大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
感受态细胞的制备和质粒的转化
感受态细胞的制备
• 实验目的：学习感受态细胞的制备过程 • 实验材料：大肠杆菌菌株DH5或DH10B • 实验原理：电转化法是利用瞬间高压在细胞上打
孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生 长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少 的导电离子。转化效率为109～1010 转化子/µg DNA； • 对于热激法，是利用冰冷的CaCl2/TSS处理对数 生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受 态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 ～ 107转化子/µg DNA。
击；
• 立即加1ml SOC培养基到转化杯中重悬细胞； • 将细胞转入合适的培养管中37ºC培养1小时； • 吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板； • 37ºC培养过夜，观察结果。
• 附注：
• 利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转 化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不 得超过105个菌落），同时37℃培养不应超 过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可 将－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活 菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉 素敏感的卫星菌落的出现。
打匀，使细胞重新悬浮； • 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）
后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实 验步骤
– 前夜接种受体菌（DH5或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇 床培养过夜；
– 取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养 至OD600＝0.6（约2.5-3小时）；
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
质粒的转化及转化子的鉴定
• 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建 的重组子导入细菌的过程。将连接产物转 化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖， 便于后续分子操作。可以采用多种方法筛 选和鉴定目的克隆。
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在探究感受态细胞的制备和转化过程，以及相关技术操作和注意事项。
二、实验步骤
1. 制备感受态细胞
（1）取出培养皿内的细胞，用PBS洗涤3次；
（2）将洗涤后的细胞加入含有5μM Calcein-AM的PBS中，放置于37℃孵育箱内30分钟；
（3）取出孵育后的细胞，用PBS洗涤3次，即可得到感受态细胞。
2. 转化感受态细胞
（1）将制备好的感受态细胞加入含有荧光素酶底物的培养基中；
（2）放置于37℃孵育箱内15分钟左右；
（3）观察荧光素酶底物是否被转化为荧光素，并记录转化效率。
三、实验结果与分析
经过制备和转化处理后，观察到感受态细胞成功地被转化为荧光素，
并且转化效率较高。
这表明该方法可以有效地制备和转化感受态细胞，并且具有较高的可靠性和重复性。
四、实验注意事项
1. 实验过程中应注意无菌操作，避免细菌和其他杂质的污染；
2. 在制备感受态细胞时，应注意洗涤次数和荧光素酶底物的浓度，以
确保制备的感受态细胞质量和转化效率；
3. 在转化感受态细胞时，应注意荧光素酶底物的加入量和反应时间，
以确保转化效率和荧光素的稳定性。
五、实验结论
本实验通过制备和转化处理，成功地得到了荧光素转化后的感受态细
胞，并且转化效率较高。
这为进一步研究感受态细胞在生物学领域中的应用提供了可靠的技术支持。
实验五、大肠杆菌感受态细胞制备
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化 试剂 1、LB液体培养基及不含Amp的LB平板 Amp的LB平板 平板： 2、含Amp的LB平板：熔化的LB固体培养基在 600C左右时加Amp至50-100µg/ml. 混匀后 铺板。 50mmol/L 溶液: 3、50mmol/L CaCl2溶液: 0.28g CaCl2的定容 于1000ml蒸馏水，灭菌。 15%甘油的 甘油的50mmol/L 溶液: 4、含15%甘油的50mmol/L CaCl2溶液: 0.28g CaCl2，加50ml蒸馏水,加15ml甘油，定容于 1000ml蒸馏水，灭菌。
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化
实验五、 实验五、大肠杆菌感受态细胞制备和转化 一、 概述
在自然界条件下，很多质粒都可通过细菌结合作用 转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体上，一 般缺乏转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一 个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转 移进受体细胞，需诱导受体细胞产生一种短暂的感受 态以摄取外源DNA. 转化（transformation） 转化（transformation）是将外源DNA分子引入受 体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统 缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突 变体，它可以容忍外源DNA分子进入细胞体内并稳定地 遗传给后代。常用的细菌菌株如：DH5α, JM109等。
实验一 感受态制备及转化
（二）转化及复苏：
1. 取 100 μL感受态细胞，加入重组DNA 20 μ L （50ng)； 取 100 μL感受态细胞，加入20 μL无菌水（阴性对照1）； 取 100 μL感受态细胞,加入对照DNA 20 μ L （阴性对照2） 用枪头混匀，冰上放置20min。 阴性对照的目的？ 2. 420C循环水浴热激90秒 3. 冰浴2分钟 4. 每管加800μ L LB液体培养基，370C慢摇40min（120～140rpm） 5. 40C，5000rpm离心2min，弃去600μ L，取20～50μ L菌液，加40μ L Xgal和4μ L IPTG，混匀后涂布在含Amp的培养皿中 6. 倒置培养过夜（ 370C）
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 及质粒DNA的转化
一、实验目的 学习大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及转化子鉴定的 基本原理和操作技术。 二、实验原理
感受态细胞(Competent Cells)：受体细胞经过一些特殊方
法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，能允许 外源DNA分子进入。 转化(Transformation)：将外源DNA分子引入受体细胞,使之 获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、
6. 菌体加入预冷的0.1 mol/L的CaCl2 1.0mL，轻吹并悬浮细胞，冰上10min； 7. 离心 5000rpm ，40C，5min，去上清； 8. 用冰预冷的0.1 mol/L的CaCl2 100μ L用枪轻吹悬浮细胞，冰上操作； 9.此为感受态细胞，若储存则需加入15～30%甘油，可在-700C或-200C冻存。
四、实 验 流 程
（一）感受态细胞的制备： 1. 预培养：接一单菌落到3mL LB培养基中，370C、190rpm振荡培 养过夜； 2. 取 0.4mL预培养菌液转移到含40mL LB液体培养基的锥形瓶中，
25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1. 掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。
2. 熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。
【原理】1. 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源 DNA 发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（ transformation ）特指以质粒 DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
转染（ transfection ）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。
未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源 DNA 的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
