蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其PCR检测

浙江农业学报Ａｃｔａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｚｈｅｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ　２０（５）：３４４～３４８，２００８　蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其ＰＣＲ检测　徐海圣　，曾　健２，徐步进　（’浙江大学动物科学学院，浙江杭州３１００２９；　浙江省农业科学院蚕桑研究所，浙江杭州３１００２１；　浙江大学原子核农业科学研究所　浙江杭州３１００２９）　

摘要：利用设计的特异引物，采用ＰＣＲ技术，对蟹源致病性易损气单胞菌气溶素基因（ｏ，ｅｒ）进了克隆和序　列分析，从其基因组中克隆出长为６２２　ｂｐ的基因片断，用限制性内切酶ＢａｍＨＩ对扩增产物进行酶切，产生长　约５７０　ｂｐ和５ｏ　ｂｐ两条片断；研究还利用设计的特异引物，对蟹源致病性易损气单胞菌进行ＰＣＲ快速分子鉴　定的研究。　关键词：易损气单胞菌；气溶素；基因；ＰＣＲ　中图分类号：Ｑ９３８．８　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４一￣５２４（２ｏｏ８）ｏ５—０３４４—０５　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａｅｒｏｌｙｓｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｒｏｔａ　ｆｒｏｍ　Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｄｅ－　ｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ＰＣＲ　ＸＵ　Ｈａｉ－ｓｈｅｎｇ　，ＺＥＮＧ　Ｊｉａｎ　，ＸＵ　Ｂｕ．ｊｉｎ３　（　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆＡｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖ＆ｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２９，Ｃｈｉｎａ；　Ｓｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ａ—　ｃａｄｅｍｙ　ｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２１，Ｃｈｉｎａ；　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆＮｕｃｌｅａｒ－Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｕｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２９，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｆｉｄｅ　ｐｆｉｍｅｍ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ａｅｍｌｙｓｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｒｏｔａ　ｆｒｏｍ　Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ　ｂｙ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　６２２　ｂｐ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　Ａ．ｔｒｏｔａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ　ｓｉｎｅｍｉｓ．］ｈｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ＷａＳ　ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＢａｍＨＩ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　５７０　ｂｐ　ａｎｄ　５０　ｂｐ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ　ａｌｓｏ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ＰＣＲ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ．ｔｒｏｔａ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｅ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｒｏｔａ；ａｅｒｏｌｙｓｉｎ；ｇｅｎｅ；ＰＣＲ　

气单胞菌是一类人和动物共患病的重要病　原，已经引起医学界和水产养殖界的共同关注，　其致病力与增殖过程中所分泌的胞外产物中含　有大量具有生物活性的溶血素、内毒素、细胞毒　素、气溶素等毒素因子密切相关　ｌ　ｊ。在这些毒　素因子中，气溶素（ａｅｍｌｙｓｉｎ）被认为是最具致病　性的毒素，它在细胞内以气溶素前体的形式合　成，Ｎ末端具有一个典型的２３个氨基酸残基的　

收稿日期：２００８—０２—０３　基金项目：浙江省科技计划项目（２００４Ｃ３２０５０）　作者简介：徐海圣（１９６９一），男，山东昌邑人，副教授，博士。研　究方向：水产动物病害学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｓｘｕ＠ｚｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ　

信号序列，可引导无活性的气溶素前体透过细胞　膜而分泌到胞外，当Ｃ末端被切去２５个氨基酸　残基后被激活，其作用机制是结合到真核细胞膜　的专一受体后，该毒素即集聚成六聚体，并插入　细胞膜的类脂双分子层，形成３纳米的通　道　～８ｊ。２０００年７—９月杭州市袁浦镇河蟹（中　华绒螯蟹）养殖区暴发了严重的蟹病，发病率达　８０％以上，我们对濒死病蟹进行了细菌性病原的　分离鉴定，证实病原为易损气单胞菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｔｒｏｔａ）Ｅ９］，易损气单胞菌对河蟹的致病机制及其　

