基于生物素亲和素系统引入的蛋白质芯片的研究

华中科技大学

硕士学位论文

基于生物素-亲和素系统引入的蛋白质芯片研究

姓名：崔浩巍

申请学位级别：硕士

专业：软件工程

指导教师：于军

2010-05-26

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摘要

生物芯片是上世纪90年代发展起来的一项具有划时代意义的微量分析检测技术，它综合了分子生物学、免疫学、半导体微电子、激光科学等学科。作为生物芯片的一种，蛋白质芯片是随着DNA芯片不断成熟而发展起来的一种新的检测技术，它是按预先设计的方式将抗原或抗体固定在基片上，形成蛋白质的微阵列，然后带有特殊标记对应的抗体或抗原与之特异性结合，通过对标记物的检测来实现抗原抗体的检测。但是到目前为止蛋白质芯片的检测灵敏度不是很高，导致结果假阴性率升高，本文正是针对这一问题展开研究，通过较好的载体表面修饰及生物素-亲和素系统的引入，使得所研制的芯片的检测灵敏度得到了很大的提高。

鉴于光盘的表面性质很好，本文用镀Au膜的光盘片这种有机塑料作为蛋白质芯片的基片。为了后续实验的顺利进行，还需要对基片进行表面修饰，首先在Au表面自组装一层单分子膜，本文选用的自组装试剂是11-巯基十一烷酸(MUA)，分子式为HS-(CH2)10-COOH，其一端的巯基(-SH)可以和Au发生化学吸附，形成的S-Au键键能约177kJ/mol，这种强的键合作用使得巯基化合物在金表面吸附有明显的优越性，另一端的羧基(-COOH)则暴露在基片的表面。另外从分子式还可以看出它是一个具有11个碳原子的长链有机分子，它一端的巯基与Au结合，另一端则可以与待测蛋白质分子共价结合，这样一来待测蛋白质分子与基体表面就有11个碳原子的距离，很好的保持了待测蛋白质分子原来的空间构象，从而也就降低了检测的假阴性率，提高了检测的准确性。自组装之后，由于基片表面的羧基不能直接与人IgG上的氨基(-NH2)反应，需首先将羧基活化，使它变为活泼酯，进而才可以与氨基反应。

为了提高检测的灵敏度，本文尝试了在蛋白质芯片上引入生物素-亲和素系统，它是以生物素-亲和素之间具有很高的结合能力为基础，二者还可以偶联抗原、抗体、酶、荧光素等大分子生物活性物质，它们的结合迅速、专一、稳定。其中亲合素是由4个相同的亚单位构成的四聚体，每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的咪唑酮环结合。这样1个亲合素分子具有4个与生物素分子结合的位点，使其具有放大效应。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者的亲和系数(Ka)为

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1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka＝105~11mol-1)至少高104倍，所以能高速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性。

免疫学实验部分是本文的重要内容，实验中用到了酶标仪，荧光扫描仪等仪器，主要内容分为两大部分：一是以酶作为标记的在96孔板上做的微孔板ELISA实验；二是以荧光分子作为标记的在自制基片上做的微阵列实验，每种实验又分为常规实验和加了生物素-亲和素的实验。实验设计方案不仅证明微阵列实验的优越性，而且进一步验证了引入生物素-亲和素系统提高检测灵敏度的优点。

关键词：蛋白质芯片，自组装分子膜，生物素-亲和素系统，抗原-抗体，ELISA

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ABSTRACT

Biochip is an emerging technology developed with Human Genome Project(HGP) and as first used in 1990s, which marks a new area of micro-analysis technology. It combines many subjects such as molecular biology, immunology, semiconductor microelectronics, laser optics, and so on. As a kind of biochip, protein chip developed a new detection technology along with the mature of the DNA chip. It works as follows: firstly, the pre-designed manner antigen or antibody fixed on the substrate to form a protein micro-array, and then react specifically with the marked corresponding antibody or antigen, through the detection of markers to infer the antigen or antibody. But until now the protein chip detection sensitivity is not very high, which results in false negative rate increasing, this article is precisely to deal with this problem through good surface modification and the introduction of biotin-avidin system, which greatly improve the detection sensitivity.

