免疫组化笔使用的注意事项
Dako 免疫组化操作手册
原位杂交RICHARD HARVEY简介⏹核酸作为探针用于生物材料的检测大约开始于三十年前。
目前，主要有两类核酸探针检测：固相杂交和液相杂交。
固相杂交技术分为两个类型：原位杂交（ISH)和合成支持物（synthetic support ）。
在此只详细介绍固相杂交。
最古老而应用最广泛的核酸检测方法就是固体的支持物上的杂交。
上世纪70年代出现的Southern 和Northern杂交可能是最广为人知的核酸杂交方法1,2。
其基本原理是将核酸固定于人造支持物上而保持杂交的状态。
这些核酸可以是靶核酸也可以是探针。
有趣的是，一些最近才发展起来的新技术，如基因芯片（microarrays），其实也是基于基本杂交原理上的改进。
在Southern和Northern杂交中，核酸是通过电泳分离后转移到膜上，而基因芯片则是将核酸直接点样到支持物表面的特殊区域。
其他常用的固相核酸技术还包括威力杂交和微球杂交等。
原位杂交（ISH）与固相杂交的关系密切。
其原理是核酸被固定在细胞内而不是被抽提出。
ISH 最显著的优点是可以定位杂交物在组织中的位置。
而最大缺点是由于保持了细胞的形态和结构，可以引入多种潜在的抑制成份。
历来绝大多数ISH检测都是使用福尔马林固定石蜡包埋的组织。
为了保证在这些组织片中的核酸易于杂交，常用蛋白酶进行预处理。
有报道称微波和高压灭菌器也可作为蛋白酶处理的辅助方法或替代方法使用。
标本的复杂性⏹选择探针和检测系统的关键因素之一是标本的复杂性。
标本越复杂，其非特异性杂交就也可能发生。
即使交叉杂交的程度很低，但如果非特异性的靶点有足够的数量，也会发生假阳性信号。
标本的复杂性主要在两个实验步骤中处理：组织处理和探针设计。
当进行Northern 和Southern杂交时，会去除污染的DNA和RNA，这样制备样品会很明显地降低其标本复杂性。
在Northern杂交中，去除核糖体RNA会使对靶mRNA的识别能力提高20-50倍。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
免疫组化在同一张玻片上做2种免疫抗体检测
处理 要求分 别进行 酶消 化 、 柠檬 酸及 Ｅ Ｔ Ｄ Ａ高 压抗
原修 复 等 相 应 处 理 。再 用 蒸 馏 水 洗 ２次 ， ｒ ｎ ３ ｉ， ａ Ｐ Ｓ ２次 ，ｍ ｎ Ｐ Ｓ每 ２ ０ ｌ 曲拉 通 Ｘ一１０ Ｂ洗 ３ ｉ（ Ｂ ０ｍ 加 ０ １ 。下 同 ） 滴 。用 Ｐ Ｐ笔在距 离 组织 周 围 ３～ ｍ Ａ ４ｍ
１２ 方 法 ．
标 本 经 １ ％ 福 尔 马 林 固定 ， 规 脱 ０ 常
水， 石蜡 包埋 ， 片厚 度 ３ｘ 切 Ｉ ｍ。切 片 时在磨 砂标 签 预 留处标记 好抗体 名称 ， 把相 同预处 理要求 的 ２种 抗体 名称标 记 于 同一 玻 片上 ， 中问 用／ 隔 开 。取 号
片时， 分左 右在 同一 玻 片上 置 ２片组织 切 片 （ 片 玻 事先经 Ａ Ｅ Ｐ Ｓ胶处 理 ） 中 间视 组织 块 大 小 留有适 ，
一 一
图 １ ＣＫ ０（ 水 ： 癌 ） ２ 胸 腺
３ 讨 论
免 疫组 织 化 学 又 称 免疫 细胞 化 学 ， 利用 抗 是
原与抗 体 问 的 特 异 性 结 合 原 理 和 特 殊 标 记 技 术 ， 对 组织 和 细胞 内的 特 定 抗 原 或 抗 体 进 行 定 位 、 定 性 或定 量 检 测 的 一 门技 术 … 。在 病 理 实 际 工 作 中， 免疫 组 化 技术 作 为 一 种 常规 应 用 于 外 科 病 理
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１ ０８ ・ ４
浙江 』 医 学 ２ １ 临床 ００年 ｌ 第 １ 第 】 ２月 ２卷 ２期
免 疫 组化 在 同一 张玻 片上 做 ２种免 疫 抗体 检 测
孟 丽 陶丹华 潘 秀兰
免疫 组化 目前在 病 理诊 断 和 科研 １ 作 中应 用 十分 普遍 ， 材 量 也很 大 。为 了减 少 试 剂 材 料 消 耗
免疫组化步骤
免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20-25min；2、脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；3、复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精---70%酒精---50%酒精，5min/次；4、ddH2O洗2次，5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS-0100），125℃，5min；注：1x修复液：198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀；抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close”对准白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次，5min/次；7、去除 H202酶：3%H202，15min；注意遮光；注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml PBS ）8、PBS 2次，PBST 1次，5min/次；9、封闭（blocking）：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温1h，湿盒；封闭液不要过多，以免溢出；注：封闭液：1xPBS，0.3%Triton X-100，10% goat serum（如：870ulPBS+30ul 10% Triton X-100+100ul 10% goat封闭液）；10、孵一抗：用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h），湿盒。
