大肠菌群检测方法
食品中大肠菌群检测及注意事项
食品中大肠菌群检测及注意事项大肠菌群(Coliform bacteria)是指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界中广泛存在。
检测方法MPN检索表使用GB/T 4789.3-2023检索表中阳性管数是以1mL(g)×3、0.1mL(g)×3和0.01mL(g)×3的梯度进行表示，GB 4789.3-2023阳性管数是以0.10、0.01和0.001的梯度表示,均根据稀释倍数推算结果，结果相同。
推算方法以GB 4789.3-2023为例，改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推即可。
常用标准常见问题及解答1、如何选择检测方法？答：你要依据产品的执行标准去选择检测方法，不是说你喜爱那种就可以用那种。
2、03版的结果能不能和10版的结果进行换算和比较？答：其实换算是不行的，这个两个不同的标准。
假如只是进行比较两个结果是可以的，但是不建议。
3、同一批产品，检测的两份结果不一样，是不是那里出问题？答：其实不是出问题，这个是正常的，同一批产品不代表他们的微生物检测结果是一模一样的，假如是这样也没必要做五份去验证产品合格了吧？假如说同一份样品（制成一份样）消失结果差好远的话，这里就要去分析那里出问题。
样品采集怎样采样，才能使样品具有代表性？这里将样品分为两类：预包装食品和散装食品或现场制作食品1、对于预包装食品① 应采集相同批次、独立包装、适量件数的食品样品，每件样品的采样量应满意微生物项目检验的要求。
② 独立包装小于、等于1000g 的固态食品或小于、等于1000mL 的液态食品，取相同批次的包装。
酶底物法测粪大肠菌群标准
酶底物法测粪大肠菌群标准
摘要：
I.引言
A.酶底物法简介
B.粪大肠菌群检测的重要性
II.酶底物法测粪大肠菌群的标准方法
A.仪器和材料
B.实验步骤
1.准备工作
2.样品处理
3.酶底物反应
4.结果分析
III.酶底物法与其他检测方法的比较
A.纸片快速法
B.固定底物酶底物法
IV.应用案例
A.实际水样检测
B.检测结果比较
V.结论
A.酶底物法的优点
B.未来发展方向
正文：
酶底物法是一种常用于测定粪大肠菌群的方法，具有操作简便、结果准确等优点。
粪大肠菌群检测是环境监测的重要指标，对于评估水体污染程度、保障饮水安全具有重要意义。
酶底物法测粪大肠菌群的标准方法主要包括以下步骤：首先，准备所需的仪器和材料，如高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、程控定量封口机、紫外灯、移液管等。
然后，进行样品处理，包括采集水样、添加抑制剂等。
接下来，进行酶底物反应，将酶底物加入反应液中，观察其变化。
最后，对结果进行分析，计算粪大肠菌群的数量。
酶底物法与其他检测方法相比，如纸片快速法和固定底物酶底物法，具有较高的准确性和灵敏度。
在实际应用中，酶底物法已被广泛用于环境监测领域，取得了良好的效果。
例如，在检测实际水样中的粪大肠菌群时，采用酶底物法可以获得较为准确的结果，有助于评估水体的污染状况。
总之，酶底物法作为一种有效、可靠的粪大肠菌群检测方法，在环境监测领域具有广泛的应用前景。
然而，在实际操作中仍需注意一些问题，如避免实验操作过程中的污染、选择合适的酶底物等，以提高检测结果的准确性。
_食品中大肠菌群的测定
种一起按下列程序进行。
2 、分离培养
将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂 （EMB琼脂）平板上划线分离。然后置 36±1℃温箱内，培养18～24小时后取出， 观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实 试验。
可疑菌落特点： 具有金属光泽的深紫黑色菌落； 不带或略带金属光泽的菌落；
中心色较深的淡紫黑色菌落。
CFU/g（mL）。
国标4789.3的08版与03版主要不同
1、名称更改
以大肠菌群计数代替原来的大肠菌群测定。
2、增加了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。
3、大肠菌群的MPN法以乳糖为主改为以月桂基硫 酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤为主的要培养基的MPN 法。 4、大肠菌群的MPN法中原“报告每100 ml （或g） 大肠菌群的MPN值”改为“报告每1 ml （或1g） 大肠菌群的MPN值”。
记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。 未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复 发酵试验。
3、复发酵试验
用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤 管中分别取培养物l环，移种于煌绿乳糖胆盐 ( BGLB）肉汤管中，36℃±1℃ 培养48h±2h ，
观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