This paper use of this gold-plated plastic film as a protein chip substrates, in view of the surface of disc of good nature. In order to smooth the follow-up experiments, we also need to modify the surface of the substrate, firstly self-assembly monolayers are deposited on the surface of gold film, and the self-assembly kit is 11-mercapto-undecanoic acid (MUA), the formula HS-(CH2)10-COOH, whose the end of the thiol (-SH) can be a chemical adsorption with Au, the formation of S-Au chemical bond energy is about 177kJ/mol, this strong bond with the thiol compounds on gold film has obvious advantages, and then the other end, the carboxyl (-COOH) were exposed to the substrate surface. It also can be seen from the formula that the organic molecules has a 11 carbon atoms long chain, with a combination of Au film through thiol at one end, and a covalent combination of test protein at the other. so there is a distance of 11 carbon atoms between the test protein molecule and the substrate surface, which maintains original test protein conformation, reduces the false negative rate of detection and improves the detection accuracy. As the carboxyl on the substrate surface can not be directly react on the amino(-NH2) of human IgG, firstly it needs to be activated to active ester, and then can react on amino.

In order to enhance detection sensitivity, the article introduces the biotin-avidin system,

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which is based on high binding ability between biotin and avidin, both them can be coupled with antigen, antibody, enzyme molecules, fluorescent molecules rapidly, specificly, and stably. The avidin consists of four identical subunits, each of which combines with imidazole ring ketone of biotin through its tryptophan residues. Therefore, an avidin molecule has four conjunct sites of biotin molecules, making it has a multi-stage amplification effect. There is a strong affinity between biotin and avidin, and the affinity constant (Ka) is 1015mol-1, with a magnitude at least 1 million times higher than the antigen-antibody affinity (Ka= 105~11mol-1), therefore they can combine at high-speed, and the reaction is free from outside interference, and with a high degree of specificity and stability.

Immunologic experiment section is the important content of this article, the experiment used a ELISA Reader, fluorescence scanner and other instruments, the content can be mainly divided into two parts:one is the enzyme molecules marked detection experiment on microplates of 96-well; the other is the fluorescent molecules marked detection experiment on protein chip. The object is to prove the superiority of microarray experiments, in which each part is divided into conventional experiments and biotin-avidin participative experiments to indicate the high sensitivity advantages of biotin-avidin system.

Keywords: protein chip, self-assembled monolayers, biotin-avidin system, antigen- antibody, ELISA

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

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日期：年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。

保密□，在____________年解密后适用本授权书。

本论文

不保密□。

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学位论文作者签名：指导教师签名：

日期：年月日日期：年月日

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1 绪论

本章内容简要回顾了蛋白质芯片技术的发展现状，包括了蛋白质芯片技术的载体、检测方法以及蛋白质芯片的应用领域，并在最后总结了本课题的研究意义和目的。

1.1 蛋白质芯片技术的发展现状

1.1.1 研究背景

由各国科学家参与的人类基因组测序计划的圆满完成标志着后基因组时代的即将到来，使生命科学的研究重点逐渐转移到了蛋白质这一新的领域[1]。我们都知道，DNA是生物遗传信息的载体，是生物得以进化的物质基础，但是在构成生物体的基本单元—细胞中真正行使各项生理功能的却是蛋白质，它才是各项生理活动的直接执行者。蛋白质约占人体总重量的百分之二十，每天就约有百分之三的蛋白质参与各种代谢，从而完成生物体内的各项生理活动。蛋白质是构成生物体组，包括指甲、肌肉、毛发等的主要物质，此外还能加工成抗体，免疫感染等作用。但是目前在蛋白质功能方面的研究还是处于初级阶段的，尤其基因测序计划完成以来，浮现出大量功能尚未清楚的编码蛋白质，因此，人们的研究重点必将转移到蛋白质领域。