ＰＣＲ快速检测研究国内外均未见报道。目前，对　气单胞菌的检测方法主要有斑点酶联免疫吸附　徐海圣等：蟹源易损气单胞菌气溶素基因的克隆及其ＰＣＲ检测　。３４５‘　试验（Ｄｏｔ。ＥＬＩＳＡ）Ｉｌｏ］、葡萄球菌Ａ蛋白协同凝集　试验（ＳＰＡ．ＣｏＡ）Ｈ¨、酶联免疫吸附试验　（ＥＬＩＳＡ）Ｌｌ２］、免疫荧光抗体等免疫学检测技　术［　］，但都存在着操作复杂、特异性不强等缺　点。ＰＣＲ技术的发展将病原微生物的检测提高　到新的分子水平，国内外已有应用于嗜水气单胞　菌检测的报道ｌＭ　，但用于易损气单胞菌的检　测研究却较少。作者对蟹源致病性易损气单胞　菌的气溶素基因（ｏｅ，）进行了克隆与序列分析，　为阐明易损气单胞菌对河蟹的致病机理提供科　学依据，并进行了水产动物易损气单胞菌感染症　的ＰＣＲ快速诊断研究。　

１　材料与方法　１．１材料　易损气单胞菌（以７１９Ｘ１、７１９Ｘ２菌株为主，　详见参考文献［９］）、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞　菌、副溶血弧菌、拟态弧菌由本实验室分离自浙　江省各地河蟹养殖场；温和气单胞菌分离自患病　黄鳝。　１．２引物设计　根据ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的气单胞菌ａｅ／＂全　基因序列（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＡＦ０６４０６８）中的保守　序列设计如下引物对：Ａｅｒ　Ｐ１（４４６．４６６）：５＇－ＴｒＧＣ．　ＣＧＣＣＣＡＧＣＣＣｏＧＴＧＣ　ＩＢ３　；Ａｅｒ　Ｐ２（１０６７。１０４７）：　５　．ＡＣＣＡＣ　Ｇｆ　眦ＡＣｃＡＧＣＡ￣ＴＡ一３　；弓ｌ物由上海　生工生物工程公司合成。　１．３细菌核酸抽提及模板制备　采用常规酚抽提法提取细菌核酸，作为ＰＣＲ　模板，一２０￣Ｃ保存备用。　１．４　ＰＣＲ方法　以提取的菌株基因组ＤＮＡ为模板进行聚合　酶链式ＰＣＲ反应：采用５０　反应体系，其中含　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，５　Ｌ；２０　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，４　ｆＬ；模板　ＤＮＡ　１　，上下游引物（５０　ｆｆｍｏｌ／Ｌ）各１　ｆｆＬ，ｄＮＴＰｓ　（２．５　ｍｍｏｌ／Ｌ）４　Ｌ（２．５　Ｌ），Ｔａｑ酶（５　ｕ／　Ｌ），　０．２５　ｆｆＬ；无菌双蒸水３３．７５　。反应条件为　９５℃预变性３　ｍｉｎ，９４　ｑＣ变性４５　ｓ，６６　ｏＣ退火６０　ｓ，７２　ｏＣ延伸６０　Ｓ，３０轮循环后，７２℃保存５　

１．５　ＰＣＲ产物鉴定　用ＴＢＥ缓冲液配制１．５％的琼脂糖（含ＥＢ　０．１５　ｎａｇ／Ｌ）板，约０．５　ｅｍ厚。将平板放入水平电　泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。取５　扩　增产物，加入２　ｆｆＬ样品缓冲液，混匀后加入样品　孔，３０　ｍＡ电泳到溴酚兰达底部时停止，凝胶成　像仪检测并拍照。　１．６　ＰＣＲ产物的酶切分析　取１０　Ｘ缓冲液２　ｆｆＬ；５　Ｕ／ｆｆＬ的内切酶　ＢａｍＨＩ　２　；ＰＣＲ扩增产物１６　，３７℃水浴１　ｈ，　１．５％琼脂糖凝胶电泳。　１．７序列测定与分析　使用ＡＢＩ３７７自动测序仪进行。将测定结果　与ＧｅｎＢａｎｋ中已发表的气单胞菌相似序列的同　源性进行比较。　１．８　ＰＥＲ检测的敏感性　取液体培养１８　ｈ后的７１９Ｘ１菌株做１０倍系　列稀释后，用平板稀释法测细菌浓度。取１０　进行酚抽提，直接作为模板加入反应体系，进行　ＰＣＲ反应。　１．９特异性测定　取易损气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单　胞菌、副溶血弧菌、拟态弧菌等菌株的新鲜培养　物，按１．３节所述方法抽提核酸，作为模板，按１．４　节所述方法进行ＰＣＲ扩增，引物同１．２节；１．５％　的琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增产物。　

