组织免疫荧光应该这么做？
脑组织切片免疫荧光
脑组织切片免疫荧光在生物医学研究中，脑组织切片免疫荧光技术被广泛应用于研究神经元分布和脑功能。
该技术通过使用特异性抗体标记目标蛋白，利用荧光信号显示其在脑组织中的分布情况，从而揭示脑组织的结构和功能。
本文将详细介绍脑组织切片免疫荧光的原理、方法和应用。
一、原理脑组织切片免疫荧光技术基于免疫学原理，利用抗体的高度特异性与抗原结合的能力。
首先，将脑组织固定、去水化，并进行抗原修复，以保持目标蛋白的完整性和可溶性。
然后，将切片与特异性一抗体孵育，使抗体与目标蛋白发生特异性结合。
接着，使用荧光标记的二抗体结合于第一抗体上，二抗体通常被标记有荧光染料。
最后，利用荧光显微镜观察样品，通过检测荧光信号的强度和位置，可以准确地确定目标蛋白在脑组织中的分布情况。
二、方法1. 脑组织获取：选择合适的实验动物，如小鼠或大鼠，将其安乐死后迅速取出脑组织。
2. 脑组织固定：使用适当的固定剂（如4%的乙醛）固定脑组织，保持其形态和结构完整。
3. 脑组织切片：将固定的脑组织切割成适当的厚度，一般为20-50微米。
4. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以增强抗体与目标蛋白的结合能力。
5. 抗体孵育：将切片与特异性一抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗标记：使用荧光标记的二抗体与第一抗体结合，形成复合物。
7. 荧光显微镜观察：将标记好的切片置于荧光显微镜下观察，记录荧光信号的位置和强度。
三、应用1. 神经元分布研究：脑组织切片免疫荧光技术可以标记神经元特定蛋白，如神经元标记抗体，用于研究神经元在不同脑区的分布情况和连接方式。
2. 神经元功能研究：利用特定功能标记抗体，如突触标记抗体，可以揭示神经元的突触形成、突触传递和突触可塑性等功能。
3. 病理学研究：脑组织切片免疫荧光技术可以标记异常蛋白，如淀粉样蛋白，用于研究神经退行性疾病的发病机制和病理变化。
4. 药物筛选：该技术可用于评估药物对神经元功能的影响，如观察药物对突触形成和突触可塑性的调节作用。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项免疫荧光技术是一种常用的免疫学研究方法，可以用于检测和定位抗原或抗体在细胞或组织中的表达和定位。
免疫荧光操作步骤及注意事项如下：步骤1：样品制备1.收集需要检测的细胞或组织样品。
2.如有需要，固定细胞或组织样品以保持其形态和抗原性。
3.如有需要，对组织样品进行切片以便于检测。
步骤2：抗体选择和标记1.根据需要选择合适的一抗和二抗，一抗用于识别目标抗原，二抗用于与一抗结合并携带荧光标记。
2. 选择合适的荧光染料或荧光标记，常用的有荧光素色素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
3.根据供应商指南或经典实验文献中的方法，进行抗体标记。
步骤3：荧光标记试剂的制备1.根据推荐的配方或说明书，在标记试剂的缓冲液中加入合适的荧光染料或荧光标记，并进行充分混匀。
2.如有需要，可以在标记试剂中加入其他辅助试剂以增强染色强度或减少非特异性结合。
步骤4：样品孵育1.将样品均匀分布在载玻片或孵育板上，并使其附着。
2.加入一抗和二抗的混合物，并在暗处孵育一段时间，通常在室温下孵育1-2小时或在4°C下孵育过夜。
3.如果需要，可以在抗体孵育结束后进行染色或共孵育其他标记试剂。
步骤5：洗涤1.在孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤样品，以去除未结合的抗体和其他杂质。
2.洗涤次数根据需要，通常进行3-5次洗涤，每次洗涤时间约5分钟。
步骤6：显微镜观察和成像1.将标本置于显微镜上，并使用荧光显微镜或倒置显微镜观察荧光信号。
2.使用合适的荧光滤光片或滤片盒，选择适当的波长来显现荧光染色。
3.根据需要，使用数字相机或图像分析软件进行图像采集和分析。
注意事项：1.仪器和试剂的准备与操作一定要在无菌和干净的条件下进行，以避免外源性污染或感染的发生。
2.使用抗体和试剂前请仔细阅读供应商提供的说明书，遵守推荐的使用和储存条件。