生物芯片(biochip)是近年来新兴发展起来的一项具有深远意义的检测技术，它融汇分子生物学、细胞学、免疫学、微机电学、微电子学、激光科学等为一体，是一项高度交叉的微量检测分析技术，具有重大的研究价值和潜在的产业化前景。在生物芯片领域最早问世的是基因芯片，它以其无以伦比的高通量、快速化、高灵敏度的基因分析能力在对基因组学的研究中发挥出了巨大的作用。随着基因芯片检测技术的发展成熟和在基因组计划研究中所取得的举世瞩目的科技成就，以及近年来对蛋白质组学的研究迫切需要一种新的检测技术来对蛋白质作大量的分析，这些因素都推动了对蛋白质领域的研究及其相关技术的快速发展，随之蛋白质芯片技术也就呱呱坠地了。蛋白质芯片(protein chip)是在对蛋白质各方面的研究中逐渐发展起来的一项检测技术，和基因芯片的原理相同，要把待测的物质固化到载体上，当然这种芯片固化的蛋白质

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分子，然后与带标记的另一种蛋白质分子高特异性的反应结合，再通过相关仪器自动分析得出结果，以实现对蛋白质分子的高灵敏度、快速化、高通量的检测分析[2]。其实Roger E.早在80年代已经阐述了蛋白质芯片技术的核心原理，但直到这项技术在蛋白质组研究领域中取得了显著成就后才得到了公众的承认和极大的关注[3]。与传统ELISA检测方法相比，蛋白质芯片这种检测方法具有的优势：①高通量，能够在一次实验中并行检测成千上万个待测样品，从检测结果中可以得到相当大的信息量，使我们能够对蛋白质功能作更全面、准确的研究；②样品耗费量少，传统的ELISA检测方法中试剂的用量一般为50~100ul，而蛋白质芯片的用量只有10~100nl；③高灵敏度，由于其固化方法能很好的保持蛋白质分子的生物活性，以及固化蛋白质分子的致密度高等原因，检测水平可以达到纳克级，甚至更低，这是传统检测方法中也无法做到的。

1.1.2 蛋白质芯片的载体

用于固定蛋白质分子，而且能在所需的时间内较好的保持蛋白质分子的生物活性，以为后续的实验提供一个承载平台的固相材料称为蛋白质芯片的载体或者称为基片。蛋白质芯片的载体材料必须符合以下两点要求：①载体表面必需具有或者经过修饰后具有可以进行化学反应的活性基团(例如羟基、羧基、氨基、巯基等)，以便与蛋白质分子进行偶联；②载体材料具有很好的稳定性，包括足够的机械硬度和理化惰性。常见的蛋白质芯片的载体主要有以下3种类型：

1.1.

2.1. 硅片

硅片是很好的蛋白质芯片载体，也是较早的应用于生物芯片领域的载体材料，其表面经过化学修饰后可以引入化学基团，例如引入硅羟基，之后通过一些偶联试剂就可以和蛋白质分子相结合[4]。这种载体材料的优点是荧光背景低、性能稳定等，但是它的成本很高，来源少，这就限制了这种载体的使用范围。

1.1.

2.2. 玻片

玻片是目前最常被用作蛋白质芯片的载体，这种载体主要优点包括成本低、来源广、性能稳定、荧光背景低等。和硅片一样，使用之前首先应进行表面化学修饰，使

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其表面生成一些化学基团，例如用浓硫酸和氨水的混合溶液处理玻片表面后，可以生成一些羟基基团，之后通过偶联试剂连接蛋白质分子。这种载体的不足之处是：对玻片的纯度及表面平整度要求很高，玻片中的杂质会造成表面结合蛋白质分子均匀性不好，不利于检测，平整度不高的玻片也不利于实验结果的表征与检测。

1.1.

2.

3. 三维凝胶芯片

在普通载体(例如玻片)表面覆盖一层多孔、亲水性好且具有三维交联网状结构的凝胶物质(例如琼脂糖凝胶、聚氯丙烯酰胺凝胶等)就制成了三维凝胶芯片。这种载体的优点在于蛋白质分子存在类似于液相的反应环境中，而且固定后的蛋白质分子存在于多孔网状结构内，和下面的载体表面有一定的空间距离，较好的保持了蛋白质分子的空间构象，这样就能很好的保存原有的生物活性，而且又由于固定蛋白质分子的量大，所以有学者称这种芯片比其它种类的蛋白质芯片的灵敏度要高的多[5,6]。但是也正因为它特有的网状多孔结构，会导致固定的蛋白质的量不统一、不均匀，另外还存在难于清洗、准备步骤复杂、成本昂贵等缺点，限制了大规模的使用。

