位点专一性重组的核苷酸序列
分子生物学思考题答案
1.原核生物DNA具有哪些不同于真核生物DNA的特征？真核生物：①真核基因组庞大。
②存在大量的重复序列。
③大部分为非编码序列(>90％)。
④转录产物为单顺反子。
⑤是断裂基因，有内含子结构。
⑥存在大量的顺式作用元件(启动子、增强子、沉默子)。
⑦存在大量的DNA多态性。
⑧具有端粒(telomere)结构原核生物：①基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少。
②主要是单拷贝基因，只有很少数基因〔如rRNA基因〕以多拷贝形式存在。
③整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；④几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态1.试述基因克隆载体进化过程。
①pSC101质粒载体，第一个基因克隆载体②ColE1质粒载体，松弛型复制控制的多拷贝质粒③pBR322质粒载体，具有较小的分子量（4363 bp）。
能携带6-8 kb的外源DNA片段，操作较为便利④pUC质粒载体，具有更小的分子量和更高的拷贝数⑤pGEM-3Z质粒，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ'基因⑥穿梭质粒载体，由人工构建的具有原核和真核两种不同复制起点和选择标记，可在不同的寄主细胞内存活和复制的质粒载体⑦pBluescript噬菌粒载体，一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体2.试述PCR扩增的原理和步骤。
对比DNA体内复制的差异。
原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸、合适的Mg2+浓度和实验中提供的引物序列合成新生的DNA分子。
步骤：①将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（>94℃）环境下加热1分钟，使双链DNA变性，形成单链模板DNA②降低反应温度（退火，约50℃），约1分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上③将反应混合物的温度上升到72℃左右保温1-数分钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'-端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互补链与体内复制的差别：①PCR不产生冈崎片段②在高温条件下反应，不需要DNA解旋酶③PCR可经过多个循环④在体外进行，可调控第六章1.基因敲除原理：又称基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点方法：高等动物基因敲除技术，植物基因敲除技术2.完全基因敲除和条件型基因敲除完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动植物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除3.基因定点突变原理：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA 调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等方法：重叠延伸技术和大引物诱变法第七章1.乳糖操纵子的正负调控（—）阻遏蛋白的负调控①当细胞内有诱导物时，诱导物结合阻遏蛋白，此刻聚合酶与启动子形成开放式启动子复合物转录乳糖操纵子结构基因。
遗传重组(一)
遗传重组(一)(总分：305.50，做题时间：90分钟)一、填空题(总题数：10，分数：40.50)1.真核生物的反转座元(retroposon)根据其结构和组成可以分为两大家族： 1和 2。
（分数：3.00）解析：病毒类超家族非病毒类超家族2.一般性重组的主要中间体是 1，也用它的发现者名字命名为 2。
（分数：3.00）解析：交叉链互换 Holliday连接3.重组能产生 1中没有的新的类型。
（分数：1.50）解析：亲本4.细菌中的转座成分可分为 1、 2及TnA转座元家族和可转移的噬菌体等。
（分数：3.00）解析：插入成分复合转座元5.狭义的遗传重组是指DNA分子内断裂一复合的基因交流，可分 1、 2、 3和 4。
（分数：6.00）解析：同源重组位点特异性重组转座作用异常重组6.基因重组有时会出现异常分离比，这是由于基因转变造成的，目前能较好解释基因转变起源的理论是1。
（分数：1.50）解析：杂种DNA模型7.转座因子的自身序列的两侧各有一个1序列存在，转座完成时，常在原靶点DNA两侧各出现一段2序列。
