SOP-QC4-010大肠埃希菌检查SOP

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分发部门

质量管理部设备部

质量保证室车间

质量控制室

●大肠埃希菌检查SOP

1.目的

建立一个规程，规范大肠埃希菌计数操作方法。

2.范围

本规程适用于xxxxxxxxxx公司质量控制室对水质、碳酸钙成品及其他的微生物限度检查。

3.职责

QC检测人员负责按照本规程进行样品检测和记录；QC负责人及监管人员有权对检测过程及结果进行监督检查，有权制止不符合规程的操作并向QA提出重试请求，得到QA批准后方可进行重试。必须开启偏差记录来解决不符合规程的操作。

4. 物料和设备

4.1试剂和材料

pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：

取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.00g，加水1000ml，微温溶解、滤清、分装、灭菌。

胰酪大豆胨液体培养基：

胰酪胨17.0g 氯化钠5.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g 磷酸氢二钾2.5g 以上成分混合加水1000ml，微温溶解，滤过，调节PH使灭菌后在25℃的pH为7.3±0.2，加入无水葡萄糖2.3g或葡萄糖2.5g，分装，灭菌。20~25℃培养3～5天后无菌生长即可使用。

胰酪大豆胨琼脂培养基：

胨 10.0g 氯化钠5.0g 牛肉浸出粉3.0g 水1000ml 葡萄糖5.Og

除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇勻，滤清，调节pH使灭菌后在25°C的pH值为7.2士0.2，分装，灭菌。

麦康凯液体培养基

明胶胰酶水解物20.0g 溴甲酚紫10mg 乳糖10.0g 水1000ml牛胆盐 5.0g 除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。

麦康凯琼脂培养基

明胶胰酶水解物17.0g 中性红30.0mg 胨3.0g 结晶紫1mg 乳糖10.0g 琼脂13.5g 脱氧胆酸钠1.5g 水1000ml氯化钠 5.0g

除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2，加入乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸1分钟，并不断振摇，分装，灭菌。

市售成品培养基按说明书配制。

革兰氏染色试剂：有商品供应，含结晶紫染剂、碘液固染剂、酒精脱色剂、复红复染剂。

4.2器材和设备

无菌器皿：吸管、量筒、锥形瓶或盐水瓶等。

其它器材和设备：接种针、酒精灯、玻片、细菌培养箱等。

5 程序

5.1样品处理及准备

取样品10g或10ml，用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解并稀释至100ml，为10%的试样。

当样品含有抑菌物质时，应按相应物料“抽样检验规程”所规定的方法和要求予以处理，如稀释法、离心法、中和法、薄膜过滤法等。

5.2增菌培养及分离培养。

5.2.1增菌培养：取10%的试样10ml（相当于样品1g或1ml），接种于胰酪大豆胨液体培养基（不少于100ml）中，混匀，置30～35℃培养18～24小时。

5.2.2选择分离培养：取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时后，取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时

5.2.3 结果判断：若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌

5.3对照实验

5.3.1阳性对照试验：用阳性菌代替供试品按照5.2项操作，对照菌的加入量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出大肠埃希菌

5.3.2阴性对照试验：以稀释剂代替供试液，按照5.2项操作，阴性对照应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

5.4鉴定试验

5.4.1菌落形态鉴定：

麦康凯琼脂培养基上大肠埃希菌菌落形态特征：鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形、扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。若麦康凯琼脂培养基上出现可疑菌落时挑取菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC实验，确认是否为大肠埃希菌。

5.4.2 纯培养

如果麦康凯琼脂培养基平板上生长的菌落与大肠埃希菌菌落形态特征相符或疑似时，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，蘸取培养物，应挑选2～3个以上疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，温度30～35℃培养18～24hr，进行以下检查。

如果平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团（如呈紫黑色或有金属光泽），则应蘸取可疑菌团培养物少许，或重新取增菌培养液分区划线接种于麦康凯琼脂培养基平板，温度30～35℃培养18～24hr，再挑选单个疑似菌落，纯培养，进行以下检查。

5.4.3 革兰氏染色、镜检

5.4.3.1 以接种环蘸取无菌水于洁净无划痕的载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰2～3次固定。

5.4.3.2 在载玻片的菌斑上滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

5.4.3.3 滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

5.4.3.4 滴加95%乙醇，严格控制时间脱色20～30s，水洗。

5.4.3.5 滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。

5.4.3.6 镜检结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色；大肠埃希菌为革兰氏阴性短杆菌或球杆菌。

5.4.4 生化（IMViC）试验

5.4.4.1 乳糖发酵试验取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管，温度30～35℃培养24～48hr，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管内有气泡，气泡无论大小）。为了避免迟缓发酵产生假阴性，也可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌，可于24hr出现阳性，或适当延长培养时间。

5.4.4.2 靛基质试验（I）取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基中，温度30～35℃培养24～48hr，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性（+），呈试剂本色为阴性（-）。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24Hr即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1ml或2ml培养液进行检查，如靛基质阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24hr，做靛基质试验。

5.4.4.3 甲基红试验（M）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度30～35℃培养48±2hr，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约每1ml培养液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性（-）。

5.4.4.4 乙酰甲基甲醇生产试验（V-P）取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，温度30～35℃培养48±2hr，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4hr（通常在30min 时）内出现红色判为阳性（+），无红色判为阴性（-）。