1.1.3 蛋白质的固化方法

蛋白质的固化指的就是把蛋白质分子通过各种方法固定到载体表面上，使之在后续的实验中不会很容易的被洗脱。和DNA相比，蛋白质的生化性质更为复杂，功能结构更为多变，固定在芯片载体表面的蛋白质更容易失去原有的生物活性。因此，探索合适的表面修饰方法以保持其生物活性成为研究蛋白质芯片领域的关键技术。总的来说，蛋白质分子在载体表面的固定通常包括物理吸附法和共价偶联法，其实也就是非共价键结合法和共价键结合法。

1.1.3.1. 物理吸附法

物理吸附法就是蛋白质分子通过疏水作用力、静电作用力、范德华作用力等各种非共价键作用力固化到载体表面的一种方法。这种方法最为直接，既不需要对载体表面进行化学修饰，也不需要使用偶联试剂就可以固定蛋白质分子。虽然这种方法实验操作非常简单，但是到目前为止众多学者还没有提出一种完善的理论能清楚的解释其

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发生的机理。目前只是从实验角度对其研究，并建立了许多吸附模型：①胶体模型[7,8]；

②原子尺寸模型[9]；③其它模型，例如时间尺度、空间尺度模型等。

Catt等学者早在上世纪60年代首先以物理吸附法将蛋白质分子固化在聚苯乙烯载体材料上[10]，之后这种方法在免疫学分析检测中得到了广泛的应用。虽然物理吸附法操作步骤简单方便，实验中用到的器材便宜，但是这种固定方法的效果却不是很理想，钱卫平等学者利用原子力显微镜技术研究发现，物理吸附法会造成蛋白质分子的在纵向方向上的重叠排列[11]。虞伟等学者也用原子力显微镜发现直接吸附在聚苯乙烯上的抗原分子均匀性差、致密度不高[12]。Davis等学者使用电子隧道扫描显微镜观察了抗铁蛋白抗体的物理吸附，结果发现抗体排列的有序性很差，且抗体会在不同的区域里呈现吸附聚集的特性[13]。Bulter等学者的研究也表明，物理吸附法单位面积上固化的抗体的量很少，且结合抗体的能力很低[14]。

1.1.3.

2. 共价偶联法

共价偶联法就是共价键结合法，是蛋白质分子通过酰胺键、酯键等共价键固定到载体表面的一种方法。由于通过共价键结合，其结合的作用力很强，所以固化后的蛋白质分子很难被洗脱。蛋白质是由氨基酸分子之间通过缩合反应生成的，氨基酸分子参加缩合反应是一端的羧基(-COOH)和另一端的氨基(-NH2)，所以最后生成的蛋白质分子肯定具有的两种基团，那就是剩下的没有参加反应的一端的氨基和另一端的羧基，通过这两种基团就可以使蛋白质分子共价结合到基片上。氨基酸分子、蛋白质分子的结构通式如图1-1所示。共价键结合法的原理是基于固相表面上的某些活性基团，最常见的有氨基、羟基(-OH)、羧基等，如图1-2所示，这些基团与蛋白质分子上的相应基团形成共价键，从而牢固的固定蛋白质分子，使其足以承受后续的实验。

图1-1 氨基酸分子及蛋白质分子结构通式

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图1-2 各类共价键固定蛋白质分子的过程

1.1.4 蛋白质芯片的检测方法

蛋白质芯片检测方法很多，总的来说可以分为两大类：①带标记检测法；②无标记检测法。

1.1.4.1. 带标记检测法

常用带标记检测方法包括：酶标记检测法、荧光标记检测法、化学发光标记检测法以及胶体金标记检测法等。本实验用到了酶标检测和荧光检测，所以重点说一下这两种方法。

(1)酶标记检测：用作酶标检测的仪器是酶标仪，这种检测法的基本原理是将抗原或抗体与酶偶联结合为酶标抗原或抗体，此酶标抗原或抗体可与载体上之前固化的相应抗原或抗体发生特异性反应，这样就在载体上引入了相应量的酶分子。当加入相应底物后，底物被酶催化成为有色产物，有色产物颜色的深浅直接与酶标记抗体或抗原的量相关，继而也与固化在载体上的抗原或抗体直接相关，故可根据呈色的深浅作定性或定量分析。酶标记检测法的信号强度因底物的不同而不同，其中以辣根过氧化物