（4） 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓 冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸
头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1
支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制
成1:100 的样品匀液。
（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以
（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，
耐热大肠菌群粪大肠菌群快速检测（酶底物法）
耐热⼤肠菌群粪⼤肠菌群快速检测（酶底物法）1 适⽤范围本⽅法适⽤于⽣活饮⽤⽔及其⽔源⽔、地表⽔、污⽔、废⽔等⽔中粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群）的定性检测、定量检测2 ⽅法原理固定底物酶底物法（DST）采⽤⼤肠菌群细菌能产⽣β-半乳糖苷酶分解ONPG使培养液呈黄⾊的原理，来判断⽔样中是否含粪⼤肠菌群（耐热⼤肠菌群），粪⼤肠的培养温度是44.5℃。
3 仪器设备3.1 程控定量封⼝机3.2电热恒温培养箱3.3 冰箱3.4 51孔定量盘、97孔定量盘3.5 100ml⽆菌⽔样瓶3.6 ⾼压蒸汽灭菌锅3.7 ⼲热灭菌器3.8 量筒3.9 吸管3.10 试管4 培养基和试剂4.1 科⽴得（固定底物技术酶底物法）检测试剂：MMO-MUG培养基4.2 ⽆菌⽔5 样品的采集和保存5.1采样前准备：5.1.1 采样瓶：采⽤IDEXX公司科⽴得系统配套的灭菌100毫升消毒带刻度容器。
5.2 样品采样及注意事项5.2.1将已灭菌和封包好的采样瓶，⽆论在什么条件下采样时，均要⼩⼼开启包封纸和瓶盖，避免瓶盖及瓶⼦颈部受杂菌污染，并注意在使⽤船只或附带的采样绳等附加设备采样时可能造成的污染。
5.2.2 在采集江、河、湖、库、地表⽔样时，可握住瓶⼦底部直接将采样瓶插⼊⽔中，约距⽔⾯10~15厘⽶处，瓶⼝朝来⽔⽅向，使⽔样灌⼊瓶内。
如果没有⽔流，可握住瓶⼦⽔平前推，直⾄充满⽔样为⽌。
采好样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采样后，采样瓶内上部应留有⼀些空隙，以便检验前充分混匀⽔样。
5.2.3 ⽤采样器采样时，将⽆菌的⽔样瓶放⼊架内。
将采样装置放⼊⽔中。
到达预定深度后，打开瓶塞，待⽔样灌好后，松开瓶塞的软绳，盖上瓶盖。
再将整个装置提出⽔⾯。
5.2.4 从⾃来⽔龙头采集样品时，不要选⽤漏⽔的龙头，采⽔前可先将⽔龙头⽤酒精灯⽕焰灼烧灭菌或⽤70%的酒精溶液消毒⽔龙头及采样瓶⼝，然后将⽔龙头完全打开，放⽔数分钟后除去⽔管中的滞留杂质。
采⽔时控制⽔流速度⼩⼼接⼊瓶内。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测是一项非常重要的检测方法，可以帮助医生了解肠道菌群的健
康状况，对于一些肠道疾病的诊断和治疗具有重要的指导意义。
目前，常见的粪大肠菌群检测方法主要包括传统培养法、分子生物学方法和代谢产物分析法。
传统培养法是最早被使用的检测方法之一，其原理是将粪便样本在特定的培养
基上进行培养，然后观察和计数不同菌种的数量。
这种方法简单易行，但是存在着检测时间长、无法培养一些难以培养的菌种等缺点。
分子生物学方法是近年来得到广泛应用的一种检测方法，其原理是通过PCR
扩增、测序等技术，对粪便样本中的微生物DNA进行检测和分析。
这种方法可以
快速、准确地获取肠道微生物的信息，但是需要专业的设备和技术人员进行操作，成本较高。
代谢产物分析法是一种新兴的检测方法，其原理是通过检测粪便中微生物代谢
产物的种类和含量，来推断肠道微生物的组成和功能状态。
这种方法无需培养微生物，可以直接反映微生物的活动情况，但是目前仍处于研究阶段，需要更多的临床验证。
除了以上几种方法外，近年来还出现了一些新的粪大肠菌群检测技术，如16S rRNA测序技术、宏基因组测序技术等，这些新技术在提高检测灵敏度、准确性和
全面性方面具有一定优势，但是也存在着技术门槛高、设备昂贵等问题。
总的来说，粪大肠菌群检测方法在不断地发展和完善，不同的方法各有优缺点，应根据具体的临床需求和实际情况选择合适的检测方法。
未来随着技术的不断进步，相信粪大肠菌群检测方法会更加快速、准确、全面，为肠道健康的评估和疾病的诊断治疗提供更好的帮助。
粪大肠菌群检测方法
粪大肠菌群检测方法粪大肠菌群检测是一项非常重要的检测方法，它可以帮助我们了解肠道内的微生物组成情况，对于肠道健康的评估和疾病的诊断具有重要意义。
在进行粪大肠菌群检测时，我们可以采用多种方法来获取准确的检测结果。
下面将介绍几种常见的粪大肠菌群检测方法。
首先，传统的培养法是一种常用的粪大肠菌群检测方法。
通过将粪便样品接种到含有特定培养基的培养皿中，然后进行培养和计数，可以得到不同菌群的数量和种类。
这种方法操作简单，成本较低，但需要一定的培养时间，并且只能检测到能够在特定培养条件下生长的菌群，对于一些无法在常规培养条件下生长的菌群无法检测到。
其次，分子生物学方法也是常用的粪大肠菌群检测方法之一。
包括PCR、实时荧光定量PCR、16S rRNA基因测序等技术，可以对粪便中的微生物DNA进行扩增和测序，进而对菌群进行鉴定和数量分析。