（分数：3.00）解析：末端倒转重复同向重复8.原核生物有几种转位因子，如 1、 2、 3等；真核生物也有一些转位因子，如 4、 5、 6等。
（分数：9.00）解析：插入序列复合转座元 TnA转座元家族酵母的Ty成分果蝇的copia成分玉米的Ac-Ds成分9.基因转换是通过 1之间重组而实现的，其中重组体经拆分后形成 2，再经过 3后产生基因转换。
（分数：4.50）解析：异源双链异构化分支迁移10.RecA蛋白质有多种与重组有关的活性，主要包括： 1、 2、 3和 4。
（分数：6.00）解析：单链DNA结合活性双链DNA结合活性 NTP酶活性促进互补单链复性的能力二、判断题(总题数：15，分数：15.00)11.转座(transposition)是转座元拷贝从基因组的一处转移到另一处的过程。
( )（分数：1.00）A.正确B.错误√解析：12.玉米的Ds-Ac转座因子属于非复制型和保守型转座。
第七章遗传重组
图 23－8 Holiday 重组模型。
b
12
B 3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’ 移动联会 3’ 5’
5’ 3’ 交叉连接
3’ 5’ 5’ 3 链交叉
B 3’ 5’ 5 3’
点移动
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
b a
(10)
A
B
A B
b a
(11) A
B
a
b
24
4、RecA蛋白的作用方式
RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷 酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP），RecA 蛋白即被活化； 活化的RecA将双螺旋解旋和分离，同时试图将其结合的单 链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。 一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继 续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部 分）。 新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。
A
B
a
b
b a
A
b
a
B
A
b
a
B
图 23－8 Holiday 重组模型。
7）Holliday中间体拆分 （二次切断），可以有 两种情况： Holliday中间体二次切 割发生在原断裂的两条 单链上，称为非交换型 重组，双链中存在异源 区域(图10, 11, 12)； Holliday中间体二次切 割发生在另外两条单链 上，称为交换型重组 (图10’, 11’, 12’)。
25
26
RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会
参与联会的DNA分子可以 是多种不同的形态分子 的组合； 但无论那种组合，其中 一个分子是单链分子， 或者有足够长度的单链 区。
分子生物学名解——自己整理
分生考点Copyright by 孙倩1.顺式作用元件（cis-acting elements）: 存在于基因内外，与基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特定的DNA序列称为顺式作用元件。
2.启动子(promoter)：真核基因的启动子指的是RNA聚合酶识别、结合的基因转录调控区中启动基因转录的一段特异DNA序列，包含一组转录调控功能组件，其中每一个功能组件的DNA序列约7~20 bp。
3.典型的启动子核心序列（core sequences）是在转录起始位点上游25~35 bp处，有一保守的TATA序列，被称为TATA盒（TATA box），真核细胞的TATA盒多为TATAAAA序列。
TA TA盒与原核细胞的启动子一样，对RNA聚合酶II的转录起始位点起定位作用。
4. 有一些编码蛋白质基因不含TA TA盒或起始子，多在起始位点上游约100bp内含有20~50个核苷酸的CG序列，被称做CpG岛（CpG island）。
此种基因可有多个转录起始点，可产生含不同5’末端的mRNA。
这些基因大多为低转录基因，编码中间代谢酶的管家基因。
5.启动子上游元件（promoter-proximal elements, 或upstream promoter elements）是一些位于TATA盒上游的DNA序列，与调节蛋白结合，调节通用转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合，以及转录起始复合物的形成，从而决定基因的转录效率与专一性。
