融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化
重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达
重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华【摘要】Because of original human interferon α-2b ( huIFNα-2b) gene sequence in prokaryotic expression system always with low level of target protein, the code of huIFNα-2b gene was mutagenize according to usage in prokaryotic organism without changing the amino acid compsition. The mutated gene of huIFNα-2b was fused to the secretion signal coding sequence of Escherichia coli heat-stable enterotoxin Ⅱ ( ST Ⅱ ) . Primers was designed for introducing fitting restriction sites to the fusion gene, then cloned into vectors pCSE,pET-22b and pPAK4L. They have constitutive expression promoter, T7 promoter and phoA promoter individually. With fusion gene,pCSE expressed huIFNα-2b protein in low yield in different hosts , nearly 50％ of the protein can be secreted. Induced by IPTG, pET-22b gets high level expression of huIFNα-2b in E. coli BL21 , but the ST Ⅱ signal can not be cutted efficiently. In low-phosphate growth media. E. coli W3110 with vector pPAK4L which contains the target gene synthesized approximately 20μg huIFNα-2b/ml A550 unit of cells , and about 30％ of it can be secreted into periplasimic space.%人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变.将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIF Nα-2b基因融合并于信号肽5'端和huIFNα-2b基因3'端引入合适的酶切位点.融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子.融合基因在载体pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌.在E.coli BL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除.含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coli W3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至20μ/g/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)003【总页数】5页(P58-62)【关键词】人干扰素α-2b;STⅡ信号肽;分泌;大肠杆菌 W3110【作者】卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华【作者单位】安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088【正文语种】中文【中图分类】Q789人干扰素α-2b(huIFNα-2b)成熟蛋白是一种由164个氨基酸构成的多肽,在一定诱导因素的作用下由人体白细胞产生,具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞生长分化和调节机体免疫功能等活性[1],是发现最早、研究最多、第一个克隆化生产并应用于临床治疗的细胞因子。
红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化
Ａ ｑ ｕ ａ ｔ ｉ ｃ Ｅ ｃ ｏ ｎ ｏ ｍｉ ｃ Ａ ｎ ｉ ｍ ａ ｌ ｓ ｏ ｆ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｈ ｉ ｇ ｈ ｅ ｒ Ｅ ｄ ｕ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ， Ｚ ｈ ａ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ５ ２ ４ ０ ２ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
达量最 大 ， 分子 质量 大小 与预测值相符 ， 该蛋 白主要 以包涵体形式存在 。利用 Ｈ ｉ ｓ Ｔ ｒ ａ ｐ Ｈ Ｐ 亲和层析柱使 Ｔ ｄ Ｔ 蛋白
