜡切片制作技术
张慧明
【期刊名称】《卫生职业教育》
【年(卷),期】2006(024)002
【摘要】制作骨组织大面积（50×20mm）石蜡切片，如按照常规方法，很难获得好的切片标本。
笔者在制作兔、人股骨和股骨头切片中摸索出一种简单、实用的石蜡切片技术。
与传统技术相比，它具有骨质硬度适中、有利于制成大面积薄切片和骨髓细胞染色佳的特点，现介绍如下。
【总页数】1页(P68-68)
【作者】张慧明
【作者单位】韶关学院医学院,广东,韶关,512026
【正文语种】中文
【中图分类】G424.31
【相关文献】
1.乌饭树茎段组织的石蜡切片制作技术研究 [J], 李瑾瑾;张敏;周鹏;方炎明
2.草地早熟禾的石蜡切片制作技术的优化 [J], 陈阳;金一锋;孙华山;赵春丽;王琦;王玉书
3.复合染色显示石蜡切片骨组织多种成分 [J], 张海;王永华
4.三种不同脱钙液在骨组织石蜡切片中的应用比较 [J], 杜洪;金荣
5.骨组织的石蜡切片及苏木素-伊红染色方法的改进 [J], 陈培琼;钟山;郑菲
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。