对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：GFAP--1:200，Ki67--1:200，CD31--1:20~1:40，Flag--1:200，Nestin--1:200，III-Tubulin--1:100011、室温，30min；（从冰箱拿出时动作也要缓慢）12、PBST洗3次，5min/次；注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10%Triton X-1000 ;13、①加荧光标记的二抗（封闭液稀释抗体1:1000），1h，室温，湿盒；②加HRP标记的二抗（封闭液稀释抗体1:10000），室温30min; 注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；14、PBST洗3次，5min/次；15、若①复染：DAPI染色，避光，5min；若②TSA放大3~10min,PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；注：DAPI：50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍16、封片：直接向组织滴加抗荧光淬灭剂，注意不要产生气泡，盖盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光4~5min后即可拍片。
免疫组化实验方案
鼠脑组织ICH实验操作步骤1. 所用试剂及耗材1)一抗：Anti-Tyrosine Hydroxylase, clone LNC1. Millipore. Cat. # MAB318.Lot # NG1899912.2)二抗：Envision TM Detection Kit. Gene Tech (Shanghai) Company Limited.Code No: GK500705/10.3)一抗稀释液：免疫染色一抗稀释液。
碧云天生物技术研究所。
Code No：P0103。
4)PBS：PBS缓冲液(PH 7.2-7.6)。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No：AR00305)枸橼酸盐缓冲液：PH 6.0。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No：AR00246)H2O2：3%(PBS配置）7)病理载玻片、病理盖玻片、免疫组化湿盒、免疫组化笔、切片盒、晾片板。
2. 免疫组化1)二甲苯脱蜡透明：每次10 min，连续2次。
2)梯度乙醇洗脱：100%浓度洗脱5 min，100%、95%、95%浓度洗脱2 min，然后用去离子水冲洗。
3)抗原修复：用去离子水冲洗切片，然后将组织放入枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）中，使用微波炉加热，先高火5 min，然后中低火10 min。
修复后自然冷却到室温。
4)PBS洗片：修复后的切片使用PBS冲洗，每次3 min，连续3次。
5)3% H2O2（PBS配置）封闭：避光孵育10 min，去离子水冲洗。
6)PBS洗片：每次3 min，连续3次。
7)封闭：用滤纸擦干切片组织周围的水，用免疫组化笔画圈。
然后滴加10 %血清（PBS配置）封闭非特异性作用位点，每张载玻片加200 μl到300 μl封闭液，室温孵育1 h。
8)一抗（1:1000）孵育：封闭后的切片，用移液器吸掉封闭液，然后每张切片滴加200 μl的一抗（抗体使用一抗稀释液稀释到所需浓度），湿盒中室温孵育1 h。
免疫组化染色步骤-冰冻切片
免疫组化染色步骤主要试剂：Triton X-100（上海生工，货号：0694-100ml ）；0.3% 和0.03% H 2O 2（国药集团，分析纯AR ，30%, 货号：10011218）； 5% normal goat serum （ S-1000，Lot ：Y0123，Vector ）；一抗：Truus rabbit anti- human AVP(23-06-‘86)（1:1000）【荷兰赠送】；二抗：biotinylated goat anti-rabbit IgG （1:200; catalog-BA-1000 Lot NO. X0524, vector ,burlingame, USA ）；ABC Kit ：peroxidase standard PK-4000, vectastain®, vector , USA （1:200） DAB ：0.05% 3,3’-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液配制：1、10× Tris Buffered Saline (TBS) 、10× TBST 配方：24.2 g Tris base ，80 g NaCl ，adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1×).10×TBST （3% Triton ）：30ul Triton-100 + 970ul TBS （37℃）2、 0.3% H2O2 + 0.5%Triton + TBS ：【注意避光，提前20min 配，37o C 水箱溶解Triton 】 99ml TBS （1×） 500µl Triton【先把Triton 溶解在TBS 中后，再加入H 2O 2。