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酶(HRP)为标记，四甲基联苯胺(TMB)作为底物显色液的检测方法最为常用[15]，本实验正是选择HRP作为酶标记的。酶标仪的工作原理其实很简单，由于HRP最适吸收波长为450nm，所以把光源灯调到波长为450nm，之后透过微孔极中的待测样品。这样这束光一部分被待测样品吸收，另一部分则透过样品照射到光电传感器上，传感器将强弱不同的光信号转换成相应的电信号。然后电信号经放大，A/D转换等信号处理后送入CPU进行数据处理和计算，最后计算出各个孔的吸光度值(OD值)。吸光度的计算公式：OD=log10(I0/I)，其中I0是入射光光强，I是透射光光强。由于HRP酶对光的吸收作用，从吸光度值的计算公式中看出，含酶多的孔吸光度值就大，含酶少的孔吸光度值就小。

(2)荧光标记检测：用于荧光检测的仪器很多，比如荧光扫描仪，激光共聚焦扫描仪等，这种检测技术是以荧光分子作为标记物，与已知的蛋白质分子结合，但不影响其免疫学活性。这种检测方法同酶标检测法一样，也是首先在载体上固定待检测的抗原或抗体，只不过之后加入的是荧光标记的相应抗原或抗体，然后用相关仪器做自动化分析。Typhoon 多功能激光扫描成像系统具有高灵敏度、高通量、操作简便等特点，它集成荧光扫描、磷屏成像、化学发光扫描等多功能于一体，可以检测多色荧光、磷屏和化学发光，能够有效针对各种样品：PCR产物，蛋白质电泳凝胶，膜阵列，微阵列等等。它的光学系统和均一的低背景特点使得荧光检测可以达到非常低的检测极限并获得高质量图象。Typhoon的扫描面积大，配合功能强大的分析软件，能对样品作精密的定性，定量分析，包括微阵列分析。常用的荧光素是异硫氰酸荧光素(FITC)，它在488nm激化，使用Typhoon 多功能激光扫描成像系统的荧光扫描功能可以得到样品的荧光强度图像。

1.1.4.

2. 无标记检测法

这类检测技术步骤较简单，其原理也是首先将待测抗原或抗体固定在固相载体表面，然后直接与相应抗原或抗体反应，而无需对抗原或抗体作标记等步骤，这样就避免了标记过程可能会改变蛋白质生物活性的缺点，且缩短反应时间。而且这种检测方法可对样品中的生物分子的含量或生物分子之间发生的相互作用进行全面、实时的检测分析，这是标记检测法很难做到的。目前较为常用的无标记检测方法主要有表面等

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离子体共振技术检测[16]、激光表面增强解吸离子化技术检测[17]、电子隧道扫描显微镜技术、场扫描电子显微镜技术、原子力显微镜技术[18]以及电化学阻抗谱技术检测[19]等。这些技术弥补了带标记型检测方法的一些缺点和不足，为通量快速化检测分析提供了更强大的技术支持。

1.2 蛋白质芯片技术的应用

随着蛋白质芯片技术的愈来成熟，它已经在很多领域得到了应用。

1.2.1 疾病诊断

蛋白质芯片具有高通量、快速化、高灵敏度等优点，所以它可以并行检测多种疾病，这样就大大的加快了分析检测速度，并且降低了成本费用。疾病的发生常常是由于某种治病微生物在体内过度繁殖引起的，而这些微生物在患者体内繁殖的同时会刺激患者机体产生相应的蛋白质，之后我们就可以通过检测这种蛋白质得知是否为这种疾病的患者。用蛋白质芯片技术可以分别分析正常人和疾病患者体内的蛋白质信息及种类的不同，通过对两者的比较可以找到患者体内特异性表达的蛋白质，然后将这些蛋白质制成阵列芯片，这就为疾病的诊断和全面治疗找到了一种新的方法途径[20]。另外由于蛋白质芯片表面固化的蛋白质分子与待检测样品的蛋白质分子结合的特异性高，亲合力强，使得蛋白质芯片受待测样品中其它分子的影响很小，这样就大大降低了非特异结合，提高了疾病诊断的准确性。