3.一抗和二抗的选取要慎重，确保其与目标抗原或抗体具有高度特异性。
4.荧光标记试剂的制备要注意在无菌和干净的条件下进行，避免污染或降低荧光标记效果。
组织免疫荧光if 细胞定位
组织免疫荧光if 细胞定位组织免疫荧光IF细胞定位引言：组织免疫荧光（Immunofluorescence，IF）技术是一种广泛应用于生物学研究中的重要实验方法。
它通过利用特异性抗体与目标蛋白结合，并使用荧光标记物进行检测，能够对细胞内的蛋白质进行直接的可视化定位，从而揭示细胞的结构和功能。
本文将介绍组织免疫荧光IF细胞定位的原理、步骤以及常见应用领域。
一、原理组织免疫荧光IF细胞定位的原理基于免疫学的基本原理。
首先，通过免疫原与抗原特异性结合，产生抗原-抗体复合物。
然后，将荧光染料标记在抗体上，使得抗体能够发出荧光信号。
最后，使用荧光显微镜观察细胞的荧光信号，从而确定目标蛋白在细胞中的位置。
二、步骤组织免疫荧光IF细胞定位通常包括以下几个步骤：1. 样品制备：将需要研究的组织或细胞固定在载玻片上，并进行膜通透处理，以便抗体能够进入细胞内部。
2. 抗原暴露：使用特定的方法，如热处理或蛋白酶消化，使得细胞内的目标蛋白暴露在细胞外。
3. 抗体孵育：将特异性的一抗体加入载玻片上，与目标蛋白结合。
4. 洗涤：将载玻片进行多次洗涤，以去除未结合的抗体。
5. 二抗标记：加入荧光标记的二抗体，与一抗体结合形成荧光信号。
6. 洗涤：再次进行多次洗涤，以去除未结合的二抗体。
7. 荧光观察：使用荧光显微镜观察载玻片上的细胞，记录荧光信号的强度和位置。
三、应用领域组织免疫荧光IF细胞定位在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 蛋白质定位：通过标记目标蛋白的特异性抗体，可以直接观察到其在细胞中的定位，从而揭示蛋白质的功能和相互作用。
2. 细胞器结构：通过标记不同的细胞器特异性蛋白，可以研究细胞器的结构和功能，如线粒体、内质网和高尔基体等。
3. 病理学研究：组织免疫荧光IF细胞定位可以用于检测疾病相关蛋白的异常表达和定位，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。
4. 药物筛选：通过观察药物对特定蛋白的影响，可以评估药物的效果和机制，为药物筛选提供重要参考。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
组织免疫荧光步骤
组织免疫荧光步骤
组织免疫荧光步骤啊，那可真是个有趣又有点复杂的过程呢！
先说说样本准备吧，这就好比要给组织来个精心打扮，让它能在后续的“舞台”上大放异彩。
把组织切得薄薄的，就像给它穿上了一件精致的“外衣”。
然后是固定，这可是关键的一步呀！就好像给组织施了一个“定身咒”，让它乖乖保持原来的模样，这样后面的操作才能更准确呀。
接下来就是通透啦，这就像是给组织打开了一扇扇“小窗户”，让那些抗体呀等能更好地进入到组织里面。
抗体孵育呢，就像是给组织安排了一场特别的“约会”，让特定的抗体去找到它的“心上人”——目标蛋白。
清洗的过程也不能马虎呀，要把那些多余的、不相关的都给洗掉，就像给组织洗了一个舒服的“澡”。
最后是观察啦，哇，这可是最让人期待的时刻呢！就像打开了一个神秘的“宝盒”，看到了组织里面那些奇妙的景象。
你想想，通过这一系列的步骤，我们就能看到组织里面那些微小却又无比重要的东西，这难道不是很神奇吗？这就好像我们有了一双特别的“眼睛”，能看到平时看不到的世界。
难道你不想去探索这个神奇的微观世界吗？反正我是觉得超级有趣的啦！不用那些复杂的逻辑词和过渡词，直接就进入到这个精彩的免疫荧光世界里，感受每一步的独特魅力和重要性。
这就是组织免疫荧光步骤，一个充满奥秘和惊喜的过程呀！。
免疫细胞荧光实验步骤
免疫细胞荧光实验步骤
1.准备所需的仪器和试剂，如生物组织摊烤片机、普通冰箱、盖玻片、载玻
片、无水乙醇、3%双氧水、中性树胶、二甲苯、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液等。
2.组织免疫荧光技术操作：将切片置于二甲苯中10分钟，进行脱蜡处理，然
后用100%，95%，85%和75%乙醇分别将切片置于其中，进行洗脱。
之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