】3、 抗体配制方法：抗体 + 羊血清 + TBST （0.3%Triton-100），即TBST 来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈）①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。
将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。
）②脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。
使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡Ⅰ1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡Ⅱ中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。
③包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡Ⅱ倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。
），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。
免疫组化流程步骤
免疫组化流程---袁燕平以下步骤为本人免疫组化常用步骤，流程与常见流程无异，流程如下；1 脱蜡---脱蜡前首先烤片10分钟，二甲苯1，2，3，各10分钟。
二甲苯应该经常更换！2 水化---梯度酒精至水，100％5分钟，100％5分钟，95％3分钟,85％3分钟,75％3分钟，自来水流水冲3分钟。
注意冲水时水量不宜过大，细流即可！3 抗原修复---采取微波加热修复，修复液为柠檬酸盐溶液（最常用），具体方法为：先将修复液加热至沸腾，然后放入玻片，先使用中火8分钟，然后低火8分钟。
一般要求热修复时间达到15分钟才能达到比较好的抗原修复作用。
请注意：在抗原修复完成之后要求玻片上组织一直保持湿润，千万不能出现组织风干的情况。
部分抗原分子可无需进行抗原修复。
4 冷却---一般采取流水降温冷却法，即将容器置于自来水流水中缓慢降温，降温不宜过快，30分钟为好。
部分实验室采取自然冷却法。
5 灭内源性过氧化物酶---注意此时开始一直将玻片置于湿盒中保湿！滴加液体前先用免疫组化专用笔绕组织涂画一圈，甩干组织上的水分，用力不要过猛，然后滴加3％的过氧化氢-甲醇溶液（或者医用3％的过氧化氢），室温15min。
（因为免疫组化中使用的显色液的主要成分为过氧化氢，灭酶可以避免假阳性的出现）。
随后PBS洗3次3分钟。
6 封闭---甩干组织上的液体，滴加与二抗来源相同的非免疫血清（兔血清常用），室温封闭20分钟。
提前配制一抗，使用抗体稀释液（或PBS）按1:100-400（酌情）比例稀释一抗。
每块组织滴加10-30ul体积抗体即可，每次使用前必须新鲜配制，抗体稀释后尽快使用。
7 孵一抗---不需PBS洗，可甩干组织上的液体并滴加合适稀释度的一抗， 4度过夜孵育。
8 复温---将湿盒从冰箱拿出置于室温中15分钟。
PBS洗3次3分钟。
9孵二抗---甩干组织上的液体，滴加二抗，每张切片约滴加10ul即可，注意液体面积要大于组织面积，否则显色时出现边缘效应（假阳性），37度孵育30-60分钟。
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免疫组化笔（通常称为PAP笔或免疫组化标记笔）是一种用于标记特定抗原的精密工具，它通常用于病理学实验室中的免疫组化染色过程。
使用免疫组化笔时，需要注意以下几点以确保实验的准确性和可靠性：
1. 操作前的准备：
-确保免疫组化笔是干净的，并且已经正确地装载了所需的抗体。
-准备好所有必要的试剂和设备，包括标记笔、抗体、显色剂、洗涤缓冲液等。
-阅读并理解免疫组化实验的说明书，确保熟悉实验步骤和注意事项。
2. 样本的准备：
-确保组织样本已经正确固定、切片并进行了适当的抗原修复。
-样本应在无菌条件下处理，以避免污染和交叉反应。
3. 标记过程：
-使用免疫组化笔时，要均匀、轻柔地涂抹抗体，避免过度压力导致笔尖损坏或样本损伤。
-标记时，笔尖应与组织保持适当的距离，以防止油性墨水渗入组织或染色区域。
-标记后的样本应在适当的温度和湿度的环境中孵育，以便抗体与抗原充分结合。
4. 洗涤和染色：
-标记后，根据实验步骤进行适当的洗涤，以去除未结合的抗体和减少背景染色。
-使用适当的显色剂和洗涤缓冲液，确保染色过程的准确性和重复性。
5. 结果分析：
-染色完成后，对结果进行显微镜检查和分析，确保标记的准确性和染色的质量。
-对照样本应与实验样本同时处理，以比较和验证结果。
6. 清洁和存储：
-实验结束后，应清洁免疫组化笔，去除残留的抗体和染料，以备下次使用。
-存放时应避免笔尖受到损坏，确保下次使用时仍能保持良好的性能。
7. 质量控制：
-定期进行质量控制检查，确保免疫组化笔的性能和染色的准确性。
-如有异常，应及时调整实验步骤或更换设备。
遵循这些注意事项可以帮助确保免疫组化实验的准确性和可重复性，从而得到可靠的研究结果。