1.2.2 药物筛选

疾病的发生往往是伴随着患者体内某种蛋白质性质的改变，这样把这些性质改变的蛋白质制成微阵列芯片，然后和多种化学药物进行反应，就筛选出能够与这些蛋白质特异性结合的化学药物[21]。再加上蛋白质芯片的高通量优点，就大大的加速了药物的开发。另外蛋白质芯片对新开发药物的效用及副作用的研究也有突出的优势，例如利用蛋白质芯片技术解释药物的作用原理，评判药物的毒副作用，鉴定药物的医疗效果等等，这都为新开发药物在临床上的应用提供的基础和保障[22]。

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1.2.3 蛋白质-蛋白质相互作用分析

目前，人们对很多蛋白质分子功能的认识还不够准确深入，蛋白质分子的功能往往表现在与其它蛋白质分子的相互作用之中，所以近年来，人们逐渐把对蛋白质分子之间相互作用的研究提上了日程。传统常用的蛋白质之间相互作用的研究方法是酵母双杂交系统技术，但是它存在体内操作，假阳、阴性率高和外源蛋白质不能正确折叠、修饰等局限[23,24,25]。蛋白质芯片技术可以直接在体外检测目标蛋白质，突破了酵母双杂交系统这一技术的局限，另外实验条件还可随意控制，同时实验步骤自动化程度高，分析通量大，是研究蛋白质分子功能的理想平台。

1.2.4 蛋白质-核酸作用分析

蛋白质和核酸是构成生命体最为重要的两类生物大分子，蛋白质与核酸的相互作用是分子生物学研究的中心问题之一。细胞的各种生理过程，包括信号的转导、细胞对内、外环境变化的反应等，都是以蛋白质与核酸之间相互作用有关。蛋白质与核酸之间的相互作用也在基因的转录调控中发挥着相当重要的作用，传统最常用的研究方法是凝胶迁移实验[26]，但这种方法不能高通量筛选顺式元件与反式因子，于是一种高通量研究DNA结合蛋白质的方法——双链DNA芯片就诞生了，不过目前这项技术还处于初级探索阶段[27,28,29]。

1.2.5 食品安全卫生检验

蛋白质芯片在食品安全卫生方面也具有很好的应用前景。食品中蛋白质成分的分析，食品中激素、农药、重金属、有机污染物等有害化学物质的分析，食品中污致病毒菌的分析，食品中污染的生物毒素的分析等工作几乎都可以用生物芯片来完成。目前国内这方面的工作才刚刚起步，但已显示出卓越的应用前景。相信在不久的将来生物芯片技术在食品安全监测、检验方面将获得广泛应用。

1.3 本文主要研究内容

本文是在研究微孔板技术和常规微阵列技术的基础上，通过对基片的化学修饰及生物素-亲和素系统的引入来提高蛋白质芯片的检测灵敏度，以完成芯片对疾病诊断的

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功能。全文的内容可以分为以下三个部分：

(1)蛋白质芯片载体的选取，鉴于光盘来源广、价格便宜、表面性质好等优点，更重要的是可以直接粘附Au膜，本文创造性的选择了光盘这种塑料片作为芯片的载体；

(2)为了使蛋白质分子共价结合到载体表面，对载体表面做了一系列的化学修饰，包括真空蒸镀Au膜、分子自组装、羧基的活化，这样就为以后的免疫学实验做好了准备；

(3)最后的内容就是在之前做好的芯片上做的以人IgG、羊抗人IgG为反应模式的免疫学实验，为了更好的说明本文所研制芯片的优点，本文还特意引入了微孔板实验作为对比。为了提高试验检测的灵敏度，本文创造性的引入了生物素-亲和素系统(BAS)，这样总体上看，本文包括了两两比较的四种实验：微孔板常规实验、微孔板BAS实验、微阵列常规实验、微阵列BAS实验。

1.4 本文的研究目的和意义

本课题的研究目的是制作一种应用于疾病诊断的基于生物素-亲和素系统引入的蛋白质芯片，以克服传统检测方法的不足。不管是以往的96孔板检测方法，还是近年来新兴发展起来的微阵列检测方法，都存在检测灵敏度不高的缺点，容易造成假阴性，就是本来阳性的、不正常的个体检测结果却是阴性的、正常的，这就使得患者得不到及时的治疗，进而导致病情的进一步恶化。为了解决这一问题，就需要提高检测灵敏度，本文采用优越的化学修饰方法及生物素-亲和素系统的引入，都大大的提高了检测的灵敏度。