这种方法可以检测到更多种类的微生物，具有更高的灵敏度和特异性，但相对来说操作复杂，成本较高。
另外，近年来，基于高通量测序技术的宏基因组学方法也逐渐应用于粪大肠菌群检测。
通过对粪便样品进行高通量测序，可以获得更全面、更深入的微生物组成信息，包括细菌、真菌、病毒等。
这种方法可以帮助我们更好地了解肠道微生物的多样性和功能，但需要较高的测序深度和数据分析能力。
除了上述方法外，还有一些新兴的粪大肠菌群检测方法，如代谢组学、蛋白质组学等，可以通过检测粪便中的代谢产物和蛋白质组成来评估肠道微生物的活动和功能。
这些方法在研究肠道微生物与宿主健康的关系方面具有重要意义。
综上所述，粪大肠菌群检测方法有多种选择，每种方法都有其特点和适用范围。
在进行粪大肠菌群检测时，应根据具体的研究目的和实际情况选择合适的方法，以获得准确、全面的检测结果。
希望通过不断的技术进步和方法改进，粪大肠菌群检测能够更好地为肠道健康的评估和疾病的诊断提供帮助。
微生物大肠菌群检测方法
微生物大肠菌群检测方法引言：微生物大肠菌群检测方法是一种常用的研究微生物组成和功能的手段。
大肠菌群是人体内的一类重要的微生物群落，对人体健康起着重要的作用。
本文将介绍微生物大肠菌群检测方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理微生物大肠菌群检测方法主要基于高通量测序技术。
其原理是通过提取样品中的DNA，利用特定引物放大16S rRNA基因片段，然后将其测序，并通过比对数据库中的参考序列进行分类和定量分析。
16S rRNA基因是细菌和古细菌的共有基因，其序列在不同菌种之间具有一定的保守性和变异性，因此可以通过分析该基因的序列来鉴定和定量不同的微生物。
二、步骤1. 样品采集：从感兴趣的环境或生物体中采集样品，如粪便、土壤、水体等。
2. DNA提取：利用商用的DNA提取试剂盒，提取样品中的总DNA。
3. PCR扩增：设计引物对目标基因进行PCR扩增，常用的引物有27F和1492R。
4. 凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，检查扩增结果。
5. 文库构建：对PCR产物进行文库构建，包括连接适配子、文库纯化等步骤。
6. 测序：使用高通量测序技术对文库进行测序，获取原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行质控和过滤，去除低质量序列和嵌合体序列。
8. 序列比对：将过滤后的序列与数据库中的参考序列比对，进行分类和定量分析。
9. 数据分析：利用生物信息学工具对比对结果进行统计和分析，如物种丰度分析、群落结构分析等。
三、应用领域微生物大肠菌群检测方法在许多领域都有广泛的应用。
1. 人体健康研究：通过检测人体内的大肠菌群组成和丰度变化，可以研究肠道微生物与人体健康之间的关系，如肠道菌群与肥胖、炎症性肠病、自身免疫疾病等的关联。
2. 环境微生物学：通过检测土壤、水体等环境中的大肠菌群，可以评估环境质量、监测环境污染，以及研究微生物在环境中的生态功能。
3. 食品安全：通过检测食品中的大肠菌群，可以评估食品的卫生状况，预测食品中可能存在的致病菌，以及指导食品加工和储存的控制措施。
大肠菌群的检测方法
⑴吸管：1ml，具有0.1ml刻度；5ml和10ml,具1ml刻度。
⑵培养箱：36±1℃。
⑶均质器。
⑷天平：感量0.1g。
⑸显微镜。
⑹菌落计数器。
⑺冰箱：0～5℃和－15～20℃。
⑻微波炉。
2.培养基和试剂
⑴去氧胆酸盐琼脂（DC）。
⑵75％乙醇。
⑶稀释剂：灭菌生理盐水（0.85％）。
⑷革兰氏染色液。
②固体或半固体食品，以无菌操作取25克样品，放入装有225毫升稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1～2分钟，制成1：10的样品匀液。如样品均质时间超过2分钟，应在均质杯外加冰水冷却。
③稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4……。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15分钟。
3.样品制备
⑴以无菌操作采取有代表性的样品。如有包装，则用75％乙醇在开口处擦试后取样，如不能及时检测，应将冷冻品置于－15℃保存；非冷冻易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃18小时解冻，或在45℃以下15分钟内解冻。
⑵不同食品样品匀液的制备：
①液体食品
以无菌吸管取样25毫升放入盛有225毫升稀释剂的灭菌玻璃瓶内，（瓶内预置适当数量的玻璃珠），以30cm幅度，于7秒内振摇25次（或以机械振荡器振摇），制成1：10的样品匀液。
⑶平板接种
①对于每一样品，选用合适的三个连续稀释度的样品液进行计数。
②分别用灭菌吸管吸取1毫升样品液放入作了适宜标志的灭菌平皿内。每个样品用两个平皿。
③分别加12～15毫升去氧胆酸盐琼脂（45±1℃）到各平皿内。立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。混合方法是将平皿倾斜和旋转。要防止把混合物溅到平皿壁和盖上。凝固后于其表面再覆盖一薄层培养基，同时将去氧胆酸盐琼脂倾注到空白平皿作空白对照。
大肠菌群检测标准
大肠菌群检测通常涉及对肠道微生物的定量或定性分析，以评估肠道健康状况。