3.热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在微波炉高火加热8
分钟，冷却后用PBS缓冲液洗涤3次。
4.加入3% H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。
然后用PBS缓冲液洗涤3
次。
5.封闭：将切片滴加血清并放入湿盒中，室温20分钟。
然后用PBS缓冲液洗
涤3次。
6.孵育一抗：将切片滴加适当稀释的一抗，放入湿盒中，4℃孵育过夜。
7.复染核：用DAPI染色液复染核，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
组织-免疫荧光染色protocol
组织-免疫荧光染色protocol免疫荧光染色技术是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的分布和表达水平。
本文将介绍一种通用的组织免疫荧光染色协议。
实验材料•甲醛（37％）•磷酸缓冲液（PBS）•甲醛溶液（4％）•阻止血清（10%）•抗体（一抗和二抗）•DAPI荧光染色试剂盒•荧光显微镜实验步骤1. 组织采集和固定采集所需组织，配制4％甲醛溶液，将组织浸泡在甲醛溶液中定期搅拌，一般固定2小时，以防止过度固定。
然后用PBS洗涤组织，重复3次，并将组织在PBS中存放，以备进一步处理。
2. 抗体处理将组织切片后加入0.3%的Triton X-100在PBS中处理15分钟，以增强细胞膜对抗体的渗透性。
用PBS洗涤组织，重复3次，每次5分钟。
接下来加入阻止血清阻止非特异性结合，处理1小时。
取出后用PBS洗涤组织，重复3次，每次5分钟。
加入稀释后的一抗，处理一晚，常温摇动。
隔天使用相应的二抗标记，处理1小时，室温摇动。
一定要注意一抗和二抗之间的适当稀释比例。
将组织用PBS洗涤，重复3次，每次5分钟。
3. DAPI染色DAPI荧光染色是为了标记细胞核位置和数量。
将DAPI荧光染色试剂盒配置好后，取出组织切片放置其中处理15分钟，常温摇动。
对切片用PBS洗涤，重复3次，每次5分钟。
轻轻擦去切片周围多余的液体，然后在组织上滴入荧光显微镜增强剂和抑制剂，使标志更加鲜明，定焦、拍照。
注意事项•确保足够的样本。
•抗体的浓度与样本之间的配合需要进行适当的调整。
•将试管区分清楚，不要混淆不同处理步骤的培养基。
组织-免疫荧光染色技术可用于验证前期的基因或蛋白质表达的变化。
它操作简单，高效，精度高，适用于细胞、组织和动物实验样本。
经过发展，它已经广泛应用于免疫测定、免疫组化、免疫染色和免疫检测等在临床医学、分子生物学、细胞生物学等学科领域。
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法
组织免疫荧光间接法是一种检测细胞内蛋白质表达及其定位的重要方法。
该方法通过使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以快速准确地检测出目标蛋白质存在的位置。
该方法的操作步骤如下：
1. 取得样本组织，并将其固定在载玻片上。
2. 使用相应的特异性抗体与荧光素作为探针，将其加入样本中。
3. 让样本与探针反应一定的时间，使其充分结合。
4. 用洗涤液清洗样本，去除未与探针结合的抗体和荧光素。
5. 使用激光显微镜观察样本，在激光的照射下，荧光素会发出荧光信号，以此确定目标蛋白质的存在及其位置。
组织免疫荧光间接法具有以下优点：
1. 高灵敏度：与其他方法相比，该方法可以检测到非常低浓度的目标
蛋白质。
2. 高特异性：该方法使用特异性抗体与荧光素作为探针，可以清楚地
确定目标蛋白质的位置。
3. 快速准确：该方法操作简便，可以在较短的时间内得到结果。
4. 多功能：该方法还可以用于检测不同种类的细胞和组织中的蛋白质。
然而，该方法也存在一些不足之处，例如：
1. 需要耗费大量的抗体，并且抗体需要提前准备。
2. 对于一些表达较低的蛋白质，由于检测的灵敏度限制，结果可能会
产生假阴性。
3. 由于需要使用荧光素，该方法对于一些染料不稳定的样本有一定的
局限性。
总之，组织免疫荧光间接法是一种快速准确的检测蛋白质存在和位置