得 到进 一步纯化 ， 最佳 咪唑洗脱浓度为 ３ ０ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ，Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｎ ｒ ｂ ｌ ｏ ｔ 分析显示 ，该融合蛋 白可与鼠抗 Ｈ ｉ ｓ —ｔ ａ ｇ 单克隆抗 体 发生特异性 的结合 ，表 明表 达蛋 白为 目的蛋 白。 关键词 ：红笛鲷 ；ｔ ｄ ｔ 基 因；原核表达 ；优化 ；纯化 ；Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 分析
２ ． Ｚ ｈ ｏ ｎ ｇ ｋ ａ ｉ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｙ ｔ ｏ ｆ Ａ ｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ａ ｎ ｄＥ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ １ ０ ２ ２ ５ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ） Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｏ ｆ ｃ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｍａ ｔ ｕ ｒ ｅ ｐ ｅ ｐ ｉ ｆ ｄ ｅ Ｌ ｕ ｔ ｊ ｎＵ ａ Ｓ ｓ ａ ｎ ｇ ｕ ｉ ｎ ｅ ｕ ｓ Ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ａ ｌ
第３ ３卷Байду номын сангаас
第 １ 期
广东海洋大学学报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｏｃ ｅ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
利用SUMO技术表达可溶性的拟南芥AtRD22蛋白
利用SUMO技术表达可溶性的拟南芥AtRD22蛋白唐玉林;米子岚;钟活权;江年琼【摘要】为了体外获得可溶性的拟南芥AtRD22蛋白,以拟南芥叶片提取的总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)为模版,反转录获得AtRD22的全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid,cDNA),分别构建AtRD22的原核重组表达载体pET32a-RD22和pSUMO-RD22,并转化大肠杆菌BL21(DE3)进行AtRD22蛋白的表达.在0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dithiogalactopyr-anoside,IPTG)诱导下,探索不同培养温度和诱导时间对可溶性蛋白表达的影响.结果表明,在实验条件下,转化pET32a-RD22的重组菌表达AtRD22蛋白的总量高于转化pSUMO-RD22的重组菌,但后者的可溶性AtRD22蛋白表达量明显高于前者.当诱导温度为28或16℃,时间分别为6.0或8.0h以上时,转化pSUMO-RD22的重组菌中可溶性目的蛋白的表达量相对较大.为进一步在体外研究AtRD22蛋白质的结构和功能奠定了基础.【期刊名称】《深圳大学学报（理工版）》【年(卷),期】2015(032)006【总页数】7页(P610-616)【关键词】蛋白质工程;拟南芥AtRD22;融合标签;小泛素相关修饰物;基因克隆;原核表达【作者】唐玉林;米子岚;钟活权;江年琼【作者单位】深圳大学生命与海洋科学学院,深圳518060;深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室,深圳518060;深圳大学生命与海洋科学学院,深圳518060;深圳市微生物基因工程重点实验室,深圳518060;深圳大学生命与海洋科学学院,深圳518060;深圳市微生物基因工程重点实验室,深圳518060【正文语种】中文【中图分类】Q943.2;Q786来自拟南芥的一个脱水应答基因(the Arabidopisis thaliana dehydration-responsive gene RD22，AtRD22)的cDNA中有1 179碱基对(base pair，bp)的核苷酸，编码一个含392个氨基酸残基的蛋白，该蛋白属于BURP蛋白家族.BURP蛋白最初是由Hattori等定义的一类在C-端具有保守的BURP结构域的蛋白，其命名取自于4个具有代表性成员:①油菜花粉粒胚胎发生时表达的一种蛋白(microscope-drived embryo from Brassica napus，BNM2);②蚕豆种子中丰度非贮存蛋白(abundant non-storage seed proteins from Vicia faba，USPs);③拟南芥中的一种受干旱诱导的蛋白(dehydration-responsive protein from Arabidopsis thaliana，RD22)［1］;④番茄果实成熟时表达的多聚半乳糖醛酸酶Ⅰ的β亚基(β-subunit of polygalacturonase isozyme I from Lycopersicon esculentum，PG1β)［2］.BURP 蛋白家族是植物所特有的一类蛋白，已有研究表明，它们在植物的生殖发育、果实成熟以及植物抵抗生物和非生物胁迫中发挥重要功能［3-6］.AtRD22蛋白是BURP蛋白家族的典型成员之一，其基本结构如图1.在AtRD22蛋白的BURP结构域中存在较高比例的半胱氨酸、组氨酸和4个保守的半胱氨酸-组氨酸基序，这些氨基酸可能与二硫键的形成有关，也可能具有与过渡金属离子结合的潜力，推测其对蛋白结构的维持和功能的发挥有重要作用，但目前尚未得到验证，因此，通过体外表达获得具有活性的AtRD22蛋白对于研究该蛋白的功能具有重要意义.然而，外源蛋白在大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)中高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成［7］.