常见的序列是CAA T盒和GC盒。
6.一些真核细胞基因含有另一种启动子元件，称为起始子(initiator,Inr)，决定启动子的强度。
7.增强子（enhancer）：是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA 序列。
在酵母中，被称为上游活化序列（upstream activator sequences, UASs）。
增强子的作用通常与其所处的位置和方向无关。
某理工大学《遗传学》考试试卷(82)
某理工大学《遗传学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（55分，每题5分）1. 在一个自由授粉的植物遗传平衡群体中，已找到矮源植株（dd）频率约占1，该群体中含d的杂合体所占比例为0.01。
（）答案：错误解析：根据遗传平衡定律，d的基因频率为：0.1，D的基因频率为：0.9。
因此Dd杂合体所占比例为：2×0.1×0.9＝0.18。
2. 生物的性别只取决于性染色体，而不属于常染色体遗传。
（）答案：错误解析：有些生物例如果蝇，其性别是由X染色体与常染色体组（A）数的比例决定的，Y染色体不参与性别决定，而是控制雄性个体的育性。
果蝇早期胚胎细胞的性指数≥1.0时，细胞中X染色体的表达产物浓度高，激活雌性特异基因，使胚胎发育为雌性个体；若早期胚胎细胞的性指数＜1.0时，细胞中X染色体的表达产物浓度低，激活雄性特异基因，使胚胎发育为雄性个体。
3. X染色体数与常染色体组数之比称性指数，所有XY型生物都由性指数的大小决定性别的状态。
（）答案：错误解析：人类属于XY型性别决定，性别是由精子是否带有Y决定的，有Y则为男性，雄是异配性别，可以产生两种不同的配子，雌是同配性别，只能产生一种配子；果蝇的性别是由X染色体与常染色体组（A）数的比例决定的，Y染色体不参与性别决定，而是控制雄性个体的育性。
4. 三体型是人类最常见的染色体数目畸变类型。
（）答案：正确解析：5. F因子通过同源性重组插入到染色体中并形成Hfr菌株。
（）答案：正确解析：F因子整合在供体染色体基因中，成为高频重组菌株Hfr。
6. 有丝分裂中期，由于纺锤体机制被部分破坏，可形成三体型或单体型子细胞。
（）答案：正确解析：纺锤体机制被部分破坏，部分同源染色体不能分离，可形成三体型或单体型子细胞。
分子生物学课件：第21章 DNA重组及重组DNA技术
载体有哪些？目的基因分离获取的四种方法？基本 步骤？
DNA重组（DNA recombination）是指不 同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段 的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。
重 组 DNA 技 术 （ recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以 上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖 形成新DNA分子的过程。
3´ 5´ 拼 接
重
组
5´
5´3´ 体
3´
3´ 5´
内切酶
5´3´
(ruvC)
3´5´
3´ 5´
5´
5´ 3´
3´
DNA
片
连接酶 3´ 5´
段
5´ 3´
重
组
3´
体 5´
5´
3´
二、位点特异重组是发生在特异位点 间的DNA整合
➢ 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异 位点间发生的整合。
一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重组 （ general recombination ） 。 是 最 基 本 的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在 两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片 段的交换。
免
间插DNA
疫 球
V片段
RSS
RSS J片段
蛋
单链切开 RAG1 RAG2
白
OH
第一节
自然界DNA重组和基因转移
华中农业大学生物化学本科试题库 第14章 DNA的复制、修复与重组
第14章 DNA的复制、修复与重组单元自测题（一）名词解释1、复制2、半保留复制3、前导链与滞后链4、半不连续复制5、冈崎片段6、光复活7、切除修复8、重组修复9、DNA突变 10、同源重组 11、特异位点重组 12、转座因子（二）填空题1、DNA复制时，前导链的合成是的，复制方向与复制叉移动的方向，后随链的合成是，复制方向与复制叉移动的方向。
2、在真核细胞的DNA切除修复过程中，受损伤的碱基可由和切除，并由和共同作用将缺失的碱基补上。