的方法，可以广泛应用于医学、生物学等各领域的科研中。
但是，我
们在进行该方法时需要注意其局限性，以保证获得准确的结果。
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组织免疫荧光应该这么做？
圣诞节的时候写东西是一种考验啊。
最近三周补了两个实验，都是和图像处理相关的。
幸好，结果都还不错。
所以要感谢谭老师的鼎力相助。
有一个实验做了三次，
•第一次因为细胞背景太脏了，后期荧光太强了，重做。
•第二次因为聚焦的时候是以细胞为主，结果细菌没有照清楚，重做。
•第三次的时候，以为做imaging的那个机器和激光共聚焦的机器一样，可以调整图片，结果后期处理不好。
第三次本来要重做的，但是deadline太近了，就取了第一次的结果，截取了单个细胞做的，结果还不错。
另外一个实验，也是比较曲折的。
第一次铺细胞的时候，用了一瓶很久之前的PBS，结果细胞污染了，所以东西需要现灭现用。
第二次因为没有了做confocal的dish，在深夜十一点到处借，所以要感谢两个小师妹的雪中送炭，最后终于搞定。
第二天又临时找了谭老师帮我拍照片，做三维重建，总之小插曲很多，但所幸最后还是做成了，结果也还不错。
我这个人向来运气还比较好，这次虽然惊险通关，但是以后还需要更好的准备。
下面给大家看看我的三维重建的图片。
因为在word文档中，放不了动画，所以大家将就看看图片吧。
三维重建
这周要开始分享组织的免疫荧光方法了，说实话我的内心是非常怵的，因为没有做过几次。
我希望可以把我有限的知识放在这里，抛砖引玉，引起大家的讨论，然后有更好的解决办法。
组织的免疫荧光之所以难做，是因为组织会有自发荧光，会干扰我们的实验，尤其想在组织上做磷酸化的免疫荧光那更是难上加难。
这次主要讲组织的免疫荧光。
做组织的免疫荧光我做过的和知道的有两种方法，一种是选用冰冻切片的组织，一种是选用石蜡包埋的组织。
两种方法各有优缺点。
所以，石蜡切片的片子需要做抗原修复，需要在柠檬酸盐缓冲液中煮30 min，这样更有效的去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，
充分暴露石蜡切片样品中的抗原表位，从而大大改善免疫荧光染色。
在正式做荧光之前，片子的准备程序如下。
（蓝色为石蜡切片，紫色为冰冻切片）
石蜡切片
•1.4%多聚甲醛4℃固定过夜；
•2.1xPBS洗一次，30min；
•3.30%乙醇1小时,摇床上慢摇，下同；
•4.50%乙醇1小时；
•5.70%乙醇1小时；
•6.85%乙醇1小时；
•7.95%乙醇1小时；
•8.正丁醇1小时（打开65℃温箱溶蜡）；
•9.石蜡65℃中处理3小时，每隔1小时换石蜡一次，包埋。
•10.切片
冰冻切片
•1.4%多聚甲醛冰上固定2小时；
•2.1xPBS洗一次，5min；
•3.30%蔗糖沉降2小时；
•4.OCT包埋。
组织和细胞一样有些常用的固定液。
根据Bencroft的分类法，可分为四类：
•Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
•Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。
•Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。
•Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。
•最常使用的是甲醛和多聚甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到，做比如电镜的固定剂一般用2.5%戊二醛固定。
而对于常用的甲醛及多聚甲醛固定液，各个的优缺点还是有些不一样的。
•10%甲醛：对组织渗透性强，固定均匀。
对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
但经酒精脱水时有较大的收缩。
能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，长期用其固定的组织使组织变为酸性，不利于染色，特别是细胞核的着色。
经自来水冲洗6~24小时后，可以使其酸碱中和，并减少结晶。
