地中海贫血携带伴染色体异常夫妇的植入前遗传学诊断解析

中华医学遗传学杂志２０１６年２月第３３卷第１魈—§！ｉ！！Ｍ型鱼！垒堕！兰尘！塑！！！！！！！∑！！：！！！．垒堕：！地中海贫血携带伴染色体异常夫妇的植入前遗传学诊断

王静丁晨晖张永明曾智敏侯学荣陆宝敏徐艳文周灿权５１００８０广州，中山大学附属第一医院生殖医学中心（王静、丁晨晖、曾智敏、侯学荣、陆宝敏、徐艳文、周灿权）；２０００６２上海，龙尼曼诊断技术有限公司（张永明）通信作者：周灿权，Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｃａｎｑｕａｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９４０６．２０１６．０１．００１

【摘要】目的报告地中海贫血伴染色体异常的夫妇，在滋养外胚层活检后同时进行地中海贫血基因以及染色体非整倍性检测的两个临床病例。方法两对地中海贫血携带伴染色体异常的夫妇，其中夫妇１双方为１３４１／４２地中海贫血携带者，男方为４６，ＸＹ，ｉｎｖ（９）（ｐ１１；ｑ１３），ｔ（１１；２２）（ｑ２５；ｑ１３）的相互易位携带者；夫妇２双方为｛ｌ－ＳＥＡ地中海贫血携带者，双方染色体正常，但曾有两次自然流产史。经过常规体外受精周期，两对夫妇最终分别获得１个及３个囊胚。活检后的细胞经全基因组扩增后，分别采用ＰＣＲ技术对地中海贫血基因进行检测，同时用单核苷酸微阵列技术检测２３条染色体的非整倍性。结果夫妇１的胚胎诊断为１３４１／４２地中海贫血杂合子，染色体正常，移植并成功妊娠；夫妇ｚ的１个胚胎诊断为ａ。８ＥＡ地中海贫血杂合子，染色体正常可以移植。结论滋养外胚层活检细胞经全基因组扩增后可以同时进行地中海贫血以及２３条染色体非整倍性的检测。并且这种新的方法有助于这类复杂情况的患者在最小的损伤下获得诊断，达到更优的临床结局。【关键词】地中海贫血；染色体异常；聚合酶链反应；单核苷酸多态性微阵列技术基金项目：国家自然科学基金（８１３７０７６５）；广州市科技计划（２０１３００００００９７）

ＰｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓｆｏｒｃａｒｒｉｅｒｓｏｆｔｈａｌａｓｓｅｍｉａａｎｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙＷａｎｇＪｉｎｇ，

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［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｐｒｏｖｉｄｅｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉａｇｎｏｓｉｓ（ＰＧＤ）ｆｏｒｔＷＯｃｏｕｐｌｅｓｃａｒｒｙｉｎｇ

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ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｌａｎ（２０１３００００００９７）

论著・万方数据生生垦堂堂篮堂盘查！！！！生；月第堕鲞第１期ＣｈｉｎＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ２０１６，Ｖ０１．３３，Ｎｏ．１