这样的检测可能包括对大肠菌群中特定菌种或总体微生物的检测。
标准的具体内容可能因实验室、地区和具体检测方法而异，但以下是一些可能涉及的一般标准或步骤：
1. **样本采集：** 样本通常是从粪便中采集的，因为大肠菌群主要存在于肠道中。
采集的样本需要在合适的条件下保存，并迅速送到实验室进行处理。
2. **DNA提取：** 大肠菌群检测通常通过提取粪便样本中的微生物DNA来进行。
这可以使用特定的DNA提取方法完成。
3. **PCR扩增：** 通过聚合酶链反应（PCR）扩增从样本中提取的微生物DNA。
这可能包括使用特定引物来选择性地扩增大肠菌群的DNA片段。
4. **测序：** 扩增后的DNA片段可能会被测序，以确定其中包含的微生物的种类和数量。
高通量测序技术如16S rRNA基因测序通常用于这一步骤。
5. **数据分析：** 对测序数据进行分析，以识别并定量大肠菌群的不同成分。
这可能包括构建微生物组的组成和多样性图谱。
在具体的实验室和医学实践中，可能有特定的标准和指南，这些标准和指南通常由专业组织或卫生机构发布。
例如，美国微生物学学会（ASM）和世界卫生组织（WHO）可能提供有关微生物学检测的指南。
因此，在进行大肠菌群检测时，最好遵循特定实验室或国家/地区的相关标准。
大肠菌群测定步骤
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
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进入无菌室步骤
1． 进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0.5—1小时。
2． 关灯后0.5小时后放可进入。
3． 进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套
实验步骤
1， 进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。
（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成）
2， 准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。
3， 直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml）
4， 再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml）
5， 再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
6， 再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液
7， 更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3
根每根各1ml）
8， 再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml）
9， 再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养
皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼
脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml
生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。）
10， 把全部作好的放入培养箱中，温度36℃±1℃，大肠24H±2H，
菌落48H±2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中）
11， 梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成
－2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成
－3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法
一样
12， 如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美
兰平板上画之字形然后放入培养箱中36℃，24H±2H 。（接种笔在
每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表
面）
13， 取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复
发酵管中 ，然后再培养36℃±1℃，24H±2H。
14， 再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方
法见标准）
15， 只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才
能断定这根管是不合格。
16， 清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121℃，0.5小时同时
不能放气。