如果重组蛋白含有二硫键，而在E.coli体内，由于还原性的环境不利于正确的二硫键的形成，导致重组蛋白链间的错配，也容易导致包涵体的形成.AtRD22蛋白的氨基酸序列中较高比例的半胱氨酸、组氨酸是与二硫键形成有关的氨基酸残基，这可能是该蛋白在E.coli中表达时容易形成包涵体的原因之一，而通过蛋白可溶性分析软件(/)预测该蛋白的可溶性为 0.因此，如何在体外获得可溶性的AtRD22蛋白是进一步研究该蛋白结构和功能急需解决的技术瓶颈.图1 AtRD22蛋白的基本结构示意图Fig.1 Protein structure diagram ofAtRD22融合标签能够在蛋白质的折叠过程中起作用，从而增加重组蛋白质的可溶性表达［8］.pET32a载体是一种原核表达载体，利用该载体在E.coli中表达的融合蛋白含有硫氧原还蛋白A(thioredoxin A，TrxA)标签，有研究认为，TrxA具有提高重组蛋白溶解性的能力［9］.pSUMO载体是由pET28a改造而来的原核表达载体，它是将一段小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)基因插入在pET28a载体的多克隆位点中，编码一个约100个氨基酸残基的小分子泛素样修饰蛋白.利用pSUMO载体在E.coli中表达的融合蛋白含有SUMO融合标签，该标签作为重组蛋白质表达的融合标签和分子伴侣，具有抗蛋白酶水解、提高重组蛋白质可溶性表达等功能［10-11］.为了获得AtRD22蛋白以研究其结构与功能，本研究利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)的方法先从拟南芥总核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)中克隆到了AtRD22全长互补脱氧核糖核酸(complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)，再分别克隆到原核重组表达载体pET32a-RD22及pSUMO-RD22中，转化E.coli进行蛋白表达.通过一系列条件的优化，找出获得可溶性AtRD22蛋白质的最佳条件并鉴定了融合蛋白的表达.1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 菌株与载体质粒pET32a由本实验室保存;pSUMO由美国加州大学陈雪梅院士惠赠;E.coli Top10用于基因克隆;BL21(DE3)为融合蛋白表达宿主.1.1.2 植物材料哥伦比亚型(Columbia，Col.)拟南芥.1.1.3 主要试剂Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒、EcoRⅠ、NotⅠ、PremeSTAR、T4 DNA连接酶和DNA分子质量标记(Takara公司);聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒(Omega公司);卡那霉素(北京鼎国公司);蛋白分子质量标记(Fermentas公司);His-tag小鼠单克隆抗体、兔抗小鼠二抗(Abcam公司);WTAB显色试剂盒(上海生工).1.2 实验方法1.2.1 拟南芥总RNA提取与cDNA制备取生长周期为1个月左右的拟南芥叶片2～3片(约100 mg)，采用经典 Trizol法［12］提取 RNA，并利用PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒反转录合成cDNA. 1.2.2 引物设计与合成根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)登录的AtRD22基因序列，由软件Primer Premier 5.0分析并设计聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物(表1).表1 实验引物汇总表Table1 List of primers构建pET32a-RD22载体 F1 CTGGATCCAATGGCGATTCGTCTTCCTC BamHⅠ构建pET32a-RD22载体 R1 ACGAGCTCATCTAGTAGCTGAACCACAC SacⅠ构建pSUMO-RD22载体 F2 CTGGATCCAATGGCGATTCGTCTTCCTC EcoRⅠ构建pSUMO-RD22载体 R2 GATGCGGCCGCCTAGTAGCTGAACCACACAAC NotⅠ1.2.3 载体构建及鉴定1)pET32a-RD22重组载体的构建和鉴定.以拟南芥(Col.)cDNA为模版，以 F1和R1为引物，PCR扩增出AtRD22基因的开放阅读框，将PCR产物和pET32a空载体用BamHⅠ和SacⅠ双酶切后用T4连接酶连接，再转化E.coli Top10，之后在含氨苄青霉素(10 mg/L)的LB平板过夜培养后对阳性单克隆依次进行菌落PCR和双酶切鉴定，最后进行测序验证.2)pSUMO-RD22重组载体的构建和鉴定.以pET32a-RD22重组载体为模版，F2和R2为引物，扩增AtRD22基因的开放阅读框，将PCR扩增产物和pSUMO空载体分别用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后，再用T4连接酶连接，转化E.coli Top 10，之后在含硫酸卡那霉素(10 mg/L)的LB平板培养过夜，对阳性单克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定，最后进行测序验证.1.2.4 重组质粒的原核可溶性表达条件筛选将测序成功的重组质粒pET32a-RD22和pSUMO-RD22分别转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆，在37℃ 的LB液体培养基中经2次扩大培养，至光密度(optical density，OD)D(600)值约为 0.8时，加入终浓度为 0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dithiogalactopyranoside，IPTG)，分别在以下条件下继续诱导培养，在不同时间点分别测定菌液的D(600)值，并取样检测蛋白的表达.pET32a-RD22的诱导条件:37 ℃ 分别诱导 0、0.5、1.0、1.5 和2.0 h;28 ℃ 分别诱导 2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分别诱导 6.0、8.0 和12.0h.pSUMO-RD22的诱导条件:37℃分别诱导1.0、2.0和3.0 h;28℃分别诱导2.0、4.0 和8.0 h;16 ℃ 分别诱导6.0、8.0和12.0 h.