3、在线粒体中的环状基因组是通过合成方式复制。
滚筒式复制的特点是由。
4、DNA复制和RNA的合成都需要酶，在DNA复制中该酶的作用。
5、DNA聚合酶Ⅰ是一个多功能酶，其主要的功能是，和作用。
6、DNA聚合酶Ⅲ的活性使之具有功能，极大地提高了DNA复制的保真度。
7、染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为。
8、在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为。
9、如果DNA聚合酶出现错误，会产生一对错配碱基，这种错误可以被一个通过甲基化作用来区别新链和旧链的特别系统进行校正。
10、可被看成一种可形成暂时单链缺口（Ⅰ型）或暂时双链缺口（Ⅱ型）的可逆核酸酶。
11、在大肠杆菌中发现了种DNA聚合酶。
DNA修复时需要DNA聚合酶。
12、在DNA修复过程中，需要第二种酶，，作用是将DNA中相邻的碱基起来。
DNA聚合酶具有外切核酸酶的活性。
有两种外切核酸酶活性，它们分别从和降解DNA。
DNA聚合酶只有外切核酸酶活性。
13、途径可以切去任何造成DNA双螺旋大片段改变的DNA损伤。
14、在中，基因交换发生在同源DNA序列间，最常见是发生在同一染色体的两个拷贝间。
15、在交换区域，一个DNA分子的一条链与另一个DNA分子的一条链相互配对，在两个螺旋间形成一个。
16、大肠杆菌的染色体配对需要；它与单链DNA结合并使同源双链DNA与之配对。
17、一般性重组的主要中间体是，也用它的发现者命名为。
第六章遗传重组
1
主要内容
概述 6.1 6.2 6.3 6.4
同源重组 位点专一性重组 转座重组 异常重组 （了解）
2
概述：
遗传重组是生物界普遍存在的遗传现象。 进行有性生殖的物种在减数分裂过程中发生重组。 若发生了物理交换，则遗传物质产生新的排列组合。 生存→变异→突变，重组 适应环境、加速进化；损伤修复等。
链上，因而出现很低的转化频率。
敲除校正基因可使受体菌变为高转化效率菌。
45
P125
必须掌握
同源重组的功能和基本条件
同源重组的生物学功能： （1）对维持种群的遗传多样性有重要意义 （2）在真核生物中，同源重组使染色体产生瞬间物理连接， 保证了减数分裂中染色体的正确分离； （3）有助于损伤DNA的修复。 同源重组的发生应具有以下基本条件： （1）在交换区具有相同或相似的序列；
33
A A a a
粪壳菌的子囊孢子因在减数 分裂中或减数分裂后8孢子 中发生不同的修复作用，而 产生多种不同的分离比。
A A
a a
野生型：突变型 分离比有6：2；
4：4；
2：2：2：2等
34
（6）双链断裂修复模型
目前证明通过两个DNA分子之中的一个双链 断裂引发重组是个常见的机制。 该模型认为参与重组的两个DNA分子之一的 两条链被核酸内切酶切断，然后在核酸外切 酶作用下产生3’单链黏性末端。 两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋的 同源区，臵换“供体”双螺旋的一个单链而 形成一段异源双链DNA，并同时产生一个D 环（D-loop）。
5´ 3´
3´
5´
5´ 3´
5´ 片
5´
3´
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根据切除修复原理，基因转变的几种类型产生的 分子机制可以归纳如下（图8-8）。 • 1．两个杂种分子均未校正（图8-8A）复制后 出现异常的4＋∶4g（或3∶1∶1∶3）的分离。 • 2．一个杂种分子校正为+，或校正为g时，则 发生另一种类型的半染色单体转变，前者修复 后出现5∶3的分离，后者子囊孢子的异常分离 比为3∶5（图8-8B）。
HOLLIDAY
模 型
环状DNA分子的重组
两个环状DNA分子配对、断裂、重 接形成“8”字型结构中间物，根据切割 的位置不同，可分别形成两个亲本环、 大的单体环或者是滚环结构。也可以形 成“χ” 结构。来自三、基因转变及其分子机理
（一）异常分离与基因转变 1938，H.Vinkle 基因转变(gene conversion)：一个基因转变为 它的等位基因的遗传学现象。（源于基因内重 组） pdxp：酸度敏感的VB6需要型 pdx： 酸度不敏感的VB6需要型
第七章
遗传重组
遗传重组
遗传重组：造成基因型变化的基因交流过程。 发生：减数分裂性细胞内，体细胞 地点： 核基因间，叶绿体基因间，线粒体基因间， 重组子间； 前提条件：不同基因型的遗传物质彼此能够转移。 作用： 保证了遗传多样性,为选择奠定了物质基础,是 生物得以进化发展，与突变一起是变异的来源
遗传重组主要类型：(依据对DNA序列和 所需蛋白质因子的要求) 同源重组 位点专一性重组 异常重组 其共同点是双股DNA间的物质交换，但发 生的情况不同。