２　结果与分析　２．１　ＰＣＲ扩增ｎｅｒ基因片断及其序列测定　对易损气单胞７１９Ｘ１、７１９Ｘ２菌株用设计特　异引物进行ＰＣＲ扩增，结果如图１所示，两菌株　均克隆出一条清晰的位于６ＯＯ　ｂｐ左右的条带；　使用内切酶ＢａｍＨＩ对扩增产物进行酶切，琼脂　糖凝胶电泳图上大约在５７０　ｂｖ和５０　ｂｐ位置出　现两条清晰带（图１）。　使用ＡＢＩ３７７自动测序仪对ＰＣＲ扩增产物进　行测序，测定其有６２２个碱基序列，与ＧｅｎＢａｎｋ　数据库中已发表序列的同源性做了比对，发现从　中华绒螯蟹组织内分离到易损气单胞（７１９Ｘ１，　７１９Ｘ２菌株）与国外临床分离的易损气单胞　（ＡＦ０６４０６８）气溶素基因片断的同源性为９８％（图　・３４６・　浙江农业学报第２Ｏ卷（２００８）　６００　ｂＯ　１Ｏ０　ｂＤ　

Ｍ　１　２　３　４　５　Ｍ　

Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ，１００　ｂｐ；１．　７１９ＸＩ；２　７１９Ｘ２；３　７１９ＸＩ／ＢａｒｎＨＩ；４－　７１９Ｘ２／ＢａｍＨＩ：５．刚性对照　

图１　易损气单胞　基因片段ＰＣＲ扩增结果及其　Ｂａｒｎ　ＨＩ酶切结果　Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｅｒｏ１）＇ｓｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆＡ．ｔｒｏｔａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｉ—　ｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎａｌＶｓｉｓ　ｔｈ　Ｂａｒｎ　ＨＩ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　

７１９Ｘ１　ｌ　ＡＦ０６４０６８　Ｉ１Ｉｔ６　７１９Ｘｌ　６１　ＡＦ０６，１０６８　５０６　７１９Ｘｌ　１２ｌ　ＡＦ０６４０６８　５６６　７１９Ｘｌ　１８ｌ　ＡＦ０６ｔ０６８　６２６　７１９Ｘ１　２儿　ＡＦ０６４０６８　６８６　７ｌ９Ｘｌ　３Ｏｌ　ＡＦ０６４０６８　７　１６　７１９Ｘ１　３６１　ＡＦ０６４０６８　８０６　７１９Ｘ１　１２１　ＡＦ０６　１０６８　８６６　７１９Ｘ１　ｌ８ｌ　ＡＦ０６，ｔ０６８　９２６　７１９Ｘｌ　５ｔ１　ＡＦ０６，１０６８　９８６　２），与温和气单胞菌（Ａ．ｓｏｂｒｉａ）（ｖｏｏ５５９）气溶素　基因片断的同源性为９６％。　２，２　ＰＣＲ检测易损气单胞菌的特异性　利用设计引物，扩增从河蟹体内分离到的３　株易损气单胞菌均得到预期的６２２　ｂｐ条带，而　嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌等　其它水产动物常见病原菌未见相应条带，虽然　有些细菌能扩增出条带，但是其大小与设计不相　符合（图３）。　２．３　ＰＣＲ检测易损气单胞菌的敏感性　随模板量的减少，扩增条带逐步减弱，模板　细菌量在１×１０以下时，不能扩增出稳定的条　带。当模板含量在１×１０２时，扩增效果较为稳　定。因此，以１×１　０２为检测蟹源致病性易损气　ＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡ　ＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣ　……㈠　ｆ　…　ｌｌ　㈡…　；　ＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧ＾　ＣＣ＾ＴＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＣＴｆＴＣ　ＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＣ（；ＡＴＴＡＴＣＧＴＣＣ从ＴＴＡＡＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡｃＡＧＡＧ　ｆＧ　ｌｌ　，ｌｌ　。　－　㈠　ｌｌ　－Ｉ　ｌｌｌ…　－ｌｌｌ。　ＴＴＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＧＣＣＧＡＴＴＡ１、ＣＧＴＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