检测方法:将菌液离心后，根据菌液的D(600)值加入相应体积的平衡缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl， pH=8.0)重悬菌体，使样品的菌体浓度一致，各样品留取20 μL用于总蛋白检测，其余样品进行超声破碎后离心取上清，获得各诱导条件下的可溶性蛋白，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(dodecyl sulfate，sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE).1.2.5 利用蛋白质免疫印迹鉴定表达的融合蛋白SDS-PAGE电泳后，采用湿法转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2.0 h后，用鼠抗6×组氨酸抗体4℃ 孵育过夜，然后用洗膜缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，体积分数为0.05%的Tween20)洗膜3次，每次5 min，加入2 000倍稀释的兔抗鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，室温孵育2.0 h，洗膜缓冲液洗涤3次，每次5 min，最后用W-TAB试剂盒显色.1.2.6 质谱鉴定表达的目的蛋白将诱导后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色脱色后，挖取特异性条带部分经胶内酶解［13］后，采用高分辨质谱仪 AB SCIEX Triple TOFTM 5600检测鉴定.2 结果与分析2.1 拟南芥RNA的提取及AtRD22基因的克隆利用Trizol法提取拟南芥叶RNA后取5 μL进行非甲醛变性核酸电泳，见图2(a).RNA条带完整，无拖尾现象，表明该方法获得的RNA比较完整.提取的RNA 利用核酸分析仪测定得到RNA质量浓度为450 ng/μL，D(260)/D(280)=1.85，说明RNA的质量浓度可满足反转录的要求.将RNA反转录成cDNA后，以cDNA为模版，F1和R1为引物，PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后可见一条与目的基因片段大小(1 179 bp)相符的特异性条带，见图2(b).将该PCR片段与pET32a载体连接后转化E.coli Top10，在LB平板上培养过夜.对阳性单克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定，见图2(c)和图2(d)，并经测序验证正确.以pET32a-RD22为模版，F2和R2为引物扩增出AtRD22基因的开放阅读框，将扩增产物与pSUMO空载体连接后转入E.coli Top10感受态细胞中，在LB平板上过夜培养后对阳性单克隆进行菌液PCR和双酶切鉴定，见图2(e)和图2(f)，并经测序验证正确.图2 重组表达载体的构建及鉴定Fig.2 Construction and identification of recombinant expression vector2.2 融合蛋白的诱导表达图3 转化pET32a-RD22的菌中融合蛋白的诱导表达情况Fig.3 (Color online)The expression of fusion protein using pET32-RD22为建立适宜的AtRD22蛋白的原核表达条件，研究了诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度对目标蛋白可溶性表达的影响.结果表明诱导温度和诱导时间对目标蛋白可溶性表达影响较大，见图3和图4(蛋白质相对分子质量单位:u，1 D=1 u)，而当诱导剂浓度分别为0.3、0.5和1.0 mmol/L时，可溶性目标蛋白的量几乎无变化(结果未显示)，因此选取0.3 mmol/L作为本实验中的诱导剂浓度.转化了pET32a-RD22和pSUMO-RD22的重组 E.coli，经不同条件培养和诱导后，总蛋白中均分别有与各自目的蛋白分子量大小相等的特异性蛋白出现，且转化了pET32a-RD22的重组菌在被诱导1.5～12.0 h后目的条带清晰而粗厚，显示其目的蛋白的表达量较高.但可溶性蛋白中的特异性蛋白的存在情况不同.在诱导温度为37、28和16℃时，不同诱导时间后的pET32a-RD22重组菌经超声破碎获得的上清液作为可溶性蛋白，经SDS-PAGE后均未见与目的蛋白分子量大小一致的明显条带.而pSUMORD22重组菌在不同的温度和时间下诱导培养后，其表达的可溶性蛋白中均有与目的蛋白分子量大小相等的特异性蛋白条带出现;当培养温度为28℃诱导6.0 h，或16℃诱导8.0 h以上时，可溶性蛋白中的特异性条带蛋白表达量相对较高，见图4(b)和图4(c).图4 转化pSUMO-RD22的菌中融合蛋白诱导表达情况Fig.4 (Color online)The expression of fusion protein using pSUMO-RD222.3 可溶性蛋白的鉴定通过对图4的结果分析，对转化了 pSUMORD22重组载体的E.coli在优化条件下，即在IPTG浓度为0.3 mmol/L时，28℃诱导6 h，进行融合蛋白的表达.分别取总蛋白、包涵体蛋白和可溶性蛋白进行SDS-PAGE电泳后转膜进行蛋白质免疫印迹(western blot，WB)分析，一抗为小鼠抗His抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG.结果如图5，由图5可见，在总蛋白及可溶性蛋白中均有一条约60 kD(1 D=1 u)的条带，见图5.