AD7c-NTP与胰岛素受体在小鼠海马CA1区的共存关系

２００７焦　第２８卷　６月　第３期　

首都医科大学学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｊｕｎ．２００７　

Ｖｏｌ＿２８　Ｎｏ．３　

・基础研究・　ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ与胰岛素受体在小鼠海马ＣＡ１区的共存关系　

王宏娟　，　赵志炜　姬志娟　盛树力　王　蓉ｈ　（１．首都医科大学宣武医院神经生化研究室；教育部神经变性病学重点实验室；２．首都医科大学燕京医学院）　

【摘要】　目的　观察Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ相关的神经丝蛋白（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｔｈｒｅａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ）在正常小鼠海马ＣＡ１　区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。方法应用ＳＤＳ一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ—ＰＡＧＥ）和蛋白印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）方法观　察小鼠脑蛋白提取物中ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ的相对分子质量大小和抗体的特异性。应用免疫组织化学方法观察ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ在正常小鼠海　马ＣＡ１区的分布。应用免疫组织化学双重标记技术观察ＡＤ７ｃ—Ｎ１１Ｐ与胰岛素受体的共存关系。结果ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ免疫反应阳性　条带位于相对分子质量约４１　０００的位置，与文献报道一致；正常小鼠海马ＣＡ１区有ＡＤ７ｃ—Ｎ１’Ｐ免疫反应阳性细胞分布，细胞膜和　细胞质染色并存在ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ和胰岛素受体免疫反应双阳性细胞。结论ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ在正常小鼠海马ＣＡ１区有分布并与胰岛素　受体有共存关系，提示ＡＤ７ｃ．Ｎ１１Ｐ的功能可能与胰岛素信号通路有关。　【关键词】　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ相关神经丝蛋白；胰岛素受体；免疫组织化学双重标记　【中图分类号】Ｒ　３２９．２；Ｑ　５１　

Ｃｏｅｘｉｓｔ￣！ｎｃｅ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ　ａｎｄ　Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ＣＡ１　Ｚｏｎｅ　ｏｆ　Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　Ｍｏｕｓｅ　

Ｗａｎｇ　Ｈｏｎｇｊｕａｎ　，Ｚｈａｏ　Ｚｈｉｗｅｉ　，Ｊｉ　Ｚｈｉｊｕａｎ　，Ｓｈｅｎｇ　Ｓｈｕｌｉ　，Ｗａｎｇ　Ｒｏｎｇ　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＮｅｕｒｏｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｘｕａｎｗｕ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒ　Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆＭｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ；２．Ｙａ　ｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　

【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｔｈｒｅａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＤ７ｃ—Ｎ１１Ｐ）ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｉｎ　ＣＡ１　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＳＤＳ—ＰＡＧＥ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ａｓｓｅｓｓ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ．Ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ｉｎ　ＣＡ１　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　Ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ．　Ｔｈｅ　ｃｏｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｏｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａ　ｂａｎｄ　ｏｆ　ａｂｏｕｔ　４１　０００　Ｗａｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔＩｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ．ｗｈｉｃｈ　Ｗａｓ　ｃｏｉｎｃｉｄｅｄ　ｗｉｔＩｌ　ｔＩｌｅ　ｐｒｅｖｉｏｕｓ　ｒｅｐｏｒｔ．ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ　ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ＣＡ１　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ．ｗｈｏｓｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　ｗｅｒｅ　ｓｔａｉｎｅｄ．ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ　ａｎｄ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｎｄ　ｃｏｅｘｉｓｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ＣＡ１　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ｉｓ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ＣＡ１　ｚｏｎｅ　ｏｆ　ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ，ａｎｄ　ｃｏｅｘｉｓｔｓ　ｗｉｔｈ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ　ｍａｙ　ｈａｖｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｓｕｌｉｎ　ｓｉｇｎａｌ　ｐａｔｈｗａｙ．　【ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ】　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｔｈｒｅａｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ｄｏｕｂｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　

阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是一种　与年龄相关的、以进行性认知功能障碍为特征的脑变　性疾病。表现为细胞外存在大量由ｐ淀粉样肽（ｐ．　ａｍｙｌｏｉｄ，Ａ１３）等形成的炎性斑块（老年斑）、神经元内　由高度磷酸化的ｔａｎ蛋白形成的神经原纤维缠结　（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴｓ）以及选择性神经元和突　触的丢失¨Ｊ。到目前为止，ＡＤ的发病机制尚不完全　基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３）（２００３ＣＢ５１７１０４）资助项　目．Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ－９７３　Ｐｒｏｊｅｃｔ（２００３ＣＢ５１７１０４）　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ．Ｅ—ｍａｉｌ：ｒｏｎｇ＿＿ｗａｎｇ７２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ　清楚，但随着研究的深入，陆续发现了一些与ＡＤ有　关的生物分子。ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ是近些年来发现的一种重　要的与ＡＤ相关的生物分子。１９９７年，ｄｅ　ｌａ　Ｍｏｎｔｅ及　其合作者分离并命名了ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ的ｃＤＮＡ　］，但到　目前为止，有关ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ蛋白质的结构、功能及其　与ＡＤ关系的研究尚未广泛开展。有证据表明ＡＤ７ｃ．　ＮＴＰ的过表达可能通过损伤胰岛素信号转导通路，从　而在ＡＤ的病理过程中发挥一定的作用　ｊ。本文旨　在研究ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ在正常小鼠海马ＣＡ１区的分布及　其与胰岛素受体（ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＮＳＲ）的共存关系，　为ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ与ＡＤ的关系提供形态学依据。　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第３期　王宏娟等：ＡＤ７ｃ－Ｎ１１Ｐ与胰岛素受体在小鼠海马ＣＡ１区的共存关系　３２５　１材料和方法　１．１实验动物　正常ＳＰＦ级昆明种小鼠ｌ３只（北京大学医学部　实验动物科学部提供），雄性，体质量ｌ８～２２　ｇ，实验　动物编号：ｓｃｘｋ（京）２００２－－０００１。　１．２人脑组织　由荷兰脑库提供。脑组织来自ＡＤ患者，于死后　６　ｈ以内迅速取样，一７０　ｃｃ冷冻保存。　１．３主要试剂　ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ抗体由首都医科大学宣武医院神经生　化研究室用固相法合成人ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ的Ｃ端肽段，经　高效液相纯化，与血蓝蛋白交联后免疫家兔制备，经　ＥＬＩＳＡ鉴定抗体滴度在１：１６　０００以上，吸收试验为阳　性，说明抗体具有较高的效价和特异性；ＩＮＳＲ仅链兔　多克隆抗体购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ生物技术公司；ＳＰ免疫组　化染色试剂盒、ＤＡＢ试剂盒、碱性磷酸酶标记的山羊　抗兔抗体试剂盒均购自中山生物技术公司。　１．４方法　１）ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ免疫印迹实验：将３只正常小鼠断　头，取新鲜脑组织匀浆、超声破碎、离心。冻存的３例　ＡＤ患者的脑组织处理方法同上。取上清液，用Ｌｏｗｒｙ　法测定蛋白质含量，并制备成蛋白含量为３　ｇ／Ｌ的电　泳样品，一２０℃保存备用。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ：分别取２０　Ｌ　（６０　ｇ总蛋白）的小鼠和人脑蛋白提取物，用１０％　的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ进行电泳，电泳条件：电压６０　Ｖ，待溴酚　蓝进人分离胶后，将电压提高到８０　Ｖ，继续电泳直到　溴酚蓝到达分离胶底部。电泳结束后，进行蛋白质转　膜，转膜条件：４℃，电压８０　Ｖ，将电泳凝胶上的蛋白　质条带转移至硝酸纤维素膜（ＮＣ）上。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ杂　交：ＮＣ膜封闭后，加人ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ一抗（１：３　０００）和碱　性磷酸酶标记的二抗依次反应，ＮＢＴ／ＢＣＩＰ显色。　２）免疫组织化学实验动物取材：正常小鼠ｌ０只，　用１０％水合氯醛（４　ｍＬ／ｋｇ）腹腔注射麻醉，开胸暴露　心脏，将灌注针经左心室插入升主动脉，同时剪开右　心耳，快速灌注生理盐水１００　ｍＬ冲洗血液，待肝脏变　白后，灌注含４％多聚甲醛的磷酸缓冲液（ｐＨ　７．４）　１００　ｍＬ，至小鼠僵硬。迅速取脑后置于上述灌注液中　４℃固定２　ｈ，再人含３０％蔗糖的多聚甲醛溶液４℃　后固定至脑组织下沉。　３）ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ免疫组织化学染色：取脑组织快速　冷冻，用恒冷切片机进行冠状连续切片，片厚４０　Ｉ．Ｌｍ，　留取海马中部进行免疫组化染色，每只小鼠留取５张　脑片，采取漂浮染色法。步骤如下：切片经３％Ｈ　Ｏ　和５％的山羊血清处理后，加人兔抗ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ抗体　（１：３　０００）４　ｏＣ过夜，按ｓＰ免疫组化染色试剂盒说明　书进行操作，ＤＡＢ显色５～１０　ｍｉｎ，蒸馏水终止显色。　以上除正常山羊血清不洗外，各步骤之间均用０．０１　ｍｏｌ／Ｌ　ＰＢＳＴ缓冲液冲洗切片。最后将切片裱于用明　胶处理过的载玻片上，苏木素复染，常规脱水、透明、　封片。　４）ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ／ＩＮＳＲ免疫组织化学双重染色：动　物取材和切片同上。免疫组化双重标记采用ＤＡＢ法　和加强ＤＡＢ法，分别使ＩＮＳＲ和ＡＤ７ｃ－ＮＴＰ免疫反应　阳性细胞显示棕色和蓝黑色。步骤如下：切片经　Ｈ　Ｏ　和山羊血清处理后，加入第一标的兔抗ＩＮＳＲ抗　体（１：１　０００）４　ｏＣ过夜，按上述步骤显色后，蒸馏水终　止显色并充分洗涤。然后用１　ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣ１终止反　应并使结合的抗体变性，重新用正常山羊血清封闭后　加人第二标的一抗：兔抗ＡＤ７ｃ．ＮＴＰ抗体（１：３　０００）　４℃过夜，按ＳＰ免疫组化染色试剂盒说明书操作，在　显色之前加人１％ＣｏＣ１，室温１０　ｍｉｎ，最后ＤＡＢ显色，　蒸馏水终止显色。对照试验　Ｊ：①省去一抗，或用正　常兔血清代替一抗孵育切片，结果不出现相应的免疫　反应；②呈色混合试验：对双染的切片，在第１套染色　程序完成后，切片经ＰＢＳＴ充分洗涤，然后直接进行第　２套染色程序中的呈色步骤，结果为阴性，表明２套免　疫细胞化学染色反应之间不互相干扰，具有免疫细胞　化学特异性。　５）ＡＤ７ｃ—ＮＴＰ／ＩＮＳＲ双重染色细胞的计算方法：　计数小鼠海马ＣＡ１区的双标细胞数目和相应部位免　疫反应阳性细胞的总数目，计算每张脑片双标细胞占　总细胞的百分比，估算双标细胞的百分比范围。