•4%多聚甲醛：对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好。
固定的时间不宜太长，以24小时以内为宜，适用于免疫组织化学染色。
•我自己做的比较多的是石蜡切片的。
先给大家看看我们课题组做的石蜡切片的肺组织免疫荧光。
下面是石蜡切片的免疫荧光步骤
（左边为切片机，右边为漂片机）
•1.先检查切片机各部位是否已固定，刀片是否锋利（最好用新的刀片）
•2.切片时要注意速度，太快易出现褶皱，这里可以先将样品置于冰上冷却哈；
•3.切片时发现纵向刀痕时要停止切片，清除刀片上的那些碎屑；
•4.展片水温控制在42℃左右，过高蜡片弥散，过低蜡片不能展
开；
•5.新换的水需要先将水加热到42度才能放入切片，否则水温上升后易出现微小气泡，影响贴片；
•6.展片槽水位应较高，防止玻片触底带起气泡，贴附于蜡片下影响贴片；
•7.展片时间要适中，过短则蜡片不能完全展开，过长则蜡片弥散，不利于贴片；
•8.可用普通载玻片展片；
•9.切片样品置于切片盒中敞开晾干后室温保存一段时间，我最长是两个月。
建议长期保存还是放入蜡块中。
•因为最近没有做相关的实验，所以没有拍图片，下次做的时候补上。
•10.抗原修复：将切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸橼酸液修复液中，微波炉中火加热6分钟至微微沸腾，再用中低火力维持10分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟（直接煮沸6分钟×4次）。
•11.PBS浸洗2分钟X2次后，加0.2%tritonX-100透膜15分钟（如果你切片比较薄的话，也可不透膜，反正细胞已经被切开）。
但如果是做细胞膜表面的蛋白，那就不要透膜了。
•12.PBS 2分钟清洗2次。
•13.用滤纸擦去标本外的PBS，滴加封闭血清（最好选用二抗同来源的血清，二抗一般来自山羊，所以可以选用山羊血清。
）在湿盒中室温封闭1h。
•14.用滤纸擦去封闭液，PBS清洗两次。
•15.滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4℃孵育过夜。
•16.滤纸吸去一抗，或者回收一抗。
•17.PBS 3分钟×5次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•18.滴加荧光二抗室温置湿盒中避光孵育1小时，此时可在荧光显微镜下迅速观察是否染上，以确定终止时间。
•19.用PBS 3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。
•20.滴加 DAPI避光孵育15分钟。
•21.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•22.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
冰冻切片
冰冻切片机
注意事项：
•1.样品提前两小时从液氮中放在-20℃平衡样品温度；
•2.冰冻包埋OCT液于室温呈液态，-15℃以下呈固态，如不马上切片，保存于-80度冰箱待用；
•3.载玻片应置于室温，若长时间置于-20℃则组织将不能贴附;
•4.切片：切片厚度40um，切片直接放在室温的PBS中，OCT会自动溶解于PBS中；
•5.封闭过氧化物酶体：3%H2O2，（1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇）；
•6.PBS 5分钟X3次；
•7.高温抗原修复：95度水浴，柠檬酸盐（PH=6.0）修复液，6min。
结束后放置20-30min使温度降低；（此步骤可选用，有相熟的同学做的时候用了这一步，结果也挺好的）；
•8.PBS 5分钟X3次；
•9.透膜，0.2%Triton 室温20 分钟；
•10.封闭：10%山羊血清，1h；
•11.一抗孵育4度过夜；
•12.PBS 5分钟X3次；
•13.孵育二抗，室温1h；
•14.PBS 5分钟X3次；
•15.滴加 DAPI避光孵育15分钟。
•16.用PBS 5分钟×2次，用滤纸擦去标本外的PBS。
•17.用含抗荧光淬灭剂的封片，37度烘干保存。
今天就讲到这里了，谢谢大家。