本文研制的自组装蛋白质芯片改进了传统微孔板检测方法的各种不足之处：①传统微孔板检测方法中，蛋白质分子直接吸附在载体上的，这样不仅结合力小，容易洗脱，还会使其空间构象的改变，进而导致活性降低，这些都会使检测的假阴性率升高。加了单分子自组装膜之后，使蛋白质分子不再是直接吸附在载体上，而是采用共价键的结合方式，结合力牢固，不易洗脱，更重要的是蛋白质分子与载体之间有一条长碳链，这样就减小了蛋白质分子的空间构象的变化，使检测更加准确；②由于自组装膜是一层致密、均匀的单分子膜，这样就可以大大的增多蛋白质分子的结合位点，且使

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蛋白质分子均匀的结合到载体表面上去，这也样就提高了检测的灵敏度。

另外为了改善以往蛋白质芯片检测灵敏度不够高的缺点，就在实验中引入了BAS，它是以生物素和亲和素之间具有很高的结合能力为基础，二者还可以偶联抗原、抗体、酶、荧光分子等大分子生物活性物质。其中亲合素由4个相同的亚单位构成四聚体，每个亲合素亚单位通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的咪唑酮环结合。因此，1个亲合素有4个与生物素结合的位点，使其具有放大效应。亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka ＝105~11mol-1)至少高104倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特异性和稳定性，该系统的这些优点都大大提高了检测的灵敏度。

总的看来，我们研制的这种蛋白质芯片具有结合蛋白质分子牢固、均匀性好、致密度高、检测灵敏度高等优点，对于疾病的诊断来说无疑是提高了检测的准确率。

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2 蛋白质芯片检测灵敏度提高的探索

2.1 引言

目前在固相载体材料上用于检测蛋白质的方法主要有两种：①微孔板检测方法，即96孔板检测，它新兴与上世纪70年代，由于其特异性强、重复性好、操作步骤简单、结果分析客观，既可以做定性试验也可以做定量分析等优点，自问世以来，其发展十分迅速，已广泛应用于微生物学、分子生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞学等学科领域；②微阵列检测方法，及通常所说的蛋白质芯片，它是近年来随着基因芯片技术的成熟而发展起来的一项蛋白质微量检测技术，由于其具有高通量、快速化、准确而快速发展且应用于免疫学各个领域。但是这两种方法都存在一些缺点，主要是检测的灵敏度不够高，以至于检测结果的假阴性率很高，本文正是为改善传统方法这一缺点而进行了深入的研究工作。

2.2 微孔板检测技术

本文所说的微孔板实验其实就是ELISA实验，ELISA是酶联免疫吸附法(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)的简称，它是一种用酶(例如辣根过氧化物酶)来标记抗原或抗体的分析检测技术。ELISA是一种特异性强、重复性好的检测方法，由于其操作步骤简单、结果分析客观，既可以作定性分析也可以作定量分析等优点，自70年代初问世以来，其发展十分迅速，已广泛应用于微生物学、分子生物学、寄生虫学、肿瘤学和细胞学等学科领域。

2.2.1 ELISA原理

ELISA实验是以抗原和抗体的高特异性结合为基础，以及标记酶高效催化相应底物显色作用相结合的一种操作步骤简单、重复性较好的的实验检测技术。它是以96孔板这种聚苯乙烯材料为固相载体，如图2-1为ELISA实验载体。

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图2-1 ELISA实验载体

具体的实验方法有多种：例如直接法、间接法、夹心法等等，如图2-2所示。在实验中，不管哪种方法，都有包被、封闭、显色、终止、酶标检测等步骤：

(1)包被：也称固化，就是把待检测的蛋白质分子固定到96孔板上，当然要较好的保持蛋白质分子原有的生物活性。

(2)封闭：封闭的目的就是把载体表面上未结合蛋白质分子的空白区域用某种试剂填充，使得后续步骤的标记分子不会直接结合到载体上，这样可以很好的减小非特异性吸附，降低假阳性率。目前最常用的封闭试剂是1%BSA。