进一步对该特异性条带进行质谱鉴定，确认该蛋白条带为拟南芥AtRD22蛋白.证明利用pSUMO-RD22载体成功表达了可溶性的SUMO-RD22融合蛋白.图5 利用WB鉴定重组菌蛋白的表达Fig.5 (Color online)Identification of fusion protein using WB3 讨论利用原核表达系统表达异源蛋白具有简便、价廉、高效等优点，已广泛用于科学研究中.但重组的外源蛋白在E.coli中高水平表达时经常导致蛋白聚集容易形成不溶的、无活性的包涵体，而包涵体蛋白虽然较易纯化，但后续的复性等工作繁琐，且不一定能得到具有功能的蛋白，所以在体外表达可溶性的蛋白将大大简化进一步的蛋白实验［7］.目前，许多融合标签系统已作为实现蛋白可溶性表达和纯化常用的方法，但不同的融合标签对于提高不同蛋白溶解性及表达量的能力不同［14］.TrxA是还原蛋白二硫键的催化剂，它作为融合标签可以提高蛋白的溶解性［15］.AtRD22蛋白中可能含有较多的二硫键，其在原核表达中难以进行可溶性表达的原因之一可能是二硫键未能正确折叠，与TrxA融合表达后的AtRD22蛋白的大部分以包涵体形式存在，可溶性目的蛋白的量很少，这可能是由于TrxA未能促进AtRD22蛋白的正确折叠.SUMO作为N-端融合标签，能够显著提高融合蛋白的表达量［10］.AtRD22具有亲水的外表面，内部是一个疏水核心，这种结构可能使它对其他不溶性的蛋白以一个类似去垢剂的物质发挥作用，能够促进蛋白的正确折叠［16］，提高目标蛋白的稳定性和可溶性［10］.本研究将pET32a-RD22转化E.coli后表达的融合蛋白在不同的诱导温度及诱导时间下，融合蛋白的可溶性均很低，而利用pSUMO-RD22转化E.coli表达出的融合蛋白在不同的温度及诱导时间下，融合蛋白的可溶性均相对提高.由此可知，促溶标签对于提高AtRD22蛋白溶解性的影响较大，SUMO融合标签对AtRD22蛋白的促溶作用明显优于TrxA.利用pSUMO-RD22重组载体可在E.coli中表达出可溶性程度较高的AtRD22融合蛋白.分析不同诱导温度及诱导时间对pSUMO-RD22蛋白可溶性表达的影响，结果发现，当诱导温度为37℃时，随着诱导时间的延长，可溶性目的蛋白的含量在1.0、2.0和3.0 h时没有明显改变;当诱导温度为28℃时，可溶性目的蛋白量在诱导4.0和6.0 h时要明显多于诱导2.0 h时;当诱导温度为16℃时，随着诱导时间的增加，可溶性目的蛋白量增加，在诱导的8.0和12.0 h都表现为有较高含量的可溶性目的蛋白.当诱导温度为28和16℃时，可溶性目的蛋白量均明显高于37℃时的获取量.推测当诱导温度较高时，蛋白的表达速度较快，可能使得蛋白不能够正确折叠，进而造成蛋白的可溶性降低.这些结果说明，低温诱导有利于可溶性AtRD22蛋白的表达和积累，一定的诱导时间对于提高可溶性蛋白的量是有效的.考虑到后续蛋白大量纯化的时间和效率，28℃诱导培养6.0 h将是诱导获得该蛋白的较为合适的条件.体外获得具有活性的AtRD22蛋白将有利于对该蛋白的结构和功能的认识，进而丰富对BURP蛋白家族的了解，而在E.coli中表达出可溶性的AtRD22蛋白则为这一工作奠定了基础.结语本研究构建了拟南芥AtRD22基因的原核表达载体，探索了体外表达可溶性融合蛋白的条件，结果表明，利用SUMO表达系统在诱导温度为28℃，诱导6.0 h，或16℃，诱导8.0 h以上时，可在重组菌中表达出相对含量较多的可溶性目的蛋白.参考文献 /References:［1］Yamaguchi-Shinozaki K，Shinozaki K.The plant hormone abscisic acid mediates the drought-induced expression but not the seed-specific expression of rd22，a gene responsive to dehydration stress in Arabidopsis thaliana［J］.Molecular＆ General Genetics，1993，238(1/2):17-25.［2］Hattori J，Boutilier K A，Campagne M M L，et al.A conserved BURP domain defines a novel group of plant proteins with unusual primary structures［J］.Molecular＆General Genetics:MGG，1998，259(4):424-428. ［3］Tang Yulin，Cao Yan，Ou Zhonghua，et al.Regulatable gene expression controlled by the promoter of 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pET-GST使用说明
pET-GST pET-GST pET系列表达载体基本信息：启动子: T7/lac复制子: ColE1 ori，F1 ori终止子: T7 terminator质粒分类: 大肠杆菌载体；PET系列表达质粒质粒大小: 3.7kb质粒标签: N-GST,C-6×His，N-P3C原核抗性: 氨苄青霉素Amp克隆菌株: DH5α培养条件: 37℃，有氧，LB表达宿主: BL21(DE3)诱导方式: IPTG或乳糖及其类似物5'测序引物: T7:TAATACGACTCACTATAGGG3'测序引物: T7-ter:TGCTAGTTATTGCTCAGCGG pET-GST载体质粒图谱和多克隆位点信息：pET-GST载体简介：pET—GST表达载体采用T7启动子和GST融合表达，同时选用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶专一性切割位点。
此外，C端还添加了6个His，便于采用chelating sepharose亲和层析。
本载体表达的融合蛋白可采用吸附GST的亲和层析和6个His的chelating sepharose双重亲和层析，极大地方便了下游纯化。
GST融合表达背景文献在medline里极为丰富，有数百个基因采用GST融合表达成功。