E：交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本 DNA分子间造成一大段异源双链DNA （ Holliday结构） F：E和F相同； G：绕交联桥旋转1800； J：形成Holliday异构体； I、通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切， 则形成非重组体，若上下切则形成重组体。 由上可知：无论Holliday结构断裂是否导致 旁侧遗传标记的重组，他们都含有一个异源双 链DNA区。
• 3．两个杂种分子都被校正到+（或g）时（图 8-8C），修复后出现6＋∶2g（或2＋∶6g）的 异常分离。这便是出现染色单体转变的起因。 • 4．当两个杂种分子都按原来两个亲本的遗传 结构进行修复时，则减数分裂4个产物恢复成 G-C、G-C、A-T、A-T的正常配对状态，子囊 孢子分离正常，呈现4＋∶4g的结果，如图88D所示。
Robin Holliday于1964年提出了重组的杂和DNA模型，
又称Holliday模型。该模型对重组过程的解释如下： A、同源的非姐妹染色单体联会； B：同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链， 在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开； C：切开的单链交换重接; D：形成交联桥结构；
Mitchell： + pdxp
孢子对 1 2
x
子囊
pdx +
3
4
1
2
+ pdxp
++
pdx +
pdx +
++
+ pdxp
pdx +
+ pdxp
3
4
+ pdxp
pdx +
++
+ pdxp
pdx +
pdx +
++
pdx +
粪生粪壳菌(Olive):
GA × ga
A A a a A A a
GA 非重组孢子对 Ga ga GA gA 重组孢子对，一 个孢子基因转变
2、几个概念：
重组核心：两个DNA分子的连接 连接分子/接合分子： 重组接点/重组结合点： 杂种DNA/异源双链DNA： 分支迁移：重组接点沿双链移动 交互重组：一条亲本双螺旋分子和另外 一条亲本 双螺旋分子共价连接，中间有一端异源双链区，这种 重组称为交互重组。
二、同源重组的Holliday模型
重组孢子对，一 个孢子基因转变
a
ga非重组孢子对
（二） 基因转变的类型 染色单体转变：2：6或6：2分离比
减数分裂4个产物中，一个出现基因转变
半染色单体转变：5：3；3：1：1：3
减数分裂四个产物中，一个或2个的一半出现基因转变
减数分裂后分离：等位基因的分离发生在减数分 裂后的有丝分裂中
（三）基因转变的分子机制
DNA精确切割
连接
DNA不失去、不合成、不交换对等部分（有时是一
个DNA分子整合到另一个DNA分子中，又称整合式重
组），需要位点专一性的蛋白质因子参与。
例如： λ噬菌体DNA通过其attP位点和大肠杆菌 DNA的attB位点之间专一性重组而实现整合过
程。条件：一段15bp的同源序列和位点专一性
的蛋白质因子（不能催化其他任何两条不论是 同源的还是非同源序列间的重组，从而保证了 λ噬菌体整合方式的专一性和高度保守性，因 此又称保守性重组。）而且这一重组不需要 RecA 蛋白质的参与。
三、异常重组
完全不依赖于序列间的同源性而使一段 DNA序列插入另一段中，但在形成重组
分子时往往依赖DNA复制而完成重组过
程，因此又称复制性重组。
第二节 同源重组的分子机制
一、重组双方DNA分子的断裂与重接
1. 证据： 1961，M.Meselson and J.J.Wergle两个双标记λ噬 菌体感染大肠杆菌。 同时感染 (c.mi)λ噬菌体1 13C和14N “重”链 大肠杆菌 12 14 (+.+) λ噬菌体2 C和 N “轻”链 重链 重链和轻链 轻链 CsCl密度梯度离心 子代噬菌体
第一节 遗传重组的类型
一、同源重组/普遍性重组
1.同源重组：依赖大范围的DNA同源序列的联会， 重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。 例：同源染色体非姐妹单体交换；细菌的转化、转导、 结合；噬菌体的重组…
需要重组的蛋白质参与；（例如.大肠杆菌： RecA蛋白、RecBC蛋白） 蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高； （存在重组热点和序列长度的影响） 真核生物染色质的状态影响重组的频率。
2.条件：2个DNA分子序列同源，且同源 区域越长越有利。 3.功能： A：维持种群的遗传多样性； B：有助于DNA的损伤修复； C：使真核生物产生第一次减数分裂中 染色体正确分离到子细胞至关重要的瞬间 物理连接。
二、位点专一性重组/保守性重组
原核生物中最为典型 特点：
供体与受体的特定位点的短同源序列之间。