植入前遗传学诊断（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃ

ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ＰＧＤ）以及植入前遗传学筛查

（ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｅｎｅｔｉｃ

ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ＰＧＳ）为具有遗传风险的夫妇生育健康的后代提供了可能。自１９９０年首例ＰＧＤ试管婴儿成功妊娠以来，全球范围内已有超过７０００个ＰＧＤ婴儿出生【１］。ＰＧＤ的适应症主要是单基因病和染色体异常，前者主要采用聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术，而后者则一直采用荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）技术。由于第３天（ｄａｙ３，Ｄ３）的胚胎活检仅能吸取１～２个细胞用于诊断，而上述两种方法又彼此独立，因此对于既是单基因病携带者又有染色体异常的夫妇来说，将不得不活检出更多的胚胎细胞或进行二次活检用于诊断，这势必对胚胎造成伤害，降低成功率。近１０年间，伴随全基因组扩增（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＷＧＡ）技术及微阵列技术的发展，囊胚活检以及冷冻复苏技术的改进，在提供了充足的ＤＮＡ样本的同时，可以对每条染色体的非整倍性进行有效评估，使活检后的２～５个细胞经扩增后可以实现同时进行单基因突变分析和２３条染色体的非整倍性的检测［２巧］。我们应用单核苷酸多态性微阵列（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｍｉｃｒｏａｒｒａｙ，ＳＮＰｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）技术结合单基因突变检测对两对地中海贫血（简称地贫）携带伴染色体易位及反复流产的夫妇进行了ＰＧＤ及ＰＧＳ，并获得了可移植的胚胎，已有１例移植的并成功妊娠的病例，现报告如下。１对象与方法１．１对象（１）夫妇１：女方３０岁，怀孕１次，生育０次，流产１次，男方３２岁。双方地贫基因型均为１３４１／４２／１３Ａ，同时男方为ａ“２地贫携带者；女方染色体正常，男方染色体检查为４６，ＸＹ，ｉｎｖ（９）（ｐｌｌ；ｑ１３），ｔ（１１；２２）（ｑ２５；ｑ１３）。该夫妇在２０１１年孕９周时因胚胎停止发育行清官术，胎儿绒毛染色体核型为４６，ＸＹ，＋１１，一２２，后于２０１３年６月来我院要求行ＰＧＤ治疗。（２）夫妇２：女方３８岁，怀孕４次，生育０次，自然流产２次，一次巴氏水肿胎引产史。男方４ｌ岁。双方地贫基因型均为ｔ２ＳＥＡ／ｄ；双方染色体正常，于２０１４年６月来我院拟行ＰＧＤ＋ＰＧＳ治疗。１．２体外受精及囊胚活检采用本中心常规的黄体期长方案促排卵，卵母细胞单精子显微注射技术（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｓｐｅｒｍｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ＩＣＳＩ）授精，授精后１６～１８ｈ观察受精情况。取卵后第３天正常受精并发育到６细胞以上的胚胎继续进行囊胚培养，在第５天观察囊胚生长情况，对处于Ｇａｒｄｎｅｒ囊胚评分标准３期以上的胚胎进行活检，每次活检４～８个滋养外胚层细胞。活检后，将所有囊胚进行玻璃化冷冻；活检细胞放入５

ＦＬ的０．２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钾中用于诊断。

１．３采用单核苷酸多态性微阵列技术对胚胎染色体非整倍性进行检测应用ＲＥＬＩ—ｇＭｉｄ

Ｋｉｔ

（ＱＩＡＮＧＥＮ，德国）进行一个改良的全基因组扩增，３０℃扩增４ｈ。扩增产物ＤＮＡ取４“Ｌ进行第２轮扩增，两轮扩增后的产物继续按照说明书（Ｉｎｆｉｎｉｕｍ＠ＨＤＡｓｓａｙＳｕｐｅｒ，ＭａｎｕａｌＰｒｏｔｏｃ０１）操作进行，经过一系列的酶终止，变性后与ＨｕｍａｎＣｙｔｏＳＮＰ一１２芯片（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，美国）杂交，再经过染色、信号放大后进行芯片扫描，数据分析。１．４采用ＰＣＲ技术进行地中海贫血的诊断将改良的全基因组扩增产物ＤＮＡ稀释１／２后直接进行随后的ＰＣＲ反应。１３４１／４２反应总体积为５０肛Ｌ，包括全基因组扩增稀释产物５ＦＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液４．５扯Ｌ，５０

ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．５ｇＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ

１肚Ｌ，引

物ＰＣ０３，ＣＤ４１—４２（浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ）各２．０肚Ｌ，Ｔａｑ酶１．５Ｕ；１２－８ＥＡ反应总体积为５０肚Ｌ，包括：全基因组扩增稀释产物５ｔｔＬ，１０ＰＣＲ缓冲液４．５“Ｌ，５０ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２１．５“Ｌ，１０

ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１

ＦＬ，检测

ａ。８ＥＡ缺失型的引物Ｓ１、Ｓ２及Ｓ３（浓度为１０ｍｍｏｌ／Ｌ）各２．０“Ｌ，Ｔａｑ酶１．５Ｕ。经过３６轮扩增后，应用ＡＢｌ３１００Ａｖａｎｔ遗传分析仪对扩增结果进行检测。引物序列见表１。