pET-GST载体序列pET-GST其他相关pET系列表达载体：pProEX HTC pET-24pProEX HTA pET-23dpMBP-P pET-23cpMBP-C pET-23bpLLP-STII/Plpp-STII pET-23pETM-30 pET22b-EBFPpET303/CT-His pET22b-EGFPpET302/NT-His pET-22bpET-52b pET-21dpET-51b pET-21bpET-50b pET-21apET-48b pET-21pET-47b pET-20bpET-44c pET-19bpET-44b pET-17bpET-44a 非空（BamHI-XhoI）pET-14bpET-43.1c pET-12cpET-43.1b pET-12bpET-43.1a pET-12apET-42c pET-11dpET-42b pET-11cpET-42a pET-11bpET-41c pET-5apET-41b pET-5bpET-41a pET-3dpET-39b pET-3cpET-37b pET-3bpET-35b pET-3apET-33b pTrc-CKSpET-32c pLpp-OmpApET-32b pET28a-OFPpET-32a pET28a-ECFPpET30a-EcoRV pET28a-EBFPpET-30c pProEX HTBpET-30b pET-TrxpET28a-SUMO pETM-11pET28a-EYFP pET-HispET28a-DsRed2 pET-GSTpET28a-EGFP pET-DsbApET-29c pETBlue-2pET-29b pET-40bpET-29a pET-31bpET-28c pET-30apET-28b pET28a-mCherry pET-28a pET-25bpET-27b pET-24apET-26b pET-23apET-24d pET-15bpET-24c pET-21cpET-24b pET-16bpET-11a。
PinPoint Xa-3大肠杆菌表达载体说明
PinPoint Xa-3编号 载体名称北京华越洋生物VECT4320 PinPoint X a-‐3PinPoint X a-‐3载体基本信息载体名称: PinPoint X a-‐3质粒类型: 大肠杆菌表达载体；蛋白纯化表达水平: 高启动子: -‐-‐克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 3333 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: Ampicillin筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: 瞬表达组成型: 组成型病毒/非病毒: 非病毒PinPoint X a-‐3载体质粒图谱和多克隆位点信息PinPoint X a-‐3载体简介PinPoint™ Xa Protein Purification System (PinPoint™ Xa 蛋白纯化系统) 被设计用于制备和纯化体内表达的生物素化的融合蛋白。
将编码目的蛋白的DNA 克隆到PinPoint™ Vector(PinPoint™ 载体) 的下游，该位置编码的肽段在体内可被生物素化。
生物素化融合蛋白在大肠杆菌内生成，然后用SoftLink™ S oft R elease A vidin R esin 进行亲和纯化。
该树脂是基于专利技术设计的，可将融合蛋白以非变性形式洗脱出来。
PinPoint™ Vector(PinPoint™ 载体) 的特点是含有编码内源蛋白酶因子Xa(发音为"ten a") 的蛋白水解位点，使得纯化标签可从天然蛋白上分离。
载体还带有多克隆区域，便于方便地构建融合蛋白。
该系统中含有几种载体，这些载体涵盖了所有可能的有义读码框。
大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化
大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖基因组整合型菌株构建及发酵优化劳才文;吴金勇;李忠奎;廖迎雪;王纪;袁丽霞;陈祥松;姚建铭【期刊名称】《安徽农业大学学报》【年(卷),期】2024(51)1【摘要】2’-岩藻糖基乳糖(2’-Fucosyllactose,2’-FL)是一种岩藻糖化人乳低聚糖,具有预防肠道疾病、提高免疫力、促进大脑发育等重要生理功能。
基于基因组水平,通过敲除大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中2’-FL合成前体物质相关代谢基因,如β-半乳糖苷酶基因(β-galactosidase,lac Z)、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因(undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase,wca J)和GDP-甘露糖基水解酶基因(GDP-mannose mannosyl hydrolase,nud D),构建2’-FL合成底盘细胞;在此基础上,将外源α-1,2-岩藻糖基转移酶基因(α-1,2-Fucosyltransferase,wbg L)和磷酸甘露糖变位酶基因(phosphomannomutase,man B)、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶基因(annose-1-phosphate guanylyltransferas,man C)、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶基因(GDP-mannose 4,6-dehydratase,gmd)和GDP-岩藻糖合酶基因(GDP-L-fucose synthase,wca G)引入到大肠杆菌基因组中,探究在基因组水平过表达2’-FL合成基因对2’-FL产量的影响。
结果表明,2’-FL在所构建菌株B-05的摇瓶含量达到了1.99 g·L^(-1)。
