免疫组化原理和步骤之令狐文艳创作

令狐文艳创作
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免疫组化原理及步骤

令狐文艳
免疫组化操作规程
一、实验原理与意义
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性
抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反
应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它
把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借
助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，
在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋
白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二、实验器材
微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学
显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。
三、试剂配制
1. 0.01 M PBS(pH 7.34 )：9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB
加双蒸水至 1000 ml；
1000 ml 0.2M PB (pH 7.4)＝5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O＋
58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸
水或＝190 ml A + 810 ml B（A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2
O：15.6 g in 500 ml ddH 2 O；B. 0.2
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M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O：71.632 g in 1000 ml dH 2 O）。
2. Citrate Buffered Saline（0.01 M 柠檬酸缓冲液，
PH6.0）：28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O（A.Citrate
acid（柠檬酸）：10.5 g 加双蒸水至 1000 ml；B.Citrate
sodium（柠檬酸钠）：29.41 g 加双蒸水至 1000 ml）。
3. 细胞通透液：由终浓度分别为 0.3%双氧水和
0.3%Triton X-100 混合而成。配制方法是先用微波加热的
36 ml PBS，再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿，冷
却至临用前加 0.4 ml 30％H 2 O 2 。
4. 5％羊血清或封闭血清，用 PBS 稀释。
5. 含 0.03％H 2 O 2 的 0.05％DAB（避光）：用 20×DAB
（1％，10 mg/ml）5 ul＋0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul
PBS。
6. 一抗、二抗均用 PBS 稀释。
7. Xylene、梯度 Ethanol（100％×2、95％、80％、
70％、50％）、双蒸水、中性树胶（封裱剂）。
8. 苏木精染液：
四、操作步骤
1 、脱蜡、水化
1) 60 ℃×20 min→Xylene 2 ×10 minutes；
2) 100% absolute ethanol：2 ×5 minutes；
3) 95% ethanol 2 minutes；
4) 80% ethanol 2 minutes；
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5) 70% ethanol 2 minutes；
6) distilled water:5 min；
7) PBS 洗 3 次×3 min。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶
8) 用封闭通透液浸润切片 30 min（RT 避光）。配法是用预
热 40 ml PBS 加 120ul TritonX-100 加热几分钟后，临用前
加 400 ul 30％H 2 O 2 。
9) PBS 溶液洗 3 次×3 min。
3、抗原修复暴露抗原决定族
10) 切片放入 0.01 M 柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0）后，在微
波炉里高火 4 min 至沸腾后，再加热约 6 min×4 次，每次
间隔补足液体，防止干片。
4、封闭非特异性蛋白
11) PBS 溶液洗 3 次×3 min；
12) 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周围
画上圈,在圆圈内组织滴入 5%羊血清（与二抗来源一致）后放
入湿盒中,室温 30（10～30）min；
5、一抗孵育
13) 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清，直
接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后，放入湿盒中
室温 1 小时，然后 4 度过夜，从冰箱中取出需37 ℃复温
45 min。
6、二抗孵育
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14) 将一抗倒掉并用 PBS 洗 5 min×5 次；
15) 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入
37 ℃恒温烤箱中 30 min（回收）。
16) 用 PBS 洗 5 次×5 min；
7、SP 反应
17) 加入 SP 后放入 37 度烤箱中 30 min。
18) 用 PBS 洗 5 次×5 min；
8、显色
19) 加入 DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染液），显
色时间控制在约 5 min（3～10 min），由镜下观察颜色控制
时间。0.05％DAB（避光）（1:20 储备液）：5 ul 20×DAB＋
0.1 ul 30% H 2 O 2 ＋95 ul PBS。1%DAB 储备液的
制:50mgDAB+5ml 0.05 mol/L PBS 充分溶解，-20 ℃保存。
9、复染、脱水、透明、封片
20) 用 PBS 3 次×3min 后，用双蒸水洗 5 min；
21) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋
白染 20 s 后自来水冲洗，
双蒸水洗 5 min，再用 PBS 返蓝 5 min。
22) 脱水：
50% ethanol 1-2 min，
70% ethanol 1-2 min
95% ethanol 1-2 min；
95% ethanol 1-2 min；
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100% absolute ethanol: (1-2) min；
100% absolute ethanol: (1-2) min。
23) 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min
24) 封片：中性树胶。
五、注意事项
1. 苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核
上。
2. DAB 显色时间需要达到最优化，镜下观察达到阳性染色
明显但背景不太深。
3. 抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育最好
在 4 度过夜。
4. 切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；
每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量
画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。
5. 片子着色不均匀的原因如下：
① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的
xylene1；
② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；
③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；
④ 抗体孵育时，切片放倾斜；
⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。
⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。
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6. 一抗从 4 ℃拿出后，为什么有人说要 37 度复温，目的是
什么？
① 一方面，防止切片从 4 ℃直接放入 PBS 易脱片； ②
另一方面，使抗原抗体结合更稳定。一般不需要,但对表达较
弱的抗原可能有用,4 ℃和 37 ℃度时分子运动方式不同,前者
分子碰撞机率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也
提高了并易造成非特异染色。
7.切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？
① 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通
过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；
② 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆
抗体看看；
③ 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很
高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染
色；
④ 非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动
物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
⑤ DAB 显色时间过长或浓度过高；
⑥ PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；
⑦ 标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。
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