(3)显色：当在有酶分子存在的条件下加入相应显色液时，酶就会催化显色液显色，颜色的深浅和酶分子的浓度有关。常用的显色液为TMB。

(4)终止：终止就是终止显色，使颜色在短时间内不发生变化，利于后面的检测。

(5)酶标检测：酶标检测有专门的仪器，那就是酶标仪，它是一种自动化的检测仪器，通过测定每个孔的吸光度值来推知各个孔的酶分子含量。

具体的实验步骤为：首先将待检测的抗原或抗体包被到载体表面，同时较好的保持原有的生物活性，之后用洗涤液(如PBS)洗去未与载体结合的待检测分子，然后再加入酶标记的相应抗原或抗体，这样通过反应使得酶分子结合到固相载体上，而且结合在载体上酶分子的数量与待检测分子成一定的比例关系，加入底物显色液后，酶催化底物显色，显色的深度与待测样品的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

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图2-2 ELISA的几种实验方法

2.2.2 微孔板检测方法的不足

微孔板检测方法是在96孔板这种聚苯乙烯材料上完成蛋白质分子的固定的，虽然这种材料对蛋白质分子有很好的直接吸附作用，可以使蛋白质分子吸附在表面，但是这种直接吸附的方法有很大的不足之处：

(1)吸附力很小，容易被洗脱。这种固定蛋白质分子方法靠疏水作用力、静电引力、范德华作用力等非共价键作用力，键合力相当弱，固定后的蛋白质分子很容易就被洗脱，造成实验结果的灵敏度不高，为了使蛋白质分子稳定的固定在载体表面，需要对其表面进行修饰，使表面引入能与蛋白质分子共价结合的基团；

(2)直接吸附会使蛋白质分子的空间构象发生变化，使其活性降低。96孔板实验中蛋白质分子是直接通过非共价键作用力直接吸附到载体表面上的，蛋白质分子的结合部位是随机的，如果它的功能域在吸附过程中朝向载体或者朝向侧向，那么就会影响其生物活性，甚至失活，那么这部分蛋白质分子就很难被检测到，造成检测的灵敏度不高；

(3)吸附法中固定的蛋白质分子的致密性不高，均匀性不好。蛋白质分子是一种生物大分子，直径约100nm，比11-巯基十一烷酸(后续自组装实验的成膜分子)这种小分子大得多，这样单位面积固定的蛋白质分子的量就很小，导致致密度不高，另外吸附过程中蛋白质分子是随机在载体上固定的，容易造成空白区域，而有的区域蛋白质分子则重叠排列，使得均匀性极差，这也会影响检测的灵敏度。

综上所述，物理吸附方法虽然操作简单，但存在很多不足之处，其结合力弱、生物活性降低、致密度不高、均匀性不好等等因素都会造成检测的灵敏度低，假阴性率

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高等缺点。而微阵列芯片采用共价结合方法固定蛋白质分子，其表面修饰后可以很好的保持蛋白质分子的生物活性，在一定程度上提高了检测的灵敏度，这也是微阵列芯片诞生的必然性。

2.3 微阵列芯片技术

微阵列芯片是(micro-array)以高通量为基本特征，在1个平方厘米的面积上用自动点样仪可以点样多达数千个样品，这样就大大的减小了工作量和节约了成本费用。微阵列芯片的基础研究始于上世纪80年代，本质上是一项微量检测分析技术，首先是在生物遗传学领域发展起来的。微阵列芯片主要分为基因微芯片和蛋白质芯片，本文微的阵列芯片指的是蛋白质芯片。

2.3.1 微阵列芯片技术原理

蛋白质芯片技术的基本原理也是以抗原和抗体特异性结合为基础，以激光激发荧光分子发光作为常用检测方法的一项技术。它通常以经过化学修饰的玻片、硅片及三维凝胶芯片为载体，通过共价键将蛋白质分子结合到载体表面，如图2-3为一种设计好的蛋白质芯片载体。

图2-3 蛋白质芯片载体

实验中典型的实验步骤如点样、封闭、荧光检测：

(1)点样：就是用专门的点样仪将待测的蛋白质分子滴到载体表面，这一步和ELISA实验中包被相同，只不过这里蛋白质分子是共价结合到载体表面上，且通常的容量只有10~100nl，点样后会在载体表面形成微阵列图样。