进一步通过摇瓶发酵优化确定了最优发酵条件:IPTG诱导浓度为0.4 mmol·L^(-1)、诱导时OD600为2.4,诱导温度为28℃。
PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.004·论著·PTD4-Cu,Zn-SOD原核重组表达载体优化及蛋白表达程艳，万婷婷，薛荣亮【摘要】目的优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体以增加SOD 融合蛋白表达。
方法通过基因工程设计引物并优化PTD4-Cu,Zn-SOD 原核重组表达载体，扩增并鉴定目的基因，将优化后的原核重组表达载体以热激法转化至 E.coli BL21(DE3) 中，通过IPTG 诱导重组载体进行蛋白表达，通过溶菌酶+ 超声裂解菌体，离心后收集上清，利用Ni-NTA 树脂纯化，10 kD，20 kD 透析袋浓缩，以获得SOD 融合蛋白。
利用SDS-PAGE 凝胶电泳及Western blot 鉴定SOD 融合蛋白。
采用BCA 与黄嘌呤氧化酶法测定SOD 融合蛋白浓度及活力。
结果优化后的重组表达载体优化了稀有碱基，增加了His·Tag 标签，His·Tag-PTD4-Cu,Zn-SOD 序列作为一个整体，在Nco I 与Bam H I 限制性内切酶作用下定向插入，构建了长度为6213 bp 的优化质粒，基因测序结果与预先设计的序列对比显示碱基序列正确。
优化后的SOD 融合蛋白表达量约占菌体的32%，较前（20%）提高，纯化浓缩后纯度为94%，较前（90%）增加。
测定浓度为 1.8 mg/ml，37 ℃时SOD 总活力为（3065.137 ± 19.75）U/mg prot。
结论通过重组表达载体密码子优化，可以获得高产量、高活性的SOD 融合蛋白。
【关键词】蛋白质结构域；超氧化物歧化酶；质粒 中国医药生物技术, 2021, 16(3):215-221过氧化反应与多种神经退行性疾病关系密切，其产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）是造成神经元死亡的主要原因。
人成纤维细胞生长因子_21分泌型表达及鉴定
人成纤维细胞生长因子221分泌型表达及鉴定Ξ王会岩,张耀方,万晓珊,解佳森,肖业臣33,李校土方方ΞΞ吉林农业大学生物反应器与药物开发教育部工程研究中心,长春130118摘 要:利用基因工程手段,将人成纤维细胞生长因子221(hFG F21)与分泌信号肽相融合,构建得到能够分泌表达FG F21蛋白的表达载体。
将该表达载体导入到R osetta (blue )宿主细胞中,在分泌信号肽的引导下,在细胞周质中表达。
经IPTG 诱导表达可获得分子量为21kD 的蛋白,Western 2Blotting 证明该蛋白为FG F21蛋白。
经S DS -PAGE 证明获得了可溶性的FG F21蛋白。
该方法简化了纯化工序,提高了成品率,使大规模生产重组人成纤维细胞生长因子221(rhFG F21)成为可能。
关键词:人成纤维细胞生长因子221;pET 222b ;分泌表达中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:100025684(2009)0320255203Identification and Expression of Secretary H uman Fibroblast G row thF actor(FGF)221WANG Hui 2yan ,ZH ANG Y ao 2fang ,WAN X iao 2shan ,XIE Jia 2sen ,XI AO Y e 2chen ,LI X iao 2kunEngineering Research Center o f Bioreactor and Pharmaceutical Development ,Ministry o f Education ,Jilin Agricultural Univer sity ,Changchun 130118,ChinaAbstract :FG F21was cloned into the expression vector containing signal peptide gene ,then trans formed into R osetta (blue )cell and the trans formant was selected by am picillin resistance.Under the signal pep 2tide ′s guidance ,FG F21was expressed in the cell periplasmic space.A protein with m olecular weight of about 21kD was induced by IPTG.Western blotting analysis showed that the protein was FG F21.A fter S DS -PAGE analysis ,the protein of secretary hFG F21was obtained which indicated that the purification procedure of this protein w ould be very sim ple.As a result ,the rate of products w ould als o be increased and the large scale production of rhFG F21became possible.K ey words :hFG F21;pET 222b ;secretion expression 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor ,FG F )是一类由FG F 基因家族编码的结构相关的蛋白质。
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融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆
菌中表达条件的优化
刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2016(042)004