重组 DNA 转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源 DNA 进入细胞内。
本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli. DH-5α细胞 , 使E.coli. DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来 DNA （本实验中的质粒 DNA 为 pUC-18 ）能力增加，其原理为当细菌处于0 ℃ ， CaCl 2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNAase 的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃ 短时间热冲击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。
2. 转化大肠杆菌的筛选由于 pUC-18 （如图）含有 Amp r （氨苄青霉素抗性）基因便具有在含 Amp 培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入 pUC-18 的E.coli. DH-5α细胞，不具有 Amp r 基因，在含 Amp 的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。
进一步将转化菌涂布在含IPTG 和 X-gal 的 LB 平板上，由于 pUC-18 还带有一段大肠杆菌β- 半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的启动子及其编码α- 片段的 DNA 序列，此结构成为lacZ ＇基因，在 lacZ ＇基因中的靠近 5 ＇端有一段多克隆位点（ MCS ），而大肠杆菌含有β- 半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样 lacZ 基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α- 互补。
大肠杆菌感受态细胞制备
超净工作台
速离心机等
四、实验操作
1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～
5ml LB液体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，
37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～ 30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并 转装到1.5 mL离心管中； 3、培养物于冰上放置20min； 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰 冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟；
7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在 4℃放置12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占 总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心 管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。
五、思考题
制备感受态细胞时，应特别注意哪些环节？
三、实验材料与设备
1、用品与与仪器： 超净工作台、恒温培养箱、移液器、微型离心管等、台式
冷冻高速离心机、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒。
镊子、试管三角瓶、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、 吸 水纸，一次性塑料手套等； E.coli DH5α受体菌(R-M-)， pGEX-4T-2质粒(Ampr)。
四、实验操作
5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min；
6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 µ L冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置 片刻后，即制成了感受态细胞悬液；
实验11、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
实验十一、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞【实验目的】掌握质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α，pUC18质粒【实验步骤】1、取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min 待其完全溶解。
实验三 大肠杆菌感受态细胞的制备
实验三大肠杆菌感受态细胞的制备和转化内容提要采用CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞。
碧云天生产的一步法感受态细菌制备试剂盒(One Step Competent Cell Preparation Kit) 是一种用于大肠杆菌感受态细菌快速制备的试剂盒。
一步法感受态细菌制备试剂盒是在经典的TSS法的基础上进行适当改良而成，既继承了TSS法的快速和简便，又在此基础上提高了感受态细菌的转化效率和易操作性。
使用本试剂盒可以使感受态效率达到106以上。
不仅可以转化质粒，而且可以转化普通的连接产物。
另外，对细菌的培养条件要求比较宽松，培养的细菌只要处于对数期内就可以使用本试剂盒制备感受态细菌。
本实验要求：1、掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。
原理将质粒导入大肠杆菌或其他受体细胞内的过程叫转化(Transformation)。
受体细胞经过一系列处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许质粒分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
与电击法等其它方法相比，CaCl2制备法不但简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，若制备出的感受态细胞暂时不用时，即可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存半年以上，因此CaCl2法是分子生物学研究中最受欢迎的方法。
一、主要仪器、材料和试剂1. 仪器移液器，高速冷冻离心机，台式离心机，摇床。
2. 实验材料大肠杆菌E. coli DH5α菌株，1ml枪头，10ml离心管。
3. 试剂（1）1 mol/L CaCl217.9g CaCl2·2H2O溶于100ml水中。
（2）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10g酵母提取物（Yeast extract）5 gNaCl 10g溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温高压灭菌20分钟。
（3）LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高温高压灭菌。
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
引言：
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：
本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：
1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：
1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态
细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选
出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：
通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠
杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
通过转
化实验，我们可以将感兴趣的基因片段导入到大肠杆菌中，进一步研究其功能
和调控机制。
然而，值得注意的是，在转化实验中，目标DNA的选择和处理非常重要。
目标DNA的长度、浓度和纯度都会影响转化的效率和成功率。
此外，转化过程中的
温度和时间也需要精确控制，以确保细胞膜的完整性和DNA的稳定性。
结论：
通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
这个实验为后续的基因表达研究和遗传工程应用奠定了基础。
通过进一
步的实验和分析，我们可以深入研究细菌的基因表达和遗传变异，为生物学研
究和应用提供更多的可能性。
参考文献：
[1] Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology, 1983, 166(4): 557-580.
[2] Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.。