【摘 要】目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-
FGFR4）基因，构建 pET22b-SUMO-FGFR4表达载体，并对其表达条件进行优
化。方法：采用 Overlap PCR 方法制备 SUMO-FGFR4融合基因，并连接到原核
表达载体 pET22b 中，获得 pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。以乳糖为诱
导剂，观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对
SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响，确定最佳诱导条件，并进行重组蛋白的可溶性
分析。结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处
显示目标条带，并与 FGFR4抗体特异性结合。融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L－
1、诱导时间为3 h、诱导时机 A （600）值为0.8、诱导温度为37℃时表达量最
高，乳糖的添加方式对 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。乳糖作为
诱导剂比传统诱导剂 IPTG 诱导 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5％，融合
蛋白以包涵体形式为主。结论：以乳糖作为诱导剂，成功表达了 SUMO-FGFR4
融合蛋白，确定了融合蛋白的最佳表达条件。%Objective:To design the small
ubiquitin modification-fibroblast growth factor receptor 4 (SUMO-FGFR4)
fusion gene and construct the expression vector pET22b-SUMO-FGFR4, to
optimize the expression conditions. Methods:The SUMO-FGFR4 fusion
gene was obtained by Overlap PCR and was connected to pET22b;the
recombinant expression vector pET22b-SUMO-FGFR4 was obtained. The
influence of lactose concentration, induction time,induction
temperature,induction point and adding mode of lactose in the expression
levels was observed,and the best induction condition was determined;
then the solubility of recombinant protein was analyzed.Results:The
SUMO-FGFR4 fusion protein was highly expressed,the molecular weight of
the fusion protein was about 40 000 and it could bind with FGFR4 specific
antibody.When the lactose concentration was 1.0 g·L-1 ,the induction time
was 3 h,the induction temperature was 37℃,the value of A (600)was 0.8,the
expression level was highest;but adding mode of lactose had no
remarkable effect on the protein expression.The expression level of
recombinant protein induced by lactose was higher than IPTG.SUMO-
FGFR4 protein existed in a form of inclusion body.Conclusion:The SUMO-
FGFR4 fusion protein is expressed successfully in this study while
lactose is used as inducer and the best expression conditions are
confirmed.
【总页数】6页(P642-647)
【作 者】刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩
【作者单位】吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林 吉林 132013;吉林医
药学院检验学院生物技术教研室，吉林 吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物
技术教研室，吉林 吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林 吉
林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林 吉林 132013;吉林医药
学院检验学院生物技术教研室，吉林 吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技
术教研室，吉林 吉林 